Biz mükemmel laboratuvar desteği ve zebrafish bakımı için Fiona Foley ederim. Bu eser bir GW AHA predoctoral dostluk (11PRE5730027) ve HJY (R01HL66292) ve JDA (R01HL095690) için NHLBI hibe desteklenmiştir.

Sahne Özgü Zebra balığı embriyo Enjeksiyonlar genel bakış Bir hedef mRNA bağlamak ve bu transkript protein ekspresyonu bozmak antisens oligonükleotidler morfolino (MO), yaygın çalışmalar zebrafish 13,14 içinde (-kaybı fonksiyonu) gen devirme kullanılmaktadır. Gene Araçlar, LLC floresan mikroskopi kullanılarak enjekte edilen embriyolar MO tespit carboxyfluorescein (yeşil floresans yayar) veya lissamine (kırmızı floresans yayar) biriyle etiketlenmiş MOs sunmaktadır. Zebrafish farklı gelişim aşamalarında sarısı hücre içine MO enjekte ederek, bunun embriyo belirli bölümlerinde (Şekil 1A-F) MO sunmak mümkündür. MO 1-4 hücreli aşamasında (0-1 hpf) 32-hücreli aşamada 15 küresel knockdown kolaylaştırmak kadar devam sarısı ile bağlantıları aracılığıyla tüm embriyonik hücreler (Şekil 1A, D, D &#39;) girer arasındaki sarısı içine enjekte. MO midblast sırasında sarısı içine enjekteula aşamaları (2.5-3 hpf) özellikle DFC / KV hücre soyu 12, diğer çoğu embriyonik hücre soylarının girmeden sitoplazmik köprüler 8 ve demonte gen işlevi aracılığıyla olasılıkla DFCS (Şekil 1B, D, E &#39;) atalarıdır girebilirsiniz . Gen fonksiyonu DFC / KV ya da yumurta sarısı 12,16 de gerekli olup olmadığını test etmek için önemli bir kontrol olarak, kubbe sonra% 30 epiboly aşamaları (~ 4.5 HPF) arasına enjekte edilerek yumurta sarısı hücreye MO kısıtlamak için de mümkündür Tüm sitoplazmik köprüler (Şekil 1C, F, F &#39;) kapattık. Bu enjeksiyonlar DFC / KV hücreleri 17-24 gen fonksiyonunu analiz etmek için birlikte kullanılmıştır. KV akışkan akışı değerlendirmek için, floresan mikroboncukları 6-10 somite aşamaları (12-14 hpf) ve hemen ardından videomicroscopy (Şekil 1G-J) kullanılarak görüntülendi. Arasındaki KV lümen içine enjekte edilir Microbeads kırmızı veya yeşil floresan (veya her ikisi) yayarlar mevcuttur, bu yüzden farklı kullanmak mümkündürgörüntü floresan mikroboncukları ve MO için kanalları. 1. Morpholinos evresi özel Enjeksiyon (MO) Zebrafish embriyolar içine MO enjeksiyon daha önce 25,26 kanıtlanmıştır. Burada, kısaca sahne özgü MO enjeksiyonları açıklar. Tüm enjeksiyonlar sonrasında embriyolar bir Petri kabı aktarılır ve 28.5 de inkübe ° C <ol><li> Küresel MO enjeksiyonu: hemen döllenmeden sonra embriyolar toplayın ve bir enjeksiyon plaka içine yerleştirin. Bir kılcal iğne içine floresan MO yükleyin ve (örneğin, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-enjektör) bir mikroenjektör üzerine iğne monte. Iğne ucu kırın ve 25,26 açıklandığı gibi 1 nl bir hacme sahip bir enjeksiyon damla oluşturmak için enjeksiyon ayarları (basınç ve / veya zaman) ayarlamak. Diseksiyon stereomikroskopta kullanarak, (Şekil 1A) sarısı içine MO 1 nl enjekte Deneme başına ≥ 50 embriyo. 4 hücreli erkeklere göre enjeksiyonları tamamlamak için hızlı çalışıne. </li><li> DFC-hedefli MO enjeksiyon: 28.5 hemen döllenmeden sonra embriyolar toplayın ve inkübe ° C Embriyoların 256 hücreli evre (~ 2.5 hpf) ulaştığımda hızlı bir enjeksiyon plaka içine yerleştirin ve ardından (Şekil 256-hücre ve 1.000-hücre aşamaları arasındaki ≥ 100 embriyo sarısı içine floresan MO 1 nl enjekte 1B). </li><li> Yolk hedefli MO enjeksiyon: 28.5 hemen döllenme ve inkübe sonra embriyolar toplayın ° C. Kubbe evre (~ 4 hpf) At, bir enjeksiyon plaka embriyolar yüklemek ve ardından kubbe