Los autores desean agradecer a L. Belluscio para equipo de cirugía rodaje, D. Kwon para la filmación de asistencia, K. Liu para edición de vídeo asistencia y MacLeod K. para toda la música de fondo. KW reconoce el generoso apoyo de la División de Programas de Investigación NIMH intramuros y los Genes, cognición y el Programa de Psicosis. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural del NIMH (VC, YY, SMKW) y la División de NIAAA Programa Intramural investigación clínica y biológica (VC, RMC, DML).

Los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Instituto Nacional de la Atención Mental de Salud Animal y el empleo y estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Pre-operatorio Preparación <ol><li> Limpie todas las herramientas en un esterilizador caliente cordón antes de la cirugía aséptica, limpie el sitio de la cirugía con un 70% de etanol, y poner paños limpios gota. Use guantes estériles. Se anestesia el animal recién preparada con 1,2% de solución de avertina, dado a 0,02 ml / g, intraperitonealmente. Alternativamente, anestesiar con gas isoflurano a través de un cono nasal, 5% para la inducción, 1,5% para el mantenimiento, con un circuito eliminador pasiva. Compruebe el nivel de anestesia con pizcas de cola o del pie para asegurarse de sedación total. </li><li> Cubrir los ojos del animal con ungüento oftálmico estéril, y se inyecta dexametasona recién preparada (0,2 mg / kg) y carprofeno (5 mg / kg) subcutaneously para prevenir la hinchazón y la inflamación cerebral 11. Afeitar el pelo sobre el cráneo entre las orejas, y esterilizar la piel con matorrales betadine y tres hisopos alternos de 70% de etanol. </li><li> Montar el animal en una etapa de la cirugía estereotáxica con earbars, con una almohadilla de calentamiento de agua de circulación a continuación el conjunto de los animales a 37 ° C. Compruebe regularmente los niveles de anestesia del animal, así como complementar el original dosis de anestesia según sea necesario. </li><li> Inyectar 200 l de bupivacaína al 0,5% debajo de la piel del cuero cabelludo para adormecer el área. Incisión de la piel y eliminar el colgajo de piel sobre el cráneo. Retire el periostio y seque el área con hisopos de algodón limpios. </li></ol> 2. Cirugía crónica ventana craneal <ol><li> Use un taladro dental de alta velocidad con una fresa de 0,5 mm para delinear suavemente un círculo 3-5 mm de diámetro en la región cerebral de interés. Periódicamente humedecer el sitio de perforación con polvo estéril al 0,9% de solución salina y hueso clara distancia con hisopos de algodón limpios. Si los sangrados de hueso, utilizar gelfoam remojados previamente con solución salina estéril para secar la hemorragia y esperar a que se detenga. </li><li> Cuando la capa de hueso se llega al último, levante y retire la isla hueso con unas pinzas de punta fina. Dura adjuntos a la plataforma inferior del hueso se pueden encontrar si la ventana cruza una sutura ósea. Éstos se deben retirar suavemente el colgajo óseo se levanta. </li><li> Rollo de espuma de gel humedecido suavemente sobre la duramadre expuesta a limpiar su superficie y esperar a que el sangrado dural dejar paso crítico:. No continúe hasta que la hemorragia se ha detenido dural. La sangre que queda atrapada en el interior de la ventana craneal usualmente lleva a una ventana opaca. </li><li> Si la región de interés está bajo un lugar donde la duramadre es particularmente gruesa, la eliminación de la duramadre por encima puede ser necesario. Si este es el caso, separar suavemente la dura desde la pia abajo con pinzas muy finas, realizar una pequeña incisión en la duramadre levantado con otro par de pinzas finas, a continuación, sujete los bordes de corte y suavementedividir la duramadre. La duramadre es delgada pero fuerte, así que ten cuidado de no cortar el cerebro con los bordes intactos de la duramadre. </li><li> Enjuague el área con ACSF estéril o solución salina estéril. </li><li> Coloque un cubreobjetos de vidrio estéril (3-5 mm) a lo largo de la duramadre o pia paso crítico:. Si las curvas del cráneo que rodean de manera significativa, el uso Kwiksil adhesivo 12 para llenar los espacios donde la dura o pia no hacen contacto con el cubreobjetos en regiones que no se va a examinar. </li><li> El uso de gel de cianoacrilato para cubrir el adhesivo elastómero y los bordes del cubreobjetos de vidrio. Cubrir el cráneo expuesto con toda gel de cianoacrilato, o una mezcla de cemento y krazyglue dental paso crítico:. No permita que el gel de cianoacrilato para tocar la superficie del cerebro. </li><li> Insertar una medida cabeza de metal barra de sujeción en el extremo opuesto del cráneo. </li><li> Volver al animal a una cámara de recuperación caliente, después de una inyección intraperitoneal de ketoprofeno, 5 mg / kg, for el manejo del dolor. Continuar con el analgésico durante dos días más después de la operación. </li><li> Después de dos semanas de recuperación post-operatoria, anestesiar al animal con isoflurano (5% para la inducción, 1,5% para mantenimiento), montarlo en una platina del microscopio a medida con un marco de fijación de cabeza, y marque la ventana craneal para la claridad óptica bajo iluminación con luz azul. Superficie hematoencefálica claridad recipiente es altamente indicativo de la calidad de ventana craneal. Si los bordes de los vasos sanguíneos están claramente definidos, la ventana es probable que sea utilizable. El dos semanas después de la operación el tiempo de recuperación se recomienda para permitir tiempo suficiente para que el animal pueda recuperarse de la cirugía. Ventanas craneales típicamente limpiar y mejorar