Bu çalışma, Beyin Bilimleri Edmond ve Lily Safra Merkezi (SB dostluk), İsrail Bilim Vakfı (HS Hibe No 378/11,) The Legacy Mirası Biyomedikal Bilim Ortaklık Programı ve Bilimsel için Alman İsrail Vakfı tarafından desteklenmiştir Araştırma ve Geliştirme (GIF) (HS Grant No 1093-32.2/2010,).

1. Lentivirüs Hazırlık <ol><li> % 90 izdiham HEK-293FT hücreleri büyütün. </li><li> Serumsuz DMEM transfeksiyon değişim hücre orta günde 1 mM glutamin, ve 50 mg / ml penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş. </li><li> Bir pLKO.1-Puro, vektör ve bir taşıyıcı olarak 9: 1 mg / ml &#39;polietilenimin 10 ul kullanılarak delta R8.2 ve VSV-G grupları ve ilgi MiRNA kodlayan plazmid ile ko-transfekte hücreleri. </li><li> 0.45 mikron filtre ile filtre, 24 saat ve 48 saat sonrası transfeksiyon de ambalajlı lentivirüsler toplayın. </li><li> 2 saat ve 15 ° -70 C, kısım ve mağaza ° C için, 70.000 xg de Ultrasantrifügasyon kullanarak lentivirüsler Konsantre </li><li> Seri seyreltilmiş virüs preparatları (kuyu başına vektör 1 ile 10 -6 ml) ile HEK-293T hücreleri enfekte ölçüm virüs titresi. Elde edilen titresi (~ 1, en ​​az 10 ml x 9 bulaşıcı parçacıklar tavsiye edilir) ge sentezlenmesi için değerlendirilirilgi ne, puromycin seçimi kullanarak ve floresan hücreleri sayma yoluyla virüs ifade GFP miktarının tarafından. </li></ol> Lentivirüs hazırlık daha ayrıntılı bir protokol için 10 bakın. 2. Cerrahi Hayvanlar hazırlanması <ol><li> Cerrahlar giysi cerrahi önlük, steril eldiven, şapka ve maske içermelidir. </li><li> Hayvan tartılır, daha sonra her bir ilaç için belirtilen hayvan ağırlığı ile orantılı hacmi ile, bir Ketamin karışımın bir IP enjeksiyonu ile anestezi. Bir Ketamin / Ksilazin karışım için 80-200 mg / kg ketamin ve 7-20 mg / kg &#39;Ksilazin bir doz aralığı genellikle farenin için kullanılır. </li><li> Hayvan tam anestezi kadar bekleyin, sonra bacak uzanan ve sonra parmağınızla bastırarak hayvanın arka bacak içinde geri çekilme refleksi eksikliği olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Kutunun üzerinde belirtilen ağrı kesici, Rimadyl ile deri altı hayvan enjekte edilir. Rymadil için tipik doz aralığı 5-10 mg&#39;dır. </li><li> Sabit bir vücut sıcaklığı tutmak ve merhem ile gözleri nemlendirmek için bir ısıtma yastığı hayvan yerleştirin. </li><li> Bir kırpma makine ile iki kulak arasındaki alanda tıraş. </li><li> Betadin ile cilt dezenfekte. </li></ol> 3. Kafatası ve Sondaj maruz kalma <ol><li> Hayvanın kulak sadece ön yarıklar içine çubuklar ayarlayarak STEREOTAKT içindeki hayvanın yerleştirin. </li><li> Kulak arasındaki yaklaşık 1,5 cm bir ön-arka kesi yapmak ve cerrahi kelepçeleri (serfines) ile açık tutmak için bir neşter kullanın. </li><li> Bregma ve koronal ve lambdoidea&#39;ya sütür arasındaki kesişme yani,, koronal sütür ve sagittal sütür arasındaki kesişme kadar bir pamuklu çubukla kafatası yüzeyini temizlemek yani lambda, görülebilir. </li><li> Her üç eksen de bregma noktasına STEREOTAKT tarafından düzenlenen şırınga ucu,,, gelin. Koordinatları yazın. Bu noktada sıfır po olarak düşünülebilirher üç eksende int. </li><li> Bir düzlemsel hareket kafatası çizilmeye ve doğru konuma şırınga kafa hareket olmaz ki dikey eksende şırınga kaldırın. -2 Ön / arka eksende, ± medial / yan ekseninde 1.8 ve dorsal / ventral ekseninde -1.5: hipokampal CA1 enjeksiyon aşağıdaki mm bregma göre koordine gerektirir. </li><li> Bu kafatası temas edene kadar şırınga ucu indirin ve bir işaretleyici ile nokta işaretleyin. Bıçaklama önlemek için geri şırınga çıkarın. </li><li> Sadece ince bir delici kullanarak kafatası kemik sığ bir delik, açın. Bu nedenle yumuşak doku altında içine matkap devam olmaz delici sabit tutun. Sen diğer steadying bir elle ve kısa bakliyat delerek bu önleyebilirsiniz. </li></ol> 4. Lentivirüs Enjeksiyon <ol><li> Konsantre lentivirüs bir çözeltinin 0.5 ml çekin. </li><li> Delik üzerinde şırınga yerleştirin ve Rea kadar yavaşça dikey olarak daha düşükkafatasının nü içerir yüzeyi. Çok yavaş, beyin içine şırınga düşürmek için devam edin. Bu aşamada bir miktar kanama mutlaka başarısız bir penetrasyon göstermez hangi oluşabilir. Kanama oluşursa bir pamuklu çubuk ile paspas. </li><li> Dijital pompaya 0.02 ml / dakika (0.5 ul 25 dakika içinde enjekte olacak) ayarlayın ve infüzyon başlar. Yavaş infüzyon dokuya virüsün yayılmasını etkili için izin verir ve geri akışını engeller. Bazı şırınga tiplerinde orijinal koordinatları ve beslerken çekilmeden önce 0,5 mm ekstra bir derinlik için şırınga takmadan düşünün. </li><li> Infüzyon tamamlandıktan sonra malzeme yerine bir şırınga ile oluşturulan kanal içine geri çekilen bir beyin içine yaymak için izin vermek için ek 5 dakika boyunca bekleyin. </li><li> Çok yavaş şırınga çıkarın ve geri akışları için izleyin. Bir geri akış bu adımda gözlenirse, enjekte edilen malzemenin bir kısmını muhtemelen kayboldu. </li></ol> 5. Yara Sızdırmazlık ve Kurtarma <ol><li> Seal inciE histoakril ile yara. Gözlerinin içine histoakril sızmasını önlemek için emin olun. </li><li> Dehidratasyon önlemek için, 1 ml önceden ısıtılmış tuzlu su ile hayvan intraperitoneal (İP) enjekte edilir. </li><li> Isıtılmış bir pad üzerinde konumlandırılmış bir kurtarma kafeste hayvan yerleştirin. Bu, ilave bir saat için geri alırken hayvan izleyin. </li></ol> Kilo kaybı, iştahsızlık durumunda, zayıf / yem ya da su, can çekişme durumuna ya da enfeksiyon, hayvanın ötenazi elde edememe yapılmalıdır. Kemirgenler ötenazi kabul edilebilir yöntemler barbitüratlar, uçucu anestetikler, CO2, CO, veya genel anestezi ile birlikte potasyum klorürdür. 4-6 hafta sonra, hayvanın navigasyon bellek Morris su labirentinde değerlendirilir değerlendirmek. Lentivirüs genellikle enjeksiyon alanı içinde en hücreleri enfekte olacaktır. 6. Morris Su Maze Davranış Değerlendirme <ol><li> M hayvanları yetiştirmeksüsen Su Labirent. Tam eğitim ve test protokolü için 11 bakın. Her deneme sonra, kuru bir havlu ile kurulayın hayvan kafesine değiştirin ve depodaki su yenileyin. </li><li> Her gün birbirini takip eden 3 gün, 4 denemeler için, Morris su labirentinde hayvanlar test edin. Doğu-batı-kuzey-güney, iki gün: batı-güney Her gün örneğin gün biri için, değişen bir sırayla labirent (kuzey, güney, doğu ve batı) ve 4 yönde her labirent içine hayvan yerleştirin -kuzey-doğu. Her deneme sonra hayvanlar silin. </li><li> Test sırasında denemeler gibi Noldus izleme sistemi gibi bir takip sistemi ile hayvan izleyebilirsiniz. </li><li> 12. Test deneme sonra, bir dakika için bir platform olmadan su tankı içine hayvan yerleştirin. Bu hayvan alıyor arama stratejisi analiz için kullanılacak. </li><li> 12 önerilen gibi verileri analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Bir lentivirüs stereotaktik enjeksiyon için hem yukarı veya farklı genler ve miRNA&#39;lar yük atma in vivo değerlendirme için nispeten hızlı bir yöntemdir. Başlıca alternatif daha sonra çok daha zahmetli ve zaman alan bir tekniktir lentivirüs doğrudan enjeksiyon, bir genetik faredir. Buna ek olarak, yukarı regülasyonu, lentivirüs enjeksiyon, yetişkin fare belirli bir zamanda meydana gelir ve çoğu zaman geçici denetimi genetiği farelerde olduğu gibi, geliştirme sırasında sızdırma ol...