ve% 30 epiboly aşamaları (Şekil 1C) arasındaki ≥ 100 embriyo sarısı floresan MO 1 nl enjekte. </li></ol> 2. Analiz için Injected Embriyolar seçme <ol><li> MO embriyolar (8 hpf)% 75-epiboly aşamaya enjekte zaman, floresan MO dağıtımı için bir floresan mikroskop altında döllenmemiş ve ölü embriyolar kaldırmak ve sonra ekran canlı embriyolarının. Sonra allow embriyolar 28.5 geliştirmek için seçilen ° C. <ol><li> Küresel MO enjeksiyonları için, eşit, embriyonik hücreler (; Şekil 2A Şekil 1D) boyunca floresans dağıttık embriyolar seçin. </li><li> DFC-hedefli MO enjeksiyonları için, floresan MO sarısı boyunca yayılır ve dorsal blastoderm marjı (DFCS) (; Şekil 2B Şekil 1E) konsantre görünürse hangi embriyolar seçin. Bu aşamada, bu temel sarısında parlak floresan dolayı floresan DFCS görselleştirmek için zor olabilir. Floresan MO DFCS dışında embriyonik hücreler dahil ya kalır enjeksiyon yerinde (Şekil 2B) de araya getirdi hangi embriyoların dışlamak için dikkatli olun. </li><li> Sarısı hedefli MO enjeksiyonları için, MO floresans eşit sarısı dağılmış ve herhangi bir embriyonik hücreler (; Şekil 2C Şekil 1F) görülmez olduğu embriyolar seçin. Yine, floresan MO kalır hangi embriyolar kaldırmakenjeksiyon yerinde toplanır. </li></ol></li><li> 2-4-somite aşamaları (~ 11 hpf) arasında, ekran embriyoların yüksek büyütme kullanarak bir floresan mikroskop altında ikinci kez. Ardından seçilen embriyolar 28.5 geliştirmek için izin ° C <ol><li> Küresel MO enjeksiyonları için seçilen embriyolar MO floresans eşit KV ve tüm embriyonik hücreler (; Şekil 2E Şekil 1D &#39;) dağıtılır olmasını sağlamak. </li><li> DFC-hedefli MO enjeksiyonları için, dikkatlice MO sadece KV hücrelerinde floresans ve yumurta sarısı (Şekil 1E &#39;) sahip embriyolar seçin. 27, MO başarıyla KV hücreleri (Şekil 2F) teslim edildiği embriyoların belirlenmesinde yardımcı olabilir: örneğin Tg gibi KV hücrelerde ifade GFP (d2EGFP Dusp6) olduğunu Transgenik embriyolar. KV hücreler diğer embriyonik hücreler, MO floresan ile embriyolar atın. </li><li> Sarısı hedefli MO enjeksiyonlar için, sarısı (Şekil 1F &#39;münhasıran MO floresans sahip embriyolar seçin: Şekil2G). </li></ol></li></ol> 3. KV Akışkan Akışı Analiz için Montaj embriyolar <ol><li> Küresel MO KV asimetrik akış analiz etmek, MO veya sarısı hedefli MO enjekte edilen embriyolar DFC-hedefli, dikkatle dechorionate ~ keskin forseps ile 4-6 somite aşamaları (~ 11-12 hpf) arasında 20 embriyo. </li><li> 42 kuru bir banyo içinde bir sıvı olarak muhafaza edilmesi 5 ml tüpler içine ° C&#39;de% 1 düşük erime noktalı agaroz ve kısım 50 ml hazırlanması </li><li> Bir cam depresyon slayt (Birleşik Bilimsel Malzemeleri A.Ş.) bir embriyo transferi ve mümkün olduğunca fazla su çıkarmak. Sadece (çok agaroz sonraki görüntüleme ile karışabilir) embriyo örtecek kadar ılık% 1 düşük erime noktası agaroz ekleyerek embriyo hareketsiz. Agaroz katılaşır gibi, bu embriyo konumlandırmak için forseps kullanın KV (Şekil 1H) (dorsal görünümü) kadar karşı karşıya. Slayt başına bir embriyo ile 10 embriyolar monte edin. Sonraki adımda tüm enjeksiyonlar compl sağlamak için hızlı bir şekilde çalışın10 somite aşaması (14 hpf) tarafından eted. </li></ol> 4. KV içine Floresan mikroboncuk Enjeksiyon <ol><li> 1.5 ml Eppendorf tüp içinde steril su içinde 1:50 Multifuorescent 0.5 mikron çaplı Mikroküreler (Polysciences, Inc) Fluoresbrite seyreltin. </li><li> Tüp dokunarak iyice mikroboncuk 1:50 seyreltme karıştırın ve kılcal iğne içine 3 ul yükleyin. MO enjeksiyonları (örn. Harvard Apparatus PLI-90 Pico-enjektör) için kullanılan aynı mikroenjektör kullanarak, forseps ile iğne ucu kırmak ve olası en küçük (&lt;0.5 nl) enjeksiyonu damla oluşturmak için enjeksiyon ayarlarını. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, ilk monte embriyonun KV lümenli iğne hizalayın. Lümenine iğne takın ve boncuklar küçük hacimli (&lt;0.5 nl) (Şekil 1G) enjekte. Küçük bir iğne ucu ve küçük bir enjeksiyon hacmi zarar KV önlemek için kritik öneme sahiptir. </li><li> Tüm monte embriyolar enjekte edilir. Bir embriyo injecte olmuştur kezd, steril bir su damlası kurumasını önlemek için agaroz üzerine ilave edilebilir. Enjeksiyonlar sırasında, boncuklar sık ​​iğne açılış engel olacaktır. Bu iğne ucu yeniden kırma ve mikroenjeksiyon aparatı modüle basınç ya da zaman ayarı ile enjeksiyon hacmi ayarlanması gerekir. Bu enjeksiyon sırasında önemli ölçüde zarar için yeterli künt hale gelirse iğneyi değiştirin. </li><li> Ekranı dik floresan bileşik mikroskop (örneğin Zeiss AxioImager M1) altında boncuk başarılı teslimat için enjekte edilen embriyolar bir 20X objektif kullanılarak. İlk olarak, KV yapı aydınlık alan aydınlatma (Şekil 1J) kullanılarak bozulmamış olup olmadığını belirlemek ve daha sonra boncuklar gözlemlemek için floresan kullanır. Boncuk bugünü ve KV lümeni içinde hareket olduğu embriyolar seçin. KV hasar veya KV hiçbir yüzen boncuklar ile embriyolar atın. Bu KV özledim ve yakınlardaki doku veya altta yatan sarısı boncuk teslim etmek kolaydır. Montaj ano, başarısız olursa10 embriyolar ther ve enjeksiyon işlemi tekrarlayın. </li></ol> 5. KV Akışkanın Görselleştirme ve Analiz <ol><li> KV içinde boncuklar ile seçilen her embriyo için agaroz kapağı ve sonra 63X su daldırma objektif (Şekil 1I) kullanarak dik floresan bileşik mikroskop altında KV gözlemlemek için steril bir damla su ekleyin. Alternatif olarak, bir lamel olmayan su daldırma hedef ve / veya ters mikroskop ile birlikte kullanım için de uygulanabilir. </li><li> 10 sn film kaydetmek için (örn. Zeiss AxioCamHSm) mikroskop üzerine monte edilmiş yüksek hızlı kamera kullanın. Bir aydınlık veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) kanalı kullanılarak floresan kanal (yaklaşık 70 kare / sn) ve KV lümen kullanarak boncuklar hem kaydedin. </li><li> Zamanla tüm boncuk hareketleri görselleştirmek için, ImageJ yazılım (ücretsiz indir içine floresan boncuk film almak <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) birnd filmde tüm floresan sinyallerin maksimum projeksiyon oluşturun. ImageJ yılında maksimum projeksiyon gerçekleştirmek için, tıklayın &quot;Görüntü → Yığınları → Z projesi.&quot; &quot;Z projesi&quot; penceresinde, &quot;Max yoğunluğu&quot; projeksiyon tipi ile tüm dilimleri proje. Bu görüntü boncukları (Şekil 3A-B) görüntülü edildiği KV bir DIC görüntü üzerine yerleştirilebilir. </li><li> Bireysel boncuk hareketleri ImageJ kullanılarak izlenebilir. Bir eklenti (&quot;Manuel İzleme&quot;) indirilebilir <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> . ImageJ yılında floresan boncuk film açın ve Manuel İzleme işlevini çalıştırın. Manuel Takibi penceresinde, &quot;zaman aralıkları&quot; ve &quot;x / y kalibrasyon&quot; için &quot;show parametreleri&quot; ve giriş parametrelerini kontrol edin. Elle ≥ 50 kare için filmin odak düzlemi kalır boncuk seçin ve ardından embriyo başına ≥ 5 boncuk izleyebilirsiniz. Her boncuk yolu ve hızı inci tarafından oluşturulane yazılımı (Şekil 3 CD). </li></ol>

