Bu çalışma, Ulusal Multipl Skleroz tarafından desteklenen Toplum hibe uyarlanmış ve / veya Davalos ve ark. J Neurosci Yöntemleri yeniden basıldı KA Şekiller ve filmler için DD ve NIH / NINDS hibe NS051470 NS052189 ve NS066361 RG4595A1 / T. Mar 30 2008, Elsevier gelen izni ile 169 (1) :1-7 2008 Telif Hakkı,.

1. Bina spinal stabilizasyon cihazı <ol><li> Narishige STS-Compact Omurilik Kelepçeleri ve Narishige MA-6N kafa tutma adaptörü sipariş edin. </li><li> Özel tasarım ve spinal kolon ve kuyruk kenetli iken hayvan kafası desteklenen böylece paslanmaz çelik taban plakası iki Narishige parçaları hizada tutun. Tüm cihaz genellikle indirdi mikroskop sahnede mikroskop mercek altında uygun gerektiğini aklınızdan çıkarmayın. </li></ol> 2. Hayvan cerrahisi <ol><li> Pre-ısı mikroskop bir hava ısıtma cihazı ile oda ve 37 bakımını ° C </li><li> Hayvan tartılır ve 100 mg ketamin, 15 mg ksilizin ve steril koşullar altında% 0.9 NaCl çözeltisi seyreltilir kg vücut ağırlığı başına 2.5 mg acepromazine, anestezik karışımı yapmak. </li><li> Anestezik karışımı (KXA) intraperitoneal olarak enjekte edilerek hayvan anestezisi. Düzenli ayak pinching boyunca derin anestezi sağlamak için yapılmalıdırdeney. Saatlik ya da gerektiği gibi orijinal yarım doz ile tamamlayın. </li><li> Cerrahi işlem yaparken termal destek sağlamak amacıyla küçük bir hayvan ısıtma yastığı kullanın. </li><li> Korneal dehidratasyon ve zarar görmesini önlemek için yapay gözyaşı merhemi gözleri üzerine uygulayın. </li><li> Kırparak bir cihaz ile ve daha sonra keskin bir bıçak ile kesi etrafındaki alanı tamamen saç kaldırmak için öncelikle hayvanın arka Tıraş. </li><li> Tıraş edilen kıllar çıkarın ve alkol ped ile traş cilt yüzeyi dezenfekte edin. </li><li> İstenen spinal seviye (torakal vertebra burada görüldüğü gibi) cilt üzerinde küçük bir (~ 1.5 cm) uzunlamasına insizyon yapın. </li><li> Dikkatli bir şekilde geri çekilmeden derialtı bağ dokusu tarafından arka kas Açığa. </li><li> Dikkatlice istenilen düzeyde paravertebral kaslar omurga ayırın. Her spinöz sürecinin her iki tarafın kasları ayırmak ve sonra bir müstakil kasları kazımak mümkün olan en az kesiler gerçekleştirinlaminer yüzeyinden yolu. </li><li> Laminektomi hemen rostral ve kaudal silinecektir lamina seçin ve omurganın her iki tarafta spinal kelepçeler için giriş siteler hazırlamak. Dikkatle kelepçeler eklenecektir dört cepleri yapmak kas dokusunun yerini. </li><li> Lamina altında kavisli ucu künt makas omurilik dokunmadan güvenli girilmesine olanak ucu düz dişli forseps ile omuriliğe kaldırın. Yavaş yavaş, sonra bir tarafta diğer tarafta kemik kesme ve laminektomi gerçekleştirin. </li><li> Bir pamuklu bir bez kullanın ya da ufak bir kanama sınırlamak için kesiler yanında hazır kesilmiş küçük gelfoam emilebilir jelatin sünger parçaları yerleştirin. Gerekirse daha fazla kanama kontrolü için küçük bir gemi cauterizer kullanın. Doku yıkama önceden ısıtılmış steril yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) kullanın. </li></ol> 3. In vivo görüntüleme için omuriliğe ve hazırlık Stabilizasyonu <ol><li> Plac<html> e spinal stabilizasyon cihazın taban plakası üzerinde bir yükseklik pad üzerinde hayvan ve kafa kafa tutan adaptörü güvenli. </li><li> STS-bir cihaz, laminektomi (Şekil 1) yan önceden hazırlanmış ceplerinde hayvan ön-arka eksen boyunca spinal kelepçeler yerleştirin . Iki kelepçeler ~ 45 bir açıyla yerleştirilmiş olmalıdır ° maruz spinal kord (Şekil 1) üzerinde bir suya daldırma lens düşürmek için yeterli alana izin hayvan postero-kaudal eksenine göre. </li><li> STS-bir cihaz hayvanın vücut görüntüleme deneyleri (Şekil 1) süresi için yükseklik pad çıkarılmasından sonra havada asılı böylece kuyruk dibinde üçüncü kelepçe yerleştirin. </li><li> ACSF spinal kord bakım ve in vivo görüntüleme için bu çözüm mikroskop objektif daldırma kolaylaştırmak için Gelseal (Amersham Biosciences Corp) maruz omurilik etrafındaki küçük bir kuyu oluşturun. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4 fare omurilik in vivo görüntüleme iki foton mikroskobu ile <ol><li> Önceden ısıtılmış odasının içine mikroskop kapsayan spinal stabilizasyon cihaz hayvan aktarın ve alçaltılmış bir mikroskop sahnede düz mercek altında (Şekil 1) laminektomi yerleştirerek sabitleyin. </li><li> ACSF çözüm, spinal kelepçeler veya Gelseal temas edip etmediğini emin olmak için dikkatli bir şekilde bir su-immersion lens indirin. </li><li> Ilgi alanlarını belirlemek ve bunun üzerine odaklanmak Epifloresans kullanın. Lazer tarama modunu açın ve in vivo görüntüleme fluorophores için filtreler görüntülü doku mevcut uygun iki foton lazer dalgaboyu, dichroics ve bandpass kullanarak gerçekleştirmek. </li></ol> 5. Tekrarlanan görüntüleme ve ameliyat sonrası bakım <ol><li> Görüntüleme deneyler sonunda, spinal stabilizasyon cihazdan fare kaldırmak ve Gelseal laminektomi etrafındaki