Sinir sisteminin işleyişinde özellikle miRNA&#39;lar rolü son zamanlarda birçok çalışmada lentiviral enjeksiyon meydan olmuştur. MiRNA sinaps yapısı 1, sinaptogenez 2 ve sinaps yeniden ve bakım 3 bakımı ve yeniden şekillendirme için çok önemli olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmalar güçlü bir yukarı şekillendirme hem de sinir sistemi, bilişsel fonksiyon ana çıkış korunmasında çok katmanlı düzenleyici etkileri ile, miRNA&#39;lar meşgul olduğunu göstermektedir. Kemirgen beynindeki belirli bölgeleri lentivirüs parçacıkların stereotaktik enjeksiyon sinaps morfolojisi ve nöronal aktivite Değişiklik için arama sağlar ve 4,5-aşırı ifade transkript fonksiyonel önemi kurulması için kullanılmıştır. MiRNA-ifade lentivirüsler ile iyi tanımlanmış beyin alanlarda nöronların doğrudan enfeksiyon yaşlanma, beyin hastalıkları ve nörodejenerasyon çalışmalarında karışmış olabilir; miRNA Çalışmalarıs davranışsal düzenleme 6-8 dünyasında bir çok daha az gelişmiş devlet altındadır, ve stereotaktik enjeksiyon miRNA-ifade davranış testleri takip lentivirüs parçacıklar gibi amaçlar için yararlı olabilir. Aşırı ya da az ifade uyaran için çok daha zahmetli yöntemi genetik knock-in veya farelerde mühendislik içerir. Genetik sistemleri daha da ifade koşullu ve zamansal kontrolünün (örneğin, Kre-Lox, Tet sistemler) için izin verebilir, ancak bu pek bir enjeksiyon işlemi uzamsal özgüllüğünü sunmak ve sızdırma bir miktar hemen hemen her zaman bulunmamaktadır. Ayrıca, mühendislik yöntemleri ameliyat gerektirmeyen ve nispeten iyi tekrarlanabilirlik ile laboratuvarlar arasında kullanılabilir, ancak onlar daha yavaş ve çok daha fazla insan gücü ve mali kaynak gerektirir. Buna ek olarak, kontrol geçici aşırı ya da enjekte edilmiş farelerde altında ekspresyonu genetik farelere kıyasla çok daha doğru olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