<ol>
	<li>Sutherland, M. J., Ware, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+left-right+asymmetry:+heterotaxy+and+situsinversus.">Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus.</a> Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).</li><li>Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kupffer's+vesicle+is+a+ciliated+organ+of+asymmetry+in+the+zebrafish+embryo+that+initiates+left-right+development+of+the+brain,+heart+and+gut.">Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut.</a> Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+KIF3B+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Essner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+function+for+embryonic+nodal+cilia.">Conserved function for embryonic nodal cilia.</a> Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).</li><li>Kramer-Zucker, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-driven+fluid+flow+in+the+zebrafish+pronephros,+brain+and+Kupffer's+vesicle+is+required+for+normal+organogenesis.">Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis.</a> Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).</li><li>Schweickert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-driven+leftward+flow+determines+laterality+in+Xenopus.">Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus.</a> Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).</li><li>Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+to+left-right+asymmetry.">The key to left-right asymmetry.</a> Cell. 127 (1), 27-32 (2006).</li><li>Cooper, M. S., D'Amico, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cluster+of+noninvolutingendocytic+cells+at+the+margin+of+the+zebrafish+blastoderm+marks+the+site+of+embryonic+shield+formation.">A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation.</a> Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).</li><li>Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+cell+fates+at+the+dorsal+margin+of+the+zebrafish+gastrula.">Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula.</a> Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).</li><li>Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+T-box+genes+play+independent+and+cooperative+roles+to+regulate+morphogenesis+of+ciliated+Kupffer's+vesicle+in+zebrafish.">Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).</li><li>Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+shaping+of+the+laterality+organ+in+zebrafish.">Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish.</a> Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).</li><li>Amack, J. D., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+box+transcription+factor+no+tail+in+ciliated+cells+controls+zebrafish+left-right+asymmetry.">The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry.</a> Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).</li><li>Kimmel, C. B., Law, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+of+zebrafish+blastomeres.+I.+Cleavage+pattern+and+cytoplasmic+bridges+between+cells.">Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells.</a> Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).</li><li>Arrington, C. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-embryonic+syndecan+2+regulates+organ+primordia+migration+and+fibrillogenesis+throughout+the+zebrafish+embryo.">Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo.</a> Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).</li><li>Caron, A., Xu, X., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+directly+regulates+Foxj1+expression+and+ciliogenesis+in+zebrafish+Kupffer's+vesicle.">Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle.</a> Development. 139 (3), 514-524 (2012).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+kinase+Rock2b+establishes+anteroposterior+asymmetry+of+the+ciliated+Kupffer's+vesicle+in+zebrafish.">The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 138 (1), 45-54 (2011).</li><li>Aamar, E., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+chordin+are+required+for+formation+of+Kupffer's+vesicle+and+left-right+asymmetry+determination+in+zebrafish.">Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).</li><li>Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signalling+during+embryo+development+regulates+cilia+length+in+diverse+epithelia.">FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia.</a> Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).</li><li>Schneider, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Nkd1+promotes+Dvl+degradation+and+is+required+for+left-right+patterning.">Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning.</a> Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).</li><li>Matsui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canopy1,+a+positive+feedback+regulator+of+FGF+signaling,+controls+progenitor+cell+clustering+during+Kupffer's+vesicle+organogenesis.">Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+alpha2+and+Ncx4a+regulate+zebrafish+left-right+patterning.">Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning.</a> Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).</li><li>Esguerra, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ttrap+is+an+essential+modulator+of+Smad3-dependent+Nodal+signaling+during+zebrafish+gastrulation+and+left-right+axis+determination.">Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination.</a> Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+fluxes+in+dorsal+forerunner+cells+antagonize+beta-catenin+and+alter+left-right+patterning.">Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning.</a> Development. 135 (1), 75-84 (2008).</li><li>Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdc14B+phosphatase+contributes+to+ciliogenesis+in+zebrafish.">The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (2), 291-302 (2011).</li><li>Matsui, T., Bessho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetry+in+zebrafish.">Left-right asymmetry in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

