저자 도움이 촬영을 위해 수술 촬영 장비, D. 권에 대한 L. Belluscio 감사드립니다, 비디오 K. 류는 모든 배경 음악에 대한 지원을, 편집 및 K. MacLeod. KW는 교내 연구 프로그램의 NIMH 부 및 유전자,인지와 정신증 프로그램의 관대 한 지원을 인정합니다. 이 작품은 NIMH 교내 연구 프로그램 (VC, YY, SMKW) 및 교내 임상 및 생물 연구 프로그램의 NIAAA 부 (VC, RMC, DML)에 의해 지원되었다.

아래에 설명 된 실험 절차는 정신 건강 동물 관리 및 사용위원회의 국립 연구소에 의해 승인 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 있었다. 1. 사전 수술 준비 <ol><li> 무균 수술 전에 뜨거운 구슬 살균기에있는 모든 도구를 청소, 70 %의 에탄올과 수술 사이트를 청소하고, 깨끗한 드롭 옷을 내려 놓았다. 멸균 장갑을 착용한다. ML / g, intraperitonially 0.02에서 주어진 신선하게 조리 된 1.2 % avertin 솔루션과 동물을 마취. 또한, 수동 청소 회로와 코 콘, 유도 5 %, 유지 보수를 위해 1.5 %를 통해 isoflurane 가스로 마취. 전체 진정 작용을 보장하기 위해 꼬리 나 발가락 pinches을 사용하여 마취 수준을 확인합니다. </li><li> 멸균 안과 연고과 동물의 눈을 감아, 그리고 신선한 dexamethasone를 삽입 (0.2 밀리그램 / kg)와 carprofen (5 밀리그램 / kg) subcutaneousl뇌 붓기와 염증 11 방지하기 위해 Y. 귀 사이의 머리 위에 머리를 면도하고, betadine 스크럽과 70 % 에탄올 세 번갈아 면봉으로 피부를 소독. </li><li> 37 동물 세트 아래의 물 순환 가열 패드와 함께 earbars와 stereotaxic 수술 단계에있는 동물을 마운트 ° C. 정기적으로 동물의 마취 수준을 확인하고 필요에 따라 원래 마취 복용을 보완. </li><li> 지역을 마비하기 위해 두피 피부에서 0.5 % Marcaine 200 μl를 삽입. 피부를 절개하고 두개골을 통해 피부 플랩을 제거합니다. 골막을 제거하고 깨끗한 면봉으로 지역을 건조. </li></ol> 2. 만성 두개골의 창 수술 <ol><li> 부드럽게 관심의 두뇌 영역을 통해 3~5밀리미터 직경의 원을 설명하기 위해 0.5 mm 버와 고속 치과 드릴을 사용합니다. 주기적으로 깨끗한 면봉과 멸균 0.9 % 생리와 치워 뼈 먼지와 시추 사이트를 젖었 어. 뼈가 흘러요 경우, g를 사용하여elfoam는 출혈을 가릴하고 중지 기다리 멸균 식염수에 presoaked. </li><li> 마지막 뼈 층에 도달하면 미세 스쳐 집게로 뼈 섬을 들고 제거합니다. 창 뼈 봉합을 교차하는 경우 뼈의 아래 칸에 경질 된 첨부 파일이 발생 될 수 있습니다. 