MicroRNA (miRNA&#39;lar) uzun 22 nükleotid çevresinde küçük düzenleyici tek zincirli RNA molekülleri olduğunu olabilir her hedef çok sayıda mRNA transkript ve neden olan yıkım ve / veya bu hedeflere inhibe çeviri tarafından loş bütün bir gen yolu. Çeşitli miRNA&#39;lar nöronal yapı ve fonksiyonu sürdürmek ve üst düzey beyin fonksiyonlarında önemli rol oynayan ve yöntemleri bu işlevler keşfetmek için kendi seviyelerini değiştirmek için aranır. Burada, MiRNA kodlayan virüs partiküllerinin stereotaktik enjeksiyon yoluyla uygulanan farelerde aşırı miRNAs bilişsel sonuçları incelemek için in vivo metot, doğrudan mevcut. Özellikle, mevcut protokol memeli bellek konsolidasyon, öğrenme ve stres yanıtları katkıda bulunur ve uygun bir enjeksiyon yeri sunmaktadır hipokampal CA1 bölgesinde, içine enjeksiyon içerir. Koordinatları fare bregma ve virüs perfüzyon dijital kontrollü ve çok yavaş tutulur göre ölçülür.Enjeksiyon sonrası, cerrahi yara kapalı ve hayvanların kurtarmak olduğunu. Ilgili mRNA hedeflerin susturucular kodlama lentivirüsler naif fare ile, gözlenen etkisi sorumlu özel miRNA / hedef etkileşimi ima hizmet, tuzlu ve kontrol grubu olarak &quot;boş&quot; lentivirüs vektörleri enjekte fareler enjekte fareler. Bir ay sonrası enjeksiyon, hayvanlar kendi navigasyon öğrenme ve bellek yeteneklerini değerlendirmek için Morris Su Maze (MWM) incelenmiştir. MWM 1 cm su yüzeyinin altında batık küçük bir platformu ile renkli su dolu yuvarlak bir tank. Tankın etrafında sabit görsel ipuçları mekansal navigasyon (ses ve dünyanın manyetik alanı da navigasyon hayvanlar yardımcı olabilir) için izin verir. Video kamera izleme bulmak ve platform miktar için yüzme ve zaman yol ölçüm sağlar. Fare ilk gizli montaj platformu zorla yüzme bir kaçış sunuyor öğretilir, daha sonra bu kaçış ve f kullanmak için test edilirinally, platform kaldırılır ve fare önceki konumuna hatırlar eğer prob testleri incelemektir. Birkaç gün üst üste tekrar tekrar test platformu bulmak ve monte etmek daha kısa gecikmeleri test farelerin gelişmiş performans vurgulamak ve daha direkt hatları platform ya da konumu ulaşmak için. Bu gelişme daha sonra (yükseltilmiş artı labirent gibi) özel olarak test edilebilir bozulmuş öğrenme ve bellek ve / veya anksiyete, temsil göstermek için başarısız. Bu yaklaşım, bilişsel eğitim ve / veya stres ile ilgili işlemlerde özel miRNAs ve hedef transkript doğrulama sağlar.

Protokol bölümünde belirtilen debi ile fare hipokampta CA1 bölgesinde, içine 0.5 ul lentivirüs enjeksiyon rostral-kaudal ekseninde yaklaşık 1 mm enfekte bir küre verir ve 0.5 medial yan mm ve ön ile ilgili -arka eksen (Şekil 3). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Şekil 1. Bregma noktası ve enjeksiyon cihazı. (A) gösterilir bregma (koronal ve sagital sütür kavşak) ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome at JoVE.com

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNA beyin yapısı ve fonksiyonu önemli rolleri vardır. Burada aşırı ifadesi bir mühendislik miRNA-ifade lentivirüs stereotaktik enjeksiyonu kullanılarak hipokampal miRNA uygulamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, değerlendirmek için nispeten hızlı bir yöntem olarak hizmet verebilir<em&gt; In vivo</em&gt; Spesifik beyin bölgelerinde aşırı ifade miRNAs etkisi.