alanı dikkatlice silin.Alan iyi temizleyin. </li><li> Geri Yükleme ve laminektomi üzerinde sırt kasları sütür. </li><li> Restore cilt üzerinde laminektomi ve sütür, betadin çubukla. </li><li> Bir besin ve hidrasyon ek olarak 1 ml Laktatlı Ringers çözüm (Baxter Healthcare), subkutan yanı sıra analjezik tedavisi (0,1 mg / kg buprenorfin) sağlayın. </li><li> Antiseptik tedavi intraperitoneal (fare başına düşen 0.03 ml,% 2.27 enrofloxacin enjektabl antibakteriyel solüsyon) yönetin. </li><li> Anesteziden tam iyileşme kadar bir ısıtma pedi üzerinde hayvan ve daha sonra tek tek bu ev. </li><li> Ameliyat sonrası 2-3 gün için cerrahi ve analjezik tedavinin her 8-12 saat sonra ilk 3-5 gün için günlük antiseptik yönetim tekrarlayın. Normal davranış ve tam bir iyileşme sağlamak için günlük hayvan izleyin. </li><li> Aynı laminektomi ile yeniden görüntüleme, sütüre cilt ve kasların yeniden ve bölüm 2 açıklanan adımları yineleyin - 4. </li><li> Önceki teknolojik sıçramalarda yeniden bulmakPLC `e sürekli olarak kan damarsal daha önce 10 açıklandığı gibi bir harita kullanarak alanı görüntülenmiş. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları Bütün hayvan prosedürleri Kaliforniya, San Francisco Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından belirlenen kurallar çerçevesinde ve Federal düzenlemelere göre. Spinal stabilizasyon aygıtı ve bir fare, bir mikroskop objektif altında cihaz üzerinde konumlandırma gösteren şematik bir resmi Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Hayvanın gövdesinin altındaki solunum hareketleri için yeterli oda izin verme omurilik in vivo görüntüleme istikrarlı sağlar. Onu Cx3cr1 GFP / + transgenik fareler 18 spinal kord in vivo olarak görüntülenmiş oldu gibi Şekil 2 mikroglia ve damarsal arasında yakın bir ilişki gösterir , mikroglia endojen GFP ile etiketlenmiş. Şekil 3 yakalanma gösterir örneklerspinal aksonlar floresan protein (YFP-H hat 3) ve mikroglia (Cx3cr1 GFP / + fareler) ifade farelerde aynı omurilik alanları yapıldı gibi in vivo görüntüleme. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" /> Şekil 1: İki foton mikroskopi kullanılarak in vivo görüntüleme için fare omurganın Sabitleme (A) ısmarlama çelik taban plakası STS-Narishige kompakt omurilik kelepçeler ve MA-6N Narishige destek ve hizalamak için kullanılır . Burada görüldüğü gibi kafa adaptörü tutarak (B), spinal istikrar cihaz üzerinde bir KXA anestezi ile anestezi yetişkin transgenik farelerin doğru yerleştirilmesi . Eklemek spinal kelepçeler hemen rostrally ve kaudal laminektomi ve açık omurilik dokusu yerleşimi gösterir. &lt;img alt = &quot;Şekil 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2 anestezi farelerin omurilik yüksek yoğunluk mikroglia hücreleri ve kan damarları in vivo görüntüleme. Öngörülen ama olmayan hizalı z yığınlarının (A), kan damarları ile yakın bir CX3CR1 GFP / + fare (kırmızı, rodamin dekstran iv enjeksiyon ile etiketli) spinal kord çok yoğun GFP pozitif mikroglia (yeşil) . (B) Yüksek büyütmeli görüntü (A) tek bir mikrogliyal hücre geminin etrafında genişletilmiş süreçleri ve omurilik parankimi doğru bir kan damarı duvarına bağlı olarak etiketlenmiş. Ölçek barlar, 10μm. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" /> Şekil 3 farklı günlerde taşındı ve anestezi farelerin omurilik reimaged aynı aksonal segment ve mikroglia in vivo görüntüleme de Tekrarlanan. (A) YFP-lab<html> 0 ve 5 gün eLED aksonlar. (B). Çevrelerindeki aynı vasküler yapılar ve mikroglia hücreleri, 0 ve 1 gün Cx3cr1 GFP / + farelerin omurilik in vivo olarak görüntülenmiş . Ölçek barlar, 10μm. Movie 1 Temsilcisi timelapse dizisi in vivo fare omurilik satın aldı. Bu dizi detay ince floresan yapıları ile yoğun nüfuslu bir doku içinde zamanla damar (kırmızı, rodamin dekstran iv enjeksiyon ile etiketli) mikroglia Proses dinamiği (yeşil) ve bunların etkileşimleri gösterir. Ham görüntüleri sadece arka plan gürültü, parlaklık ve kontrast için düzeltilmiş ve timelapse film görüntü hizalama olmadan, ortalama veya bireysel uçakları z seçim z projelendirme sıralı olarak elde edilen görüntü yığınları tarafından inşa edilmiştir. Kan damarları mikroglia görüntü olarak z uçaklar benzer bir aralık içerisinde. Z düzlemi derinliği: 38 mm.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov &quot;&gt; film izlemek için buraya tıklayın. Film 2 Timelapse dizisi, tek bir z-düzlemi düzeyinde görüntüleme yöntemi ham istikrar göstermektedir . KXA anestezi altında spinal stabilizasyon cihaz yerleştirilir CX3CR1 GFP / + fareler omurilikte aynı tek z-düzlemi Hızlı satın alma, daha hızlı bir tarama 1 kare / s hızında ardışık çerçeve arasındaki minimum görüntü deplasman gösteriyor farenin solunum hızı. Küçük kalan deplasman muhtemelen kalp atışı nedeniyle <a alt="Movie 2" href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">film izlemek için buraya tıklayın.</a>