뼈 플랩가 해제되기 때문에 이러한 부드럽게 제거해야합니다. </li><li> 롤은 표면을 청소하고 중지 할 경질 막 출혈을 기다리 노출 경질을 통해 부드럽게 젤 거품을 moistened 중요 단계를 :. 모든 경질 막 출혈이 멈췄을 때까지 진행하지 않습니다. 두개골 창 안에 갇혀된다 혈액은 일반적으로 불투명 한 창으로 연결됩니다. </li><li> 경질이 위의 경질을 제거, 특히 두꺼운 곳 관심 지역 위치에 따라 경우 필요할 수 있습니다. 이 경우 부드럽게 아주 좋아 포셉과 함께 아래의 피아에서 경질을 분리, 고급 집게 또 한 쌍의와 함께 해제 경질에 작은 절개를 한 후 절단 가장자리를 파악하고 부드럽게경질을 분할. 경질은 얇은하지만 강한이기 때문에, 경질의 손상 가장자리로 뇌를 갈라하지 마십시오. </li><li> 멸균 ACSF 또는 멸균 식염수 지역을 씻어. </li><li> . 경질 또는 PIA를 통해 멸균 유리 coverslip (3-5mm) 중요 단계를 놓는다 : 주변 두개골 곡선 크게하면, 경질 또는 PIA는 지역의 coverslip과 긴밀한 접촉을하지 않을 공간을 채워 Kwiksil 12 접착제를 사용하여 그는 이미징되지 않습니다. </li><li> 탄성 접착제와 유리 coverslip의 가장자리를 충당하기 위해 시아 노 아세틸렌 젤을 사용합니다. . 모든 시아 노 아세틸렌 젤은 뇌 표면을 만지지을 허용하지 않음 : 시아 노 아세틸렌 젤, 또는 krazyglue 및 치과 시멘트 혼합물로 전체 노출 두개골 중요 단계를 다룹니다. </li><li> 두개골의 반대편에서 주문 제작 금속 헤드 고정 막대를 삽입 할 수 있습니다. </li><li> 케토 프로 펜의 intraperitonial 주입, 5 밀리그램 / kg, 강한 후, 따뜻한 복구 챔버에 동물을 반환R 통증 관리. 두 일 후 operatively에 대한 진통제를 계속합니다. </li><li> 수술 회복 2 주 후, (유도 5 %, 유지 보수를 위해 1.5 %) isoflurane과 동물을 마취, 머리 고정 프레임과 주문 제작 현미경 단계에 마운트, 광학 명확성을 위해 두개의 창을 확인 푸른 빛 조명 아래에서. 뇌 표면 혈관 투명도는 두개의 창 품질 높은 나타내는 것입니다. 혈관 가장자리가 급격하게 정의하는 경우, 창은 사용 가능한이 될 수 있습니다. 두 주 후 수술 회복 시간은 수술에서 회복 할 수있는 동물에 대한 충분한 시간을 허용하는 것이 좋습니다. 두개골의 창은 일반적으로 삭제하고 개선이 기간 동안, 그리고 경질의 두개골이나 증점 안정제의 regrowth는 윈도우의 품질을 떨어까지 개월 추가 주 동안 광학 투명 남아 있습니다. </li></ol> 3. 투 광자 현미경을 스캔 행동 프로토콜 및 레이저 <ol><li> 맑은 c와 동물ranial 창은 환경 자극에 노출 또는 행동 교육 세션을 받게 한 후 최대 아크 - GFP 표현시 이후 이미징 될 것입니다. 