Bir Stereotaktik Enjeksiyon MicroRNA-ifade Fare Hippocampus CA1 Bölgesi Lentiviruses ve Davranış Sonuç Değerlendirilmesi

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

stereotactic-injection-microrna-expressing-lentiviruses-to-mouse

Research

JoVE Journal

Behavior

22.6K Görüntüleme.  The Hebrew University of Jerusalem. MicroRNA beyin yapısı ve fonksiyonu önemli rolleri vardır. Burada aşırı ifadesi bir mühendislik miRNA-ifade lentivirüs stereotaktik enjeksiyonu kullanılarak hipokampal miRNA uygulamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, değerlendirmek için nispeten hızlı bir yöntem olarak hizmet verebilir In vivo Spesifik beyin bölgelerinde aşırı ifade miRNAs etkisi.

Video: Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of chronic CNS disorders, there is an increasing demand for murine models with high validity at the behavioral level. However, multiple pathogenic mechanisms and complex functional deficits often impose challenges to reliably measure and interpret behavior of chronically sick mice. Therefore, the assessment of peripheral pathology and a behavioral profile at several time points using a battery of tests are required. Video-tracking, behavioral spectroscopy, and remote acquisition of physiological measures are emerging technologies that allow for comprehensive, accurate, and unbiased behavioral analysis in a home-base-like setting. This report describes a refined phenotyping protocol, which includes a custom-made monitoring apparatus (Integrated Behavioral Station, INBEST) that focuses on prolonged measurements of basic functional outputs, such as spontaneous activity, food/water intake and motivated behavior in a relatively stress-free environment. Technical and conceptual improvements in INBEST design may further promote reproducibility and standardization of behavioral studies.

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST

Prolonged and comprehensive monitoring of mice in a home-cage environment provides a deeper understanding of aberrant behavior in murine models of brain diseases. This paper describes the Integrated Behavioral Station (INBEST) as the key component of contemporary behavioral analysis.

Entegre Davranış İstasyonu ile Kemirgen Hastalık Modellerinin Davranış Fenotiplendirme (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Davranış

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of studies show changes in balance phenotype with age in rodents, very few isolate the vestibular contribution to balance under either normal conditions or during senescence. We use two standard behavioral tests to characterize the balance performance of mice at defined age points over the lifespan: the rotarod test and the inclined balance beam test. Importantly though, a custom built rotator is also used to stimulate the vestibular system of mice (without inducing overt signs of motion sickness). These two tests have been used to show that changes in vestibular mediated-balance performance are present over the murine lifespan. Preliminary results show that both the rotarod test and the modified balance beam test can be used to identify changes in balance performance during aging as an alternative to more difficult and invasive techniques such as vestibulo-ocular (VOR) measurements.

Motor control and balance performance are known to deteriorate with age. This paper presents a number of standard noninvasive behavioral tests with the addition of a simple rotary stimulus to challenge the vestibular system and show changes in balance performance in a murine model of aging.

Yaşlanma Fare Vestibüler Sistemi Davranışsal Değerlendirme

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific genes in encoding experience is one of the main objectives of molecular neuroscience. Furthermore, the functional association of defined genes with specific behaviors has implications for understanding the basis of neuropsychiatric disorders. Induction of robust transcription programs has been observed in the brains of mice following various behavioral manipulations. While some genetic elements are utilized recurrently following different behavioral manipulations and in different brain nuclei, transcriptional programs are overall unique to the inducing stimuli and the structure in which they are studied1,2.
In this publication, a protocol is described for robust and comprehensive transcriptional profiling from brain nuclei of mice in response to behavioral manipulation. The protocol is demonstrated in the context of analysis of gene expression dynamics in the nucleus accumbens following acute cocaine experience. Subsequent to a defined in vivo experience, the target neural tissue is dissected; followed by RNA purification, reverse transcription and utilization of microfluidic arrays for comprehensive qPCR analysis of multiple target genes. This protocol is geared towards comprehensive analysis (addressing 50-500 genes) of limiting quantities of starting material, such as small brain samples or even single cells.
The protocol is most advantageous for parallel analysis of multiple samples (e.g. single cells, dynamic analysis following pharmaceutical, viral or behavioral perturbations). However, the protocol could also serve for the characterization and quality assurance of samples prior to whole-genome studies by microarrays or RNAseq, as well as validation of data obtained from whole-genome studies.