durante este tiempo, y siendo ópticamente transparente para semanas adicionales a mes hasta rebrote de cráneo o engrosamiento de la duramadre degrada la calidad de ventana. </li></ol> 3. Protocolo del comportamiento y de escaneo láser de dos fotones microscopía <ol><li> Los animales con clara cventanas ranial estará expuesto a un estímulo ambiental o sometidos a una sesión de entrenamiento del comportamiento, y luego fotografiada después en el momento de máxima Arc-GFP expresión. Antes de iniciar un protocolo de comportamiento, el animal deberá ser mantenido en un entorno doméstico jaula consistente para minimizar día a día variación en los niveles basales de expresión de GFP-Arc. </li><li> Comenzar el entrenamiento conductual o paradigmas ambientales de estimulación, en función de la región cerebral de interés. Por ejemplo, los animales pueden ser expuestos a diferentes ambientes visuales en días consecutivos, y fotografiado cada día después de la estimulación visual para identificar específicos de estímulo-respuesta en la corteza visual 10. </li><li> Arc-GFP fluorescencia en las neuronas normalmente alcanza su nivel máximo dos horas después de la estimulación. La línea de tiempo experimental puede ser optimizado para facilitar la detección de la expresión Arc-GFP en las neuronas en sus niveles pico de fluorescencia. </li><li> Después de una sesión de entrenamiento conductual o environmental estimulación se completa, anestesiar al animal con isoflurano (5% para la inducción, 1,5% para el mantenimiento) y montar el animal en la platina del microscopio a medida con bastidor de la cabeza de fijación bajo el microscopio de dos fotones. </li><li> La posición de la cabeza del animal se fija al bastidor de la cabeza de fijación que se conecta directamente a la etapa, con la barra de metal implantado en el cráneo. El isoflurano y oxígeno se suministran continuamente al ratón a través de un cono nasal. La temperatura corporal se mantiene utilizando una almohadilla térmica. </li><li> Asegúrese de que los detectores de microscopio están protegidos de la luz ambiente mediante la realización de dos fotones de láser de barrido en una habitación oscura. Utilice un objetivo de inmersión en agua 20x o 25x (1,05 apertura numérica) para formación de imágenes. En primer lugar, en virtud de epi-fluorescencia iluminación, adquirir una imagen de los patrones de los vasos sanguíneos superficiales más de la región del cerebro de interés con una cámara CCD para la alineación de la imagen en el futuro. </li><li> Iniciar la de dos fotones de exploración por láser para adquirir una pila de imágenes en 3-D. Una Olympus FV1000MPE multi-fotón microscopio se utiliza en nuestra configuración. La excitación de longitud de onda del láser de dos fotones se ha fijado en 920 nm, y la potencia del láser emitido desde el objetivo se fija a aproximadamente 50 mW. Fluorescencia emitida se detecta simultáneamente en los canales verde y rojo (espejo dicroico a 570 nm, filtros de barrera a 495-540 nm y 570-625 nm), utilizando un externo de dos canales sistema de detección photomutiplier colocado cerca de la muestra. Arc-GFP fluorescencia sólo aparece en el canal verde, mientras que el tejido auto-fluorescencia aparece tanto en los canales 13, 14. </li><li> Pilas típicas imágenes tienen dimensiones de aproximadamente 320x320x100 m (largo x ancho x profundidad), una resolución horizontal de 0,5 m / pixel, y una resolución vertical de 3 m / pixel. </li><li> Después de adquirir la pila de imágenes, devolver el animal a su jaula. No moleste a los animales hasta la próxima sesión de imágenes y de comportamiento. Repita el comportamiento y el procedimiento de imagen a través de días como desired. Utilice la superficie previamente adquirido hematoencefálica imagen buque para orientar a la ubicación de imágenes iguales. </li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex.">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).</li><li>Dombeck, D. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li><li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de obtención de imágenes in vivo descrito aquí permite el examen repetido de los cambios de expresión génica en Arco los mismos conjuntos de neuronas durante varios días en el animal vivo. Es un método eficiente y versátil para obtener información acerca de la plasticidad neuronal relacionada-dinámica molecular en neuronas individuales en respuesta a diversas experiencias de comportamiento. Estándar métodos histoquímicos tales como la hibridación in situ y la inmunotinción se ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> FV1000 multi-fotón microscopio de barrido láser </td><td> Olimpo </td><td> FV1000MPE </td><td> Proyección de imagen </td></tr><tr><td> Disección microscopio </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Cirugía </td></tr><tr><td> Stereotaxis etapa de la cirugía para los ratones </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Cirugía </td></tr><tr><td> 20X o 25X objetivo de inmersión en agua </td><td> Olimpo </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Proyección de imagen </td></tr><tr><td> Microscopio etapa con marco de fijación de cabeza </td><td> Una medida que se </td><td> N / A </td><td> Proyección de imagen </td></tr><tr><td> Pinzas finas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11251-20 </td><td> Cirugía </td></tr><tr><td> Dental taladro fresa </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 19007-05 </td><td> Cirugía </td></tr><tr><td> CCD cámara </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12-bit </td><td> Proyección de imagen </td></tr></tbody></table>

in vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons

La capacidad del cerebro para cambiar en respuesta a la experiencia es esencial para la función cerebral sano, y anormalidades en este proceso de contribuir a una variedad de trastornos del cerebro 1,2. Para comprender mejor los mecanismos por los que los circuitos cerebrales reaccionan a la experiencia de un animal requiere la capacidad de monitorizar los cambios moleculares que dependen de la experiencia en un determinado conjunto de neuronas, durante un período de tiempo prolongado, en el animal vivo. Si bien la experiencia y de la actividad neural asociada se sabe para accionar los cambios de expresión génica en neuronas 1,2, la mayoría de los métodos para detectar tales cambios no permiten la observación repetida de las mismas neuronas más de varios días o no tienen suficiente resolución para observar las neuronas individuales 3 , 4. Aquí se describe un método que combina en dos fotones microscopía in vivo con un reportero codificado genéticamente fluorescente para rastrear dependientes experiencia-cambios de expresión génica en las neuronas corticales individuales sobre la<html> curso de la experiencia día a día. Uno de los bien establecidos que dependen de la experiencia de los genes es la actividad regulada citoesqueleto proteínas asociadas (Arc) 5,6. La transcripción de Arco es rápida y altamente inducida por la intensificación de la actividad neuronal 3, y su producto de proteína regula la endocitosis de los receptores de glutamato y largo plazo plasticidad sináptica 7. La expresión de Arco ha sido ampliamente utilizado como un marcador molecular para asignar circuitos neuronales implicados en comportamientos específicos 3. En la mayoría de estos estudios, la expresión Arc se detectó mediante hibridación in situ o inmunohistoquímica en secciones de cerebro fijos. Aunque estos métodos reveló que la expresión de Arco fue localizado en un subconjunto de neuronas excitadoras después de experiencia de comportamiento, cómo los patrones celulares de expresión Arc podría cambiar con episodios múltiples de experiencias repetidas o distintivo más días no fue investigado. ntent &quot;&gt; In vivo de dos fotones microscopía ofrece una poderosa manera de examinar la experiencia-dependientes cambios celulares en el cerebro de los vivos 8,9. Para habilitar el examen de expresión Arco en neuronas vivas por microscopía de dos fotones, hemos generado previamente un golpe- en línea de ratón en el que un reportero GFP se pone bajo el control del promotor endógeno del arco 10. Este protocolo describe las preparaciones quirúrgicas y procedimientos de formación de imágenes para el seguimiento dependientes experiencia-GFP Arc-patrones de expresión en conjuntos neuronales en el animal vivo. En este método , crónicas ventanas craneales se implantaron primero en ratones GFP Arc-en las regiones corticales de interés. Estos animales fueron entonces repetidamente fotografiada por dos fotones microscopía después de paradigmas de comportamiento deseadas en el transcurso de varios días. Este método puede ser aplicable en general a animales portadores otros reporteros fluorescentes de experiencia-dependientes cambios moleculares 4.

<html> Este protocolo describe un método para rastrear dependientes experiencia-cambios moleculares en las neuronas corticales individuales en los animales vivos. Una ventana craneal crónica se crea por primera vez en una región cortical de interés en un ratón que lleva un indicador fluorescente de la expresión génica. Microscopía de dos fotones se puede acoplar con varios paradigmas de comportamiento para observar su comportamiento inducidos cambios moleculares en las neuronas individuales y rastrear tales cambi...

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In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

La experiencia-dependientes cambios moleculares en las neuronas son esenciales para la capacidad del cerebro para adaptarse en respuesta a problemas de comportamiento. Un<em&gt; In vivo</em&gt; De dos fotones método de formación de imágenes se describe aquí que permite el seguimiento de dichos cambios moleculares en las neuronas corticales individuales a través de la prensa codificados genéticamente.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

in-vivo-two-photon-imaging-experience-dependent-molecular-changes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

21.5K vistas.  National Institute of Mental Health. La experiencia-dependientes cambios moleculares en las neuronas son esenciales para la capacidad del cerebro para adaptarse en respuesta a problemas de comportamiento. Un In vivo De dos fotones método de formación de imágenes se describe aquí que permite el seguimiento de dichos cambios moleculares en las neuronas corticales individuales a través de la prensa codificados genéticamente.

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

En Vivo De dos fotones microscopía de terminaciones nerviosas individuales en la piel

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

La cuantificación de la actina filamentosa (F-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...