행동 프로토콜을 시작하기 전에 동물이 기준 아크 - GFP 표현 수준에 매일 변화를 최소화 할 수있는 일관성있는 가정 케이지 환경에서 보관해야합니다. </li><li> 관심 뇌 지역에 따라, 행동 훈련 또는 환경 적 자극의 패러다임을 시작합니다. 예를 들어, 동물 연속 일 동안 다른 시각적 환경에 노출 될 수 있으며, 시각 피질에 10 자극 - 특정 응답을 식별 할 시각적 인 자극 후 매일 이미징. </li><li> 뉴런의 아크 - GFP 형광은 일반적으로 이시간 자극 후 전성기 수준에 도달합니다. 실험 타임 라인은 자신의 최대 형광 수준에서 뉴런의 아크 - GFP 표현의 검출을 용이하도록 최적화 할 수 있습니다. </li><li> 행동 교육 세션이나 environmenta 후난 자극이 완료 (유도 5 %, 유지 보수를 위해 1.5 %) isoflurane과 동물을 마취하고 두 광자 현미경으로 머리 고정 프레임으로 맞춤 제작 현미경 단계에있는 동물을 탑재합니다. </li><li> 동물의 머리 위치는 두개골에 이식 금속 막대를 사용하여 스테이지에 직접 연결 헤드 고정 프레임에 고정되어 있습니다. Isoflurane과 산소가 계속 코 콘을 통해 마우스에 공급하고 있습니다. 바디 온도는 가열 패드를 사용하여 유지됩니다. </li><li> 현미경 감지기는 어두운 방에있는 두 광자 레이저 스캔을 실시하여 주변 광으로부터 보호되어 있는지 확인합니다. 이미징을위한 20x 또는 25x (1.05 수치 조리개) 물 침지 렌즈를 사용합니다. 첫째, 에피 형광 조명 아래, 미래의 이미지 정렬을위한 CCD 카메라와 관심의 뇌 영역에 걸쳐 표면 혈관 패턴의 이미지를 획득. </li><li> 3-D 이미지 스택을 얻기 위해 스캔 두 광자 레이저를 시작합니다. 올림푸스 FV1000MPE 다중 광자 현미경은 우리의 설정에 사용됩니다. 두 광자 레이저의 여기 파장 길이는 920 nm의에서 설정하고, 목표에서 방출 레이저의 힘은 약 50 MW로 설정되어 있습니다. 방출 형광 동시에 표본에 가까운 위치 외부 2 채널 photomutiplier 탐지 시스템을 사용하여 녹색과 빨간색 채널 (570 nm의에서 이색 성 거울, 495-540 nm의 및 570-625 nm의에서 차단 필터)에서 검출된다. 조직 자동 형광이 채널 13, 14 모두에 나타납니다 반면, 아크 - GFP 형광 만 녹색 채널에 나타납니다. </li><li> 일반적인 이미지 스택은 약 320x320x100 μm의 크기 (너비 x 길이 X 깊이), 0.5 μm / 픽셀의 수평 해상도, 3 μm / 픽셀의 수직 해상도를 갖추고 있습니다. </li><li> 이미지 스택을 인수 후에는 홈 케이지에 동물을 반환합니다. 다음 행동 및 이미징 세션까지 동물을 방해하지 마십시오. desir으로 일에 걸쳐 행동 및 이미징 절차를 반복거구나. 다시 같은 이미징 위치에 방향에 이전에 취득한 뇌 표면 혈관 이미지를 사용합니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