DFC / KV hücre soyu için MO hedeflemek için sahne özel enjeksiyonlar kullanarak gen fonksiyonu hücre özerklik incelemek ve küresel gen demonte neden pleiotropik fenotipleri önlemek için faydalı bir yaklaşımdır. Ancak, bu enjeksiyonları teknik olarak zor olabilir. 256 hücreli ve 1000-hücre aşamaları arasında MO enjeksiyon üç olası sonuçlara neden olabilir: 1) MO sarısı boyunca MO yayılır) enjeksiyon yerinde, 2 toplanır kalır ve DFC / KV hücreleri veya 3) MO girer sarısı boyunca yayılır v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Standart Kontrol tagged oligo-Lissamine </td><td> Gene Araçları, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Özel Rock2b morfolino oligo </td><td> Gene Araçları, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 mikron Mikroküreler </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 24054 </td></tr></tbody></table>

analysis of gene function and visualization of cilia-generated fluid flow in kupffer's vesicle

Örneğin kalp, beyin ve bağırsak gibi iç organların normal işlevleri 1 için kritik olan sol-sağ (LR) asimetriler gelişebilir. Hareketli kirpikler fare, kurbağa, ve zebrafish 2-6 gibi omurgalı embriyolarının, LR asimetrisi kurma katılmaktadırlar. Bu &#39;LR kirpikler&#39; organları 7 geliştirmek için LR desenlendirme bilgi sağlamak için düşünülmektedir sol lateral plaka mezoderm olarak kaskad sinyalizasyon korunmuş bir asimetrik Nodal (TGF-β süperailesi), tetiklemek için gerekli olan asimetrik akış oluşturur. Böylece, LR desenlendirme yatan mekanizmaları anlamak için, LR kirpikli hücrelerin organizasyonu, LR kirpikler ve sağlam asimetrik akış oluşturmak için yeteneklerini motilite ve uzunluğu düzenleyen genleri tanımlamak için gereklidir. Zebrafish embriyo olarak, LR kirpikler 2,4,5 Kupffer en vesikül (KV) yer almaktadır. KV monociliated epitel hücreleri, tek bir tabaka oluşurBir sıvı dolu lümen içine aldığınız. Fate eşleme KV epiboly aşamaları sırasında 8,9 dorsal blastoderm kenar az göç dorsal haberci hücreleri (DFCS) olarak bilinen ~ 20-30 bir grup hücre elde edilir olduğunu göstermiştir. Erken somite aşamalarında, DFCS küme ve kirpikli epitel hücreleri içine ayırt embriyonun 10,11 tailbud KV oluşturur. Belirlemek ve izlemek için yeteneği DFCS-kombinasyon optik şeffaflık ve zebrafish KV LR kirpikli hücreleri incelemek için mükemmel bir model sistem embriyo-make zebrafish hızla gelişmesi ile. İlginçtir, DFC / KV hücre soyunun ataları 4 saat sonrası fertilizasyon (HPF) ile sarısı hücresi arasındaki sitoplazmik köprüler kadar korumak, 2 hpf 8 sonrası yakın sarısı hücre ve diğer embriyonik hücreler arasında sitoplazmik köprüler oysa. Bu sitoplazmik köprü yararlanan biz morfolino oligonucle sunmak için bir sahne özgü enjeksiyon stratejisi geliştirdiDFCS ve devirme bu hücreler 12 bir hedef genin işlevi sadece otides (MO). Bu teknik, gen fonksiyonunun bir vahşi-tip embriyo bağlamında gelişen DFC / KV soy nakavt edildiği kimerik embriyolar oluşturur. KV asimetrik akış analiz etmek, biz KV lümeni ve videomicroscopy 2 kullanarak kayıt boncuk hareketin içine floresan mikroboncukları enjekte. Akışkan akışı kolaylıkla görülebilmektedir ve zamanla boncuk yerinden izleme ile belirlenebilir. Burada sahne özgü DFC hedefli gen Knockdown tekniği ve akış görselleştirmek için KV içine floresan mikroboncuk enjeksiyon kullanılarak, biz KV gelişimi ve işlevi sırasında belirli bir genin rolü karakterize için etkili bir yaklaşım sağlayan bir protokol mevcut.