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Davranış Deneyim ardından Beyin Örneklerden Deşifre Dynamics Kapsamlı Analizi

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the test mouse is placed in a standardized apparatus and relevant behaviors are assessed in three different sessions (called session I, II, and III).
The apparatus has three compartments (see Figure 1), the left and right compartments contain an inverted cup which can house a mouse (called &#34;stimulus mouse&#34;).
In session I, the test mouse is placed in the cage and its mobility is characterized by the number of transitions made between compartments. In session II, a stimulus mouse is placed under one of the inverted cups and the sociability of the test mouse is quantified by the amounts of time it spends near the cup containing the enclosed stimulus mouse vs. the empty inverted cup. In session III, the inverted cups are removed and both mice interact freely. The sociability of the test mouse in session III is quantified by the number of social approaches it makes toward the stimulus mouse and by the number of times it avoids a social approach by the stimulus mouse.
The automated evaluation of the movie detects the nose of the test mouse, which allows the determination of all described sociability measures in session I and II (in session III, approaches are identified automatically but classified manually). To find the nose, the image of an empty cage is digitally subtracted from each frame of the movie and the resulting image is binarized to identify the mouse pixels. The mouse tail is automatically removed and the two most distant points of the remaining mouse are determined; these are close to nose and base of tail. By analyzing the motion of the mouse and using continuity arguments, the nose is identified.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52508/52508fig1.jpg" /> 
Figure 1. Assessment of Sociability During 3 sessions. Session I (top): Acclimation of test mouse to the cage. Session II (middle): Test mouse moving freely in the cage while the stimulus mouse is enclosed in an inverted cup. Session III (bottom): Both test mouse and stimulus mouse are allowed to move freely and interact with each other.

This protocol describes a method to quantify mouse sociability. Mice are videotaped as they move and interact in a special cage. Movie processing allows for the automated quantification of sociability with excellent accuracy and reliability.

Bir Otomatik Görüntü İşleme Yaklaşımı ile Fare Sosyallik Deneysel Değerlendirilmesi

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or knockdown gene expression in a relatively focused region without significant damage to the brain tissue. After recovery, the injected mouse can be tested on various behavioral tasks such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST). The OFT is designed to assess locomotion and the anxious phenotype in mice by measuring the amount of time that a mouse spends in the center of a novel open field. A more anxious mouse will spend significantly less time in the center of the novel field compared to controls. The FST assesses the anti-depressive phenotype by quantifying the amount of time that mice spend immobile when placed into a bucket of water. A mouse with an anti-depressive phenotype will spend significantly less time immobile compared to control animals. The goal of this protocol is to use the stereotactic injection of a lentivirus in conjunction with behavioral tests to assess how genetic factors modulate animal behaviors.

Stereotactic injection of lentiviruses expressing cDNAs or shRNAs can modulate gene expression in specific brain areas of mice. Here, we present a protocol to combine stereotactic injections with behavioral tasks, such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST).

Stereotaktik Enjeksiyon Tekniği uygulamak Hayvan Davranışları üzerinde Genetik Etkileri Eğitim için

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

Aracı Olarak vagus sinir stimülasyonu Extinction Öğrenme İlgili Pathways Plastisitesi tetikleyebilecek