생체 이미징 방법에 여기에 설명 된 라이브 동물의 여러 일 동안 뉴런의 같은 세트에서 아크 유전자 발현의 변화 반복 시험을 할 수 있습니다. 그것은 다양한 행동 경험에 대한 응답에서 개별 뉴런의 신경 소성 관련 분자 역학에 대한 정보를 얻을 수있는 효율적이고 다양한 방법입니다. 이러한 현장 하이브리드 화 및 immunostaining의 표준 histochemical 방법은 해상도 3 개의 싱글 셀 달성하지만, 여러 일 동안 동일한 뉴런의 유전자 발현 변화를 추적 할 수있는 능력이 부족 할 수 있습니다. Bioluminescence, 자기 공명, 또는 핵 이미징 방법은 해당 기자 15 일까지 같은 동물에 유전자 발현 변경 사항을 추적하지만, 개별 뉴런의 표현 수준을 구별 할 공간 해상도가 부족 할 수 있습니다. 따라서, 유전자 발현 변화를 측정하는 다른 기존의 방법은 공간 해상도와 시간적 cov 모두 일치 할 수 없습니다이미징 방법의 erage 여기 설명했다. 이 절차에서 중요한 단계는 두개의 창 수술입니다. 그것은 염증을 일으킬와 두개골 Windows의 선명도를 줄일 수 유리 coverslip, 아래의 뇌 떠나는 혈액에 외상을 방지하기 위해 추가주의 수행해야합니다. 창의 가장자리에서 두개골의 경질 또는 regrowth의 증점 안정제 더 이미징을 방지 할 때까지 잘 진행 두개골 수술를 들어, 창은 몇 주 동안 맑은 상태로 유지됩니다. 필요한 경우 두개의 창 광학 명확성을 높이기 위해, 쥐와 원숭이 16,17에 만성 광학 이미징 실험 완료되었습니다로 경질은 제거 할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 두 개의 광자 현미경 기술에 대한 제한은 영상 깊이입니다. 높은 품질의 이미지를 얻을 수되는 최대 영상 깊이 두개골 창 선명도, 현미경 설정, fluoresc의 밝기에 따라 달라집니다<html> 다닐 기자. 아크 - GFP 마우스의 경우, 우리는 일반적으로 pial 표면 아래 300 μm에 이미지까지. 깊은 뇌 영역에서 유전자 발현 변화를 조사하기 위해 형광 microendoscopy는 종래의 두 광자 현미경 18에 깊이 한계를 극복하기 위해 적용될 수 있습니다. 생체 이미징 방식이로 결정 유전자 발현 변경에 대한 잠재적 인 혼란 요인은 행동 성능이나 아크 - GFP의 유도를 방해 할 수 있습니다 두개골 수술이나 마취로부터 느린 효과가 포함되어 있습니다. 그것은 먼저 고정 뇌 섹션에서 특정 경험에 대한 응답으로 아크 - GFP 활성화의 전체 범위를 확인하고 생체에 두 광자 현미경을 사용하여 반복 영상으로 관찰 범위에이를 비교하는 것이 중요합니다. 수술 회복 기간과 반복 이미징 간격 그런 다음 아크 - GFP 활성화에 대한 수술과 마취의 가능성 부작용을 최소화하기 위해 조정할 수 있습니다. _content &quot;&gt; 이미징 방법은 여기에 설명 된 다른 경험 규제 유전자 4 형광 기자를 들고 유전자 변형 마우스에 일반적으로 적용이 될 수 있습니다. 또한, 그것은 형광 표시 뉴런 8,9의 형태를 강조 표시하거나, 표시와 결합 할 수 있습니다 그게 그 뉴런 19, 20의 neurophysiological 활동을 반영합니다.이 더 응용 프로그램이 각각의 뉴런의 경험에 의존하는 분자의 변화로보다 포괄적 인 뷰를 제공하고, 일반 동안 뉴런에서 개최하거나 구조와 기능 수정에 이러한 분자 변경 사항을 관계 할 수 있습니다 병적 인 경험.