Sahne özgü MO enjeksiyonlar embriyonun belirli bölümlerinde gen fonksiyonlarını analiz için kullanışlı bir yaklaşım sağlar. Şekil 1 akış görselleştirmek için floresan boncuk tanıtmak DFC / KV hücrelerinde ve nasıl gen işlevi sınamak için kullanılan enjeksiyon stratejilerinin bir akış şeması sunuyor KV. Başarılı bir aşama özgü enjekte edilen embriyolar floresan MO dağılımı Şekil 1B-F ve Şekil 2 &#39;de canlı embriyolar şematik ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle at JoVE.com

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer&#039;s Vesicle

Kupffer en veziküllü içinde Cilia üretilen sıvı akışı (KV) zebrafish embriyo sol-sağ desenlendirme denetler. Burada, KV hücrelerde özellikle gen fonksiyonu modüle bir teknik tarif. Ayrıca, sıvı akışını görselleştirmek için KV içine floresan boncuk sunmak için nasıl gösterir.

Kupffer en veziküllü Gen Fonksiyonu ve Cilia Oluşturulan Akışkanın Görselleştirme Analizi

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

analysis-gene-function-visualization-cilia-generated-fluid-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

14.7K Görüntüleme.  Upstate Medical University. Kupffer en veziküllü içinde Cilia üretilen sıvı akışı (KV) zebrafish embriyo sol-sağ desenlendirme denetler. Burada, KV hücrelerde özellikle gen fonksiyonu modüle bir teknik tarif. Ayrıca, sıvı akışını görselleştirmek için KV içine floresan boncuk sunmak için nasıl gösterir.

Video: Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Biyoloji

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as knockout mutants, wild accessions and advanced breeding populations, there is a rising burden for gene functional annotation. In this protocol, annotation of plant gene function using combined co-expression gene analysis, metabolomics and informatics is provided (Figure 1). This approach is based on the theory of using target genes of known function to allow the identification of non-annotated genes likely to be involved in a certain metabolic process, with the identification of target compounds via metabolomics. Strategies are put forward for applying this information on populations generated by both forward and reverse genetics approaches in spite of none of these are effortless. By corollary this approach can also be used as an approach to characterise unknown peaks representing new or specific secondary metabolites in the limited tissues, plant species or stress treatment, which is currently the important trial to understanding plant metabolism.

Combination of genomics, co-expression gene analysis and the identification of target compounds via metabolism give gene functional annotation.

Kombine Genomics metabolomiks ve Bilişim ile Bitki Gen Fonksiyonu ek açıklama

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Montaj ve &#39;Kayma Rings&#39; Uygulama: Orbital tek yönlü ve Periyodik Akışkan Akışının ve Kayma Stres için Yeni Bir Endotel Modeli

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

Sipunculus nudus Coelomic Sıvı için yerinde Hibridizasyon

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In Vitro E3 Ubiquitin Ligase fonksiyonunun analizi

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...