Yazarlar yardımı filme yönelik cerrahi filme ekipmanları, D. Kwon L. Belluscio teşekkür etmek istiyorum, video için K. Liu tüm arka plan müziği için yardım düzenleme ve K. MacLeod. KW İntramural Araştırma Programları NIMH Bölümü ve Genler, Biliş ve Psikoz Programı cömert desteğini onaylar. Bu çalışma NIMH İntramural Araştırma Programı (VC, YY, SMKW) ve intramural Klinik ve Biyolojik Araştırma Programı NIAAA Bölümü (VC, RMC, DML) tarafından desteklenmiştir.

Aşağıda açıklanan deneysel prosedürleri Ruh Sağlığı Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Ulusal Enstitüsü tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes göre idi. 1. Pre-operatif Hazırlama <ol><li> Aseptik cerrahi öncesi sıcak boncuk sterilizatör tüm araçları temizleyin,% 70 etanol ile cerrahi alan temiz ve temiz açılan bezler indirdi. Steril eldiven giyin. Ml / g, intraperitonially 0.02 verilen taze hazırlanmış% 1.2 avertin çözeltisi ile hayvan anestetize. Alternatif olarak, pasif bir çöpçü devreli bir burun konisi, indüksiyon için% 5, bakım için% 1.5, izofluran ile gaz ile uyutmak. Tam sedasyon sağlamak için kuyruk veya ayak tutam kullanarak anestezi seviyesini kontrol edin. </li><li> Steril oftalmik merhem ile hayvanın göz kapağı ve taze hazırlanmış deksametazon enjekte edilir (0.2 mg / kg) ve karprofen (5 mg / kg) subcutaneouslBeyin şişme ve iltihaplanmayı önlemek için 11 y. Kulakları arasındaki kafatası üzerinde saç Tıraş ve betadin fırçalayın ve% 70 etanol üç alternatif bezlerle cildi sterilize. </li><li> 37 hayvan seti altında bir su sirkülasyon ısıtma pedi ile, earbars olan bir stereotaksik cerrahi aşamasında hayvan monte ° C. Düzenli hayvanın anestezi düzeyleri kontrol etmek ve gerektiğinde orijinal anestezik dozu tamamlamak. </li><li> Alan uyuşturmak için kafa derisi deri altına% 0.5 marcain 200 ul enjekte edilir. Cilt kesilirken ve kafatası üzerinde flep kaldırmak. Periost çıkarın ve temiz pamuklu çubukla kurulayın. </li></ol> 2. Kronik Kranial Pencere Cerrahisi <ol><li> Yavaşça ilgi beyin bölgesi üzerinde 3-5 mm çaplı daire özetledi 0,5 mm çapak ile yüksek hızlı bir diş matkap kullanın. Düzenli, temiz pamuklu çubukla steril% 0.9 salin ve uzak net kemik tozu ile sondaj sahasını ıslak. Kemik kanamaları, g kullanınelfoam taşma kurulayın ve bunu durdurmak için beklemek steril serum fizyolojik ile çimlendirilmiş. </li><li> Son kemik tabakası ulaşıldığında, ince uçlu forseps ile kemik ada kaldırın ve çıkarın. Penceresinde bir kemik sütür geçerse kemiğin alt rafa Dura ekleri karşılaştı olabilir. Kemik kapak kaldırıldığında gibi Bu nazikçe kaldırılması gerekir. </li><li> Rulo yüzeyi temizlemek ve durdurmak için herhangi dural kanama için beklemek maruz dura üzerinde hafifçe jel köpük nemlendirilmiş Kritik adım:. Tüm dural kanama durana kadar devam etmeyin. Kraniyal pencere içine hapsolur Kan genellikle opak bir pencere açar. </li><li> Dura yukarıda dura kaldırarak, özellikle kalın olduğu ilgi bölgesi bir yer altında ise, gerekli olabilir. Bu durumda, hafifçe çok ince forseps ile aşağıdaki pia gelen dura ayırmak, ince forseps bir çift ile kaldırdı dura küçük bir kesi yapmak, sonra kesik kenarları kavrayın ve yavaşçadura bölünmüş. Dura ince fakat kuvvetli, yani dura sağlam kenarları ile beyin dilim için dikkatli olun. </li><li> Steril ACSF veya steril serum fizyolojik ile alanı durulayın. </li><li> . Dura veya pia üzerinde steril bir cam lamel (3-5 mm) Kritik adım Lay: çevreleyen kafatası eğrileri önemli ölçüde ise, dura veya pia bölgelerde lamel ile yakın temas yapmazdım yerleri doldurmak için Kwiksil 12 yapıştırıcı kullanın bilgidir olmayacaktır. </li><li> Elastomer yapıştırıcı ve cam lamel kenarlarını kaplayacak şekilde Siyanoakrilat jeli kullanın. . Herhangi bir siyanoakrilat jel beyin yüzeyine temas etmesine izin vermeyin: siyanoakrilat jel veya krazyglue ve diş çimento karışımı ile tüm maruz kafatası Kritik adım örtün. </li><li> Kafatasının karşı ucuna bir ısmarlama metal kafa sabitleme çubuğu gömün. </li><li> Ketoprofen bir İntraperitoneal enjeksiyon, 5 mg / kg fo sonra, sıcak bir iyileşme odasına hayvan Dönüşr ağrı yönetimi. İki gün daha operasyon sonrası için analjezik devam edin. </li><li> Ameliyat sonrası iyileşme iki hafta sonra, (indüksiyon için% 5, bakım için% 1.5) izofluran ile hayvan uyutmak, bir baş-fiksasyon çerçeve ile ısmarlama bir mikroskop aşamasında monte ve optik netlik için kraniyal penceresini kontrol edin mavi ışık ile aydınlatma altında. Beyin yüzeyi damar netlik kraniyal pencere kalitesi önemli bir göstergesidir. Damar kenarları keskin olarak tanımlanmış ise, pencereyi kullanılabilir olması muhtemeldir. Iki hafta ameliyat sonrası iyileşme süresi cerrahi kurtarmak için hayvan için yeterli zaman tanımak için tavsiye edilir. Kraniyal pencereler genellikle temizlemek ve iyileştirmek bu süre içinde, ve dura kafatası veya kalınlaşma büyütme penceresi kalitesini düşürür kadar ay ek hafta optik saydam kalır. </li></ol> 3. İki foton Mikroskobu, Taramalı Davranış Protokolü ve Lazer <ol><li> Net c Hayvanlarranial pencere çevresel bir uyarıcı maruz kalan ya da bir davranış antrenman tabi tutuldu ve daha sonra maksimal Arc-GFP tanımının o zaman sonra yansıma olacaktır. Bir davranış protokolü başlamadan önce, hayvan bazal Arc-GFP ifade düzeylerinde gün-gün varyasyonu azaltmak için tutarlı bir ev kafes ortamında tutulmalıdır. </li><li> Ilgi beyin bölgesine bağlı olarak, davranışsal eğitim