<table border="1"><tbody><tr><td> 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> FV1000 다중 광자 레이저 스캐닝 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> FV1000MPE </td><td> 영상 </td></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> 외과 </td></tr><tr><td> 마우스 Stereotaxis 수술 단계 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 726335 </td><td> 외과 </td></tr><tr><td> 20X 또는 25X 물 침지 목표 </td><td> 하늘 </td><td> XLPL25XWMP </td><td> 영상 </td></tr><tr><td> 머리 고정 프레임과 현미경 단계 </td><td> 사용자가 만든 </td><td> N / A </td><td> 영상 </td></tr><tr><td> 좋은 포셉 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11251-20 </td><td> 외과 </td></tr><tr><td> 치과 드릴 버 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 19007-05 </td><td> 외과 </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12 비트 </td><td> 영상 </td></tr></tbody></table>

in vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons

경험에 대한 응답으로 변경하는 뇌의 능력은 건강한 뇌 기능을 위해 필수적이며,이 과정에서 이상이 뇌 장애의 1,2의 다양한에 기여합니다. 더 나은 뇌 회로가 동물의 경험에 반응하는하여 메커니즘을 이해하려면 라이브 동물에 시간의 연장 기간 동안, 뉴런의 주어진 집합의 경험에 의존하는 분자 변경 사항을 모니터링 할 수있는 능력이 필요합니다. 경험 및 관련 신경 활동이 뉴런 1,2에서 유전자 발현 변화를 실행하는 것으로 알려져 있습니다하지만, 방법의 대부분은 이러한 변화를 감지하는 것은 여러 일 동안 동일한 뉴런의 반복 관찰을 허용하지 않습니다 또는 개별 뉴런에게 3를 관찰하기에 충분한 해상도를 필요가 없습니다 4. 여기, 우리는 위에 각각의 대뇌 피질의 뉴런의 경험에 의존 유전자 발현 변경 사항을 추적하기 위해 유전자 코드 형광 기자와 두 광자 현미경 생체에 결합하는 방법을 설명<html> 일상의 경험 코스입니다. 잘 구축 된 경험에 의존 유전자 중 하나는 활동 - 규제 cytoskeletal 관련 단백질 (아크) 5,6입니다. 아크의 전사는 빠른 속도이며, 매우 심화 neuronal 활동에 3 유도, 그리고 단백질 제품은 glutamate 수용체 및 장기 시냅스 소성 7 endocytosis를 규정한다. 아크의 표현이 널리 3 특정 행동에 참여 neuronal 회로를지도에 분자 마커로 사용되었습니다. 이러한 연구의 대부분에서 아크 표현식은 고정 뇌 섹션에 원위치 하이브리드 또는 immunohistochemistry에 의해 발견되었다. 이러한 방법은 아크의 표현은 아크 식의 세포 패턴 일 동안 반복적으로 또는 독특한 경험을 여러 에피소드와 함께 변경 될 수는 조사되지 않은 방법을 행동 경험, 이후 흥분성의 뉴런의 일부에 번역 된 것으로 밝혀 있지만. ntent는 &quot;&gt; 생체에서 두 광자 현미경은 살아있는 뇌 8,9의 경험에 의존 세포 변경 사항을 검토 할 수있는 강력한 방법을 제공합니다. 두 광자 현미경에 의해 라이브 뉴런의 아크 식의 검사를 활성화하려면, 우리는 이전에 생성 한 가짜을 마우스 줄에 GFP 기자가 내생 아크 프로모터 (10)의 통제하에 배치됩니다.하는이 프로토콜은 수술 준비와 라이브 동물의 neuronal ensembles 경험에 의존 아크 - GFP 표현 패턴을 추적 이미징 절차를 설명합니다.이 방법에서는 , 만성 두개골 창가 먼저 관심 대뇌 피질의 지역으로 아크 - GFP 마우스에 이식되었다. 그 동물 한 후 반복적으로 며칠 동안의 원하는 행동 패러다임 후 두 광자 현미경에 의해 이미징했다.이 방법은 수행 동물 일반적으로 적용 할 수 있습니다 다른 형광 기자 경험에 의존 분자 변경 4.