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).</li><li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system.">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li><li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex.">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420, 812-816 (2002).</li><li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons.">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385, 161-165 (1997).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca2++signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo.">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li><li>Christie, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+arrest+of+individual+senile+plaques+in+a+model+of+Alzheimer's+disease+observed+by+in+vivo+multiphoton+microscopy.">Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy.</a> J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).</li><li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches.">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2++signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).</li><li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion.">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat. Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Kim, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Lindquist, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo.">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).</li><li>Schwickert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure.">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Istikrarlı ve tekrarlayan yoğun nüfuslu iki foton mikroskopi kullanılarak anestezi farelerin omurilik floresan hücresel yapılarının in vivo görüntüleme yöntemi, burada açıklanan sağlar. Yakalanan istikrar, ısmarlama bir spinal stabilizasyon cihaz ve solunum kaynaklı hareket artifakı azaltan bir anestezik rejiminin bir sonucudur. Spinal stabilizasyon aygıtı fare gövdesinin altında nefes alan sağlar ve piyasada mevcut spinal kelepçeler ve baş montaj parçası (Şekil 1) kullanıl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Rodamin B dekstran </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> Seyreltilmiş 70 kDa ACSF (3% w / v) </td></tr><tr><td> Ketamin HCl </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC No: 67457-001-10 </td><td> Enjektabl, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> Lloyd Labs </td><td> ADA No: 139-236 </td><td> Xylazine enjektabl 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> ADA No: 117-531 </td><td> Enjektabl, 10mg/ml </td></tr><tr><td> Suni gözyaşları merhem </td><td> Anka kuşu ilaç </td><td> NDC No: 57319-760 25 </td><td> Yağlayıcı </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Balıkçı </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> McPherson-Westcott Makas </td><td> Dünya Hassas Enstrümanlar </td><td> 555500S </td><td> Eğri, künt ucu makas </td></tr><tr><td> Düz Forseps </td><td> Dünya Hassas Enstrümanlar </td><td> 555047FT </td><td> Dişli ucu forseps </td></tr><tr><td> Küçük damar dağlamak </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharma, Pfizer Inc. </td><td> Mikser Mill MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Kompakt spinal kord kelepçeler </td><td> Narishige </td><td> STS-A </td><td></td></tr><tr><td> Kafa tutan Adaptörü </td><td> Narishige </td><td> MA-6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences Corp. </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Laktatlı Ringers </td><td> Baxter Healthcare &lt;/ Td&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc </td><td> NDC No: 12.496 - 6757-1 </td><td> Buprenorfin enjektabl </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> ADA 140-913 </td><td> Enrofloxacin, antibakteriyel enjektabl % 2.27 (20ml) </td></tr><tr><td> Isıtma pedi - Büyük </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy

Farelerde genetik olarak belirli bir hücre türleri 2-3 in vivo 4-7 sayısız dokuların fizyolojik ve patolojik süreçler hakkındaki bilgimizi önemli ölçüde genişletti floresan proteinleri ifade etmek için tasarlanmış iki foton mikroskopi 1 kullanarak in vivo görüntüleme. Merkezi sinir sistemi (MSS) çalışmalarda, bir roman bolluk ve altında nöronlar, astrositler, mikroglia, hücrelerin davranışları hakkında sık sık beklenmedik bulgular üretti beyinde in vivo görüntüleme alanında geniş bir uygulama olmamıştır fizyolojik veya patolojik koşullar 8-17. Ancak, çoğunlukla teknik komplikasyonlar yaşayan fare omurilik çalışmalarda in vivo görüntüleme uygulanması sınırlıdır. Özellikle omurilik, akciğer ve kalp görüntüleme yaşayan omurilik zor bir görev yapan önemli bir hareket artifakı anatomik yakınlık üretir. </p&gt; Biz, omurga stabilizasyon, solunum kaynaklı hareketlerin azaltılması ve böylece iki foton mikroskopi in vivo fare omurilik görüntü kullanımının kolaylaştırılması omurilik görüntüleme doğasında kısıtlamaların üstesinden gelen yeni bir yöntem geliştirdi . Bu önemli bir azalma, solunum bağlı hareketleri sonucu, derin bir anestezi yöntemi ile özelleştirilmiş bir spinal stabilizasyon cihaz birleştirerek elde edilir. Bu video protokol, doku hasarı minimumda tutmak ve kanama uzun süre boyunca stabil fizyolojik şartlar altında muhafaza edilebilir yaşayan omurilik küçük bir alanda açığa çıkarmak için nasıl gösterir. Temsilci ham görüntüleri yüksek çözünürlükte in vivo ayrıntılı olarak mikroglia arasındaki yakın ilişki ve damarsal satın aldı. Timelapse dizisi canlı fare omurilik mikrogliyal süreçlerin dinamik davranışı gösterir. Ayrıca, aynı z kare sürekli bir tarama göstermekresmi hizalaması alım sonrası gerekmez görüntü ve / veya timelapse filmleri yığınları oluşturmak için bu yöntem elde edebilirsiniz olağanüstü istikrar var. Sonuç olarak, in vivo olarak devam eden fizyolojik veya patolojik süreçler uzunlamasına çalışmalar için izin veren bu yöntem, daha sonra timepoints omurilik aynı bölgede tekrar ve Reimage nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy at JoVE.com

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Fare spinal kolon stabilize ve tekrarlayan gerçekleştirmek için minimal invaziv bir protokol<em&gt; In vivo</em&gt; Omurilik görüntüleme iki foton mikroskopi kullanılarak açıklanmıştır. Bu yöntem, solunum kaynaklı hareketlerini en aza indirmek ve hiçbir hizalama veya diğer post-processing gerektiren ham görüntü verisi üretmek için bir spinal stabilizasyon cihazı ve anestezi rejimi birleştirir.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

in-vivo-imaging-of-the-mouse-spinal-cord-using-two-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

23.8K Görüntüleme.  University of California, San Francisco. Fare spinal kolon stabilize ve tekrarlayan gerçekleştirmek için minimal invaziv bir protokol In vivo Omurilik görüntüleme iki foton mikroskopi kullanılarak açıklanmıştır. Bu yöntem, solunum kaynaklı hareketlerini en aza indirmek ve hiçbir hizalama veya diğer post-processing gerektiren ham görüntü verisi üretmek için bir spinal stabilizasyon cihazı ve anestezi rejimi birleştirir.

Video: In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Nörobilim

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Omurilik Görüntüleme

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Sıçan Servikal Spinal Kord difüzyon Görüntüleme

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...