veya çevresel stimülasyon paradigmaları başlayın. Örneğin, hayvanlar ardışık gün içinde farklı görsel ortamlara maruz kalabileceği ve görsel korteks 10 uyarıcı-özel yanıtlar tanımlamak için görsel uyarı sonrasında her gün görüntülenmiş. </li><li> Nöronlarda Arc-GFP floresan genellikle iki saat stimülasyonu sonrası doruk düzeyine ulaşır. Deneysel çizelgesi doruğa floresan seviyelerde nöronlarda Arc-GFP tanımının algılama için optimize edilebilir. </li><li> Davranışsal bir antrenmandan ya environmenta sonral uyarım tamamlandığında, (indüksiyonu için% 5, bakım için% 1.5), izofluran ile hayvan anestetize ve iki-fotonlu mikroskop altında kafa tespit çerçeve ile ısmarlama mikroskop aşamasında hayvan monte edin. </li><li> Hayvanın baş pozisyonu kafatası üzerinde implante metal çubuk kullanarak, sahne doğrudan bağlanan kafa fiksasyon çerçeveye sabitlenir. Isoflurane ve oksijen kesintisiz bir burun yoluyla fare için temin edilir. Vücut sıcaklığı bir ısıtma yastığı kullanılarak korunur. </li><li> Mikroskop dedektörler karanlık bir odada iki foton lazer tarama yaparak ortam ışığı korunur emin olun. Görüntüleme için bir 20x veya 25x (1.05 sayısal diyafram) suya daldırma objektifi kullanın. Birincisi, epi-floresan aydınlatma altında, gelecekte görüntü uyum için bir CCD kamera ile ilgi beyin bölgesi üzerinde yüzey damar desenleri bir görüntü kazanır. </li><li> 3-D görüntü yığını elde etmek için tarama iki foton lazer başlatın. Bir Olympus FV1000MPE çoklu foton mikroskop bizim kurulum kullanılmaktadır. Iki-fotonlu lazer uyarma dalga uzunluğu 920 nm &#39;de yer almaktadır, ve objektif yayılan lazer gücü yaklaşık 50 mW ayarlanır. Yayılan floresans eşzamanlı örneği yakın yerleştirilmiş harici iki kanallı photomutiplier algılama sistemi kullanılarak yeşil ve kırmızı kanalları (570 nm&#39;de dikroik ayna, 495-540 nm ve 570-625 nm bariyer filtreler), tespit edilmiştir. Doku oto-floresans kanal 13, 14 hem görünür, oysa Arc-GFP floresan sadece yeşil kanal görünür. </li><li> Tipik görüntü yığınlarını yaklaşık 320x320x100 mikron boyutları (en x boy x derinlik), 0,5 mikron / piksel yatay çözünürlük ve 3 mikron / piksel dikey çözünürlüğe sahip. </li><li> Görüntü yığını aldıktan sonra, onun ev kafesine hayvan dönün. Sonraki davranış ve görüntüleme oturuma kadar hayvan rahatsız etmeyin. Desir olarak gün boyunca davranış ve görüntüleme işlemi tekrarlayıned. Geri aynı görüntüleme konuma yönlendirmek için önceden edinilmiş beyin yüzeyinde kan damarı resmi kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Leslie, J. H., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+genes+as+mediators+of+neural+circuit+plasticity.">Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.</a> Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).</li><li>Flavell, S. W., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+linking+neuronal+activity+to+gene+expression+and+plasticity+of+the+nervous+system.">Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system.</a> Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).</li><li>Guzowski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+behaviorally+relevant+neural+circuits+with+immediate-early+gene+expression.">Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).</li><li>Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+circuits+and+systems+using+transgenic+reporters+of+neural+activity.">Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).</li><li>Lyford, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+growth+factor+and+activity-regulated+gene,+encodes+a+novel+cytoskeleton-associated+protein+that+is+enriched+in+neuronal+dendrites.">a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites.</a> Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).</li><li>Link, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+expression+of+an+immediate+early+gene+is+regulated+by+synaptic+activity.">Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).</li><li>Shepherd, J. D., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+Arc,+a+master+regulator+of+synaptic+plasticity.">New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity.</a> Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).</li><li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex.">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex.">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).</li><li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake.">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake.</a> Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Eichhoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+of+the+aging+and+diseased+brain.">In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).</li><li>Klohs, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+molecular+events+in+the+brain+by+noninvasive+imaging.+The+Neuroscientist:+a+review+journal+bringing+neurobiology.">Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology.</a> neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).</li><li>Chen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+and+artificial+dura+method+for+long-term+optical+imaging+in+the+monkey.">A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey.</a> Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).</li><li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li><li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