<html> 이 프로토콜은 살아있는 동물에서 개별적으로 대뇌 피질의 뉴런의 경험에 의존하는 분자 변경 사항을 추적 할 수있는 방법을 설명합니다. 만성 두개골 창이 먼저 유전자 표현의 형광 기자를 들고 마우스에 관심이 대뇌 피질의 영역으로 생성됩니다. 두 광자 현미경 그런 다음 각각의 뉴런에 behaviorally 유도 분자 변화를 관찰하고 여러 일 동안 뉴런의 같은 세트에서의 변경 (그림 1)을 추적 할 다양한 행동 패러다임와 결합 할 수 있습니다. 아크 - GFP 마우스에서 아크 유전자 발현의 경험에 의존 변경 사항은 안정적이 프로토콜을 사용하여 여러 일에 대한 개별 대뇌 피질의 뉴런에 이미징 할 수 있습니다. 유전자 변형 아크-GFP 노크 인 마우스는 즉시 초기 유전자 아크의 내생 발기인 (그림 2)의 통제하에 (d2EGFP, 단백질 반감기 약 2 시간) 불안정 녹색 형광 단백질을 표현합니다. ontent &quot;만성 두개골 창을 설명&gt; 과거 프로토콜은 성공적인 두개골 창 수술에게 11 실시 중요한 단계를 설명합니다.이 프로토콜은 이러한 Windows가 두개골 봉합 위에 지어진 때 명확한 광학 창을 얻을 가능성을 증가하는 필요한 경우 경질을 제거에 추가 지침을 제공합니다 (단계 2.4 참조). 두개골 창 수술에서 회복 한 후, 동물은 주문 제작 헤드 고정 프레임 무대에 마운트되어 있습니다. 그림 3은 headbar과 두 광자 이미징 중에 사용 머리 고정 프레임을 도시한다. 일관성있는 두 광자 현미경 이미징 단계 위치 및 설정을 유지하는 것은 이전에 이미징 뇌 영역에 반환 할 때 이미지의 일상 재배치를 촉진하고, 여러 동물 같은 날 (그림 4)에 이미징 할 때 실험 효율성을 증가 할 것이다. 행동 훈련 또는 환경 적 자극하는 동안, 그것은 것이 좋습니다집 동물에 단독으로, 그리고 환경 일관성 홈 케이지 위치에, 배경 아크 - GFP 활성화 수준의 일상적인 변동 (그림 1)을 최소화합니다. 안정적이고 깨끗한 두개골 창 중요한 기호는 에피 형광등 조명 아래에서 혈관의 선명 패턴입니다. 이 혈관 패턴은 영상의 여러 일 (그림 5)에서 크게 변경되지해야합니다. 그림 6은 기본 홈 케이지 상태 (A) 미만의 새로운 모터 행동 (B)의 성능 후 정면 대뇌 피질의 뉴런에 아크 - GFP의 표현 패턴을 보여줍니다. 같은 동물에서 동일한 뇌 영역에서 레이어 II / III 대뇌 피질의 뉴런이 안정적으로 이미징 할 수 있으며, 동일한 뉴런은 영상의 여러 일 동안 식별 할 수 있어야합니다. 이 뉴런의 샘플 수백 3-D 이미지 스택을 수집하는 것이 일반적입니다. 신경 세포의 가장자리는 이미지의 전역 샤프하고 명확하게해야합니다압정으로 고정. 빨간색 채널의 조직 자동 형광은 또한 윈도우 투명도의 색인을 제공합니다. 이미징 영역 일 이상 크게 murkier되는 경우, 두개의 창 품질 가능성이 악화됩니다. 전형적인 두개골 창은 적어도 일주일 광학 맑은 상태로 유지됩니다. 개월까지 몇 주 후, 경질의 두개골 창 증점 안정제의 가장자리에서 두개골의 regrowth는 결국 더 이미징 실험을 방지 할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/50148/50148fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 실험 단계를 요약 스키마. 동물 준비 단계 동안, 두개골 창 수술은 아크 - GFP 마우스에 수행됩니다. 동물들은 홈 케이지의 수술에서 회복하기 위해 2 주 정도 주어집니다. 두개골 윈도우의 투명도 그 다음 에피 형광 현미경을 사용하여 확인합니다. 창문 이미지에 대한 준비가되어 있다면, 동물 단독으로 조용한 환경 일관성에 자리 잡고 있습니다홈 케이지 환경, 어디로부터는 실험 타임 라인 단계를 시작할 수 있습니다. 행동 자극 프로토콜과 이미징 간격은 일반적으로 이시간 활성화 한 후 발생 전성기 형광에서 아크-GFP를 검색 맞게 될 수 있습니다. 행동 자극이 완료되면, 동물은 anesthetized이며, 관심있는 대뇌 피질의 영역은 두 광자 현미경을 사용하여 두개의 창문을 통해 이미징 있습니다. 동물은 다음 홈 케이지에 반환됩니다. 행동 및 이미징 세션이 원하는대로 일에 걸쳐 반복 될 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/50148/50148fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 아크 - GFP의 건설을 도시 다이어그램 똑 된 마우스 선하는 유전자 인코딩이 녹색 형광 단백질은 즉시 초기 유전자 아크의 코딩 부분을 대체 불안정. 마우스의 변형에서 GFP 표현은 내생 아크 프로모터의 제어 아래에 있습니다. 이 다이어그램은에 따라 다시 그려야합니다참조 10 설명입니다. <img src="/files/ftp_upload/50148/50148fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 도식과 두 광자 이미징에 사용되는 헤드 고정 설정의 크기. headbar의 고체 반이 두개골의 뒷면 (제 2.8)에 접착하고 있으며, 나사 구멍과 끝 프레임에 anesthetized 동물의 머리를 연결하는 데 사용됩니다. 머리 고정 프레임은 나사 두 기둥 꼭대기에 장착 된 얇은 금속 플레이트로 구성되어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/50148/50148fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 아크 - GFP 마우스 이미징을위한 두 광자 현미경 설정을 스캔 레이저의 예. 헤드 고정 프레임과 25x 물 침지 렌즈, 난방 패드 및 사용자 지정 현미경 단계를 확인합니다. 여기에 표시 anesthetized 아크-GFP 마우스는 생체 이미징에 대한 준비가되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/50148/50148fig5.jpg" alt="그림 5" /&gt; 그림 5. 시간이 지남에 따라 혈관 패턴의 명확성과 안정성을 보여주는 여러 일 이상 만성 두개골 창에서 뇌 표면 혈관의 이미지. 뇌 표면은 푸른 빛으로 조명되었고, 이미지는 현미경에 장착 CCD 카메라에 의해 25x 물 침지 렌즈를 통해 촬영 된 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/50148/50148fig6.jpg" alt="그림 6" /> 두 개의 서로 다른 행동 경험을 한 후에 마우스의 정면 대뇌 피질의 뉴런의 아크 - GFP 표현 패턴 그림 6. 생체에 두 - 광자 이미지. (A) 마우스는 첫날에 이미징 전에 홈 케이지에 머물 렀습니다. (B) 마우스는 두번째 날에 이미징 전에 새 모터 동작을 수행했습니다. 같은 대뇌 피질 영역의 형광 이미지를 동시에 녹색과 붉은 색 채널에 인수되었다. 조직 autofluorescence 모두 채널에 출연 반면, GFP 형광 만 녹색 채널에 나타났다. Detectio빨간색과 초록색 두 채널 모두에서 조직 자동 형광 수준이 같은 수치를 갖고 있었는데, 이러한 매개 변수가 실험을 통해 유지되었다 있도록 N 매개 변수가 설정되었습니다. 빨간색 채널 신호 그런 다음 오프라인 분석하는 동안 광범위한 대역 조직 autofluorescence를 제거하는 녹색 채널 신호에서 차감되었습니다. 3-D 이미지 스택 두께가 18 μm에서 생성되는 녹색 형광 신호를 아크 - GFP 식의 세포 패턴 하향식보기를 제공하기 위해, 수평 비행기에 최대 강도에 의해 예상되었습니다. 규모 바, 30 μm.

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In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

뉴런의 경험에 의존하는 분자 변화는 행동 문제에 대한 응답으로 적응하는 뇌의 기능에 필수적입니다.<em&gt; 생체 내</em&gt; 두 광자 이미징 방법은 유전자 인코딩 기자를 통해 개인의 대뇌 피질의 뉴런 이러한 분자 변화의 추적을 허용하는 여기에 설명되어 있습니다.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

21.5K 조회수.  National Institute of Mental Health. 뉴런의 경험에 의존하는 분자 변화는 행동 문제에 대한 응답으로 적응하는 뇌의 기능에 필수적입니다. 생체 내 두 광자 이미징 방법은 유전자 인코딩 기자를 통해 개인의 대뇌 피질의 뉴런 이러한 분자 변화의 추적을 허용하는 여기에 설명되어 있습니다.

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Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

연구

신경과학

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...