In vivo görüntüleme yöntemi burada açıklanan canlı hayvan birden fazla gün içinde nöronların aynı setleri Arc gen ekspresyon değişiklikleri tekrar muayene sağlar. Çeşitli davranışsal deneyimler yanıt bireysel nöronların nöral plastisite ile ilgili moleküler dinamiği hakkında bilgi edinmek için etkin ve çok yönlü bir yöntemdir. Böyle situ hibridizasyon ve immün olarak Standart histokimyasal yöntemler çözünürlüğü 3 tek hücreli ul...

<table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> FV1000 çoklu foton lazer tarama mikroskobu </td><td> Olimpos </td><td> FV1000MPE </td><td> Görüntüleme </td></tr><tr><td> Diseksiyon mikroskobu </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Cerrahlık </td></tr><tr><td> Fareler için Stereotaktik cerrahi aşamasında </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Cerrahlık </td></tr><tr><td> 20X veya 25X su immersiyon objektif </td><td> Olimpos </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Görüntüleme </td></tr><tr><td> Baş-fiksasyon çerçeve Mikroskop sahnede </td><td> Özel yapılmış </td><td> N / A </td><td> Görüntüleme </td></tr><tr><td> Güzel forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11251-20 </td><td> Cerrahlık </td></tr><tr><td> Diş matkap çapak </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 19007-05 </td><td> Cerrahlık </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12-bit </td><td> Görüntüleme </td></tr></tbody></table>

in vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons

Deneyimi yanıt olarak değiştirmek için beyin yeteneği sağlıklı beyin fonksiyonu için önemlidir ve bu süreçte anormallikler beyin bozuklukları 1,2 çeşitli katkıda. Iyi beyin devrelerinin bir hayvanın deneyimi tepki hangi mekanizmalar anlamak için canlı hayvan, zaman uzun bir süre boyunca, nöronların belirli bir set deneyimi bağımlı moleküler değişiklikleri izlemek için yeteneği gerektirir. Deneyim ve ilişkili nöral aktivitenin nöronlar 1,2 gen ekspresyon değişiklikleri tetiklemek için bilinen iken, yöntemlerin çoğu bu değişiklikleri algılamak için birden fazla gün içinde aynı nöronların tekrar gözlem izin vermez ya da bireysel nöronlar 3 gözlemlemek için yeterli çözünürlüğe sahip değilsiniz , 4. Burada, üzerinde bireysel kortikal nöronların deneyim-bağımlı gen ekspresyon değişiklikleri izlemek için genetik olarak kodlanmış floresan muhabiri olan iki foton mikroskopi vivo birleştiren bir yöntem tarif<html> gün-gün deneyim tabii. Köklü deneyimi bağımlı genlerden biri Aktivite regüle sitoskeletal ilişkili protein (Arc) 5,6 olduğunu. Arc transkripsiyon hızla ve son derece yoğunlaştırılmış nöronal aktivitenin 3 ile tetiklenen, ve onun protein ürünü glutamat reseptörleri ve uzun vadeli sinaptik plastisite 7 endositoz düzenler. Arc ifadesi yaygın 3 özel davranış katılan nöral devrelerin eşlemek için bir moleküler belirteç olarak kullanılmıştır. Bu çalışmaların çoğunda, Arc ifadesi sabit beyin bölümlerinde situ hibridizasyon veya immünohistokimya saptandı. Bu yöntemleri Arc ifade Arc ifade hücresel desenleri gün boyunca tekrarlanan ya da farklı deneyimler çoklu atakları ile değişebilir incelenmiştir değildi nasıl davranışsal deneyim, sonra eksitatör nöronların bir alt kümesi lokalize olduğunu göstermiştir rağmen. ntent &quot;&gt; in vivo iki foton mikroskopi canlı beyin 8,9 deneyim bağımlı hücresel değişiklikleri incelemek için güçlü bir yol sunar. iki foton mikroskopi ile canlı nöronlar Arc ifade muayene etkinleştirmek için, önceden oluşturulan bir knock- fare doğrultusunda bir GFP muhabiri endojen Arc organizatörü 10 kontrolü altında yerleştirilir. hangi Bu protokol cerrahi hazırlıkları ve canlı hayvan nöronal toplulukları deneyim-bağımlı Arc-GFP ifade desenleri izlemek için görüntüleme yöntemleri anlatılmaktadır. Bu yöntemde , kronik kranial pencereler ilk ilgi kortikal bölgeler üzerinde Arc-GFP fareler implante edildi. Bu hayvanlar daha sonra art arda birkaç gün boyunca istenilen davranış paradigmaları sonra iki foton mikroskopi ile görüntülenmiştir. Bu yöntem taşıyan hayvanların genel olarak uygulanabilir olabilir diğer floresan gazetecilere deneyim-bağımlı moleküler değişikliklere 4.

<html> Bu protokol canlı hayvanların bireysel kortikal nöronların deneyim-bağımlı moleküler değişiklikleri izlemek için bir yöntem açıklanır. Kronik bir kraniyal pencere ilk gen floresan muhabiri taşıyan bir fare bir ilgi kortikal bölge üzerinde oluşturulur. İki foton mikroskopi sonra tek tek nöronların davranışsal indüklenmiş moleküler değişiklikleri gözlemlemek ve birden fazla gün içinde nöronların aynı setleri tür değişiklikler (Şekil 1) izlemek için çeşitli ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons at JoVE.com

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir. An<em&gt; In vivo</em&gt; Iki foton görüntüleme yöntemi genetik olarak kodlanmış gazetecilere yoluyla bireysel kortikal nöronların bu tür moleküler değişiklikleri izleme sağlayan burada tanımlanmıştır.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

in-vivo-two-photon-imaging-experience-dependent-molecular-changes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

21.6K Görüntüleme.  National Institute of Mental Health. Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir. An In vivo Iki foton görüntüleme yöntemi genetik olarak kodlanmış gazetecilere yoluyla bireysel kortikal nöronların bu tür moleküler değişiklikleri izleme sağlayan burada tanımlanmıştır.

Video: In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo</emNöro-inflamasyon Modelleri murin mikroglia> Görüntüleme

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Nörobilim

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo Görüntüleme