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human auditory development for these age groups. This paper describes an observer-based procedure for measuring hearing sensitivity with a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm. Young children are trained to perform a play-based, motor response (e.g., putting a block in a bucket) whenever they hear a target signal. An experimenter observes the child&#39;s behavior and makes a judgment about whether the signal was presented during the first or second observation interval; the experimenter is blinded to the true signal interval, so this judgment is based solely on the child&#39;s behavior. These procedures were used to test 2 to 4 year-olds (n = 33) with no known hearing problems. The signal was a 1,000 Hz warble tone presented in quiet, and the signal level was adjusted to estimate a threshold corresponding to 71%-correct detection. A valid threshold was obtained for 82% of children. These results indicate that the two-interval procedure is both feasible and reliable for use with toddlers and preschoolers. The two-interval, observer-based procedure described in this paper is a powerful tool for evaluating hearing in young children because it guards against response bias on the part of the experimenter.

This paper describes a procedure for measuring hearing sensitivity in 2 to 4 year-old children. Children are trained to perform play-based responses when they hear a target signal. Thresholds are then estimated in a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm, based on observations of the child&#39;s behaviors.

4 Yaşındaki Çocuklara 2&#39;de İşitme Davranışsal Değerlendirme: A İki aralık, Gözlemci tabanlı Prosedür Koúullanmıú Play-tabanlı Yanıtları kullanma

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human ...

A Behavioral Test Battery for the Repeated Assessment of Motor Skills, Mood, and Cognition in Mice

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and dysfunctions in mood and cognition are common and often shared symptoms in neurodegenerative diseases. Shown here is a behavioral test battery for motor, mood, and cognition, which can be repeatedly tested in a longitudinal study. This battery assesses the overall behavioral phenotype in mice by examining each domain of behavior with at least two independent well-accepted tests (i.e., open-field test and rotarod test for motor function, social interaction test, elevated plus maze test, and forced swim test for emotional function, and Morris water maze test and novel object recognition test for cognitive function). Therefore, this sensitive and comprehensive test battery is a powerful tool for the study of behavioral alternation in neurodegeneration.

A comprehensive behavioral test battery of motor skills, mood&#8212;including social interaction, depression, and anxiety&#8212;and cognition is designed for the repeated assessment of neurodegeneration-related behavioral changes in mice.

Motor becerileri, ruh hali ve biliş farelerde tekrar tekrar değerlendirilmesi için bir davranış Test pil

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and ...

Utilizing a Reconfigurable Maze System to Enhance the Reproducibility of Spatial Navigation Tests in Rodents

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze shape, thus requiring several separate mazes in different configurations. The maze geometry cannot be reconfigured in a single environment to accommodate scalability and reproducibility. The reconfigurable maze is a unique approach to address the limitations, allowing quick and flexible configurations of maze pathways in a repeatable manner. It consists of interlocking pathways and includes feeders, treadmills, movable walls, and shut-off sensors. The current protocol describes how the reconfigurable maze can replicate existing mazes, including the T-shaped, plus-shaped, W-shaped, and figure-eight mazes. Initially, the T-shaped maze was constructed inside a single experimental room, followed by modifications. The rapid and scalable protocol outlined herein demonstrates the flexibility of the reconfigurable maze, achieved through the addition of components and behavioral training phases in a stepwise manner. The reconfigurable maze systematically and precisely assesses the performance of multiple aspects of spatial navigation behavior.

The present protocol describes a reconfigurable maze, a unique system for testing spatial navigation and behavioral phenotypes in rodents. The adaptability of this maze system enables the execution of various experiments in a single physical environment. The ease of structural rearrangement generates reliable and reproducible experimental results.

Kemirgenlerde Mekansal Navigasyon Testlerinin Yeniden Üretilebilirliğini Artırmak için Yeniden Yapılandırılabilir Bir Labirent Sistemi Kullanmak

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze ...

Davranışsal Testler Kullanarak Angelman Sendromunun Murin Modelini Doğrulama

Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of AS. We use the rotarod learning paradigm, detailed gait analysis, and nest building test to detect and characterize animal motor impairments. We test animal emotionality in the open field and elevated plus maze tests, as well as the affect in the tail suspension test. When AS mice are tested in the open field test, the results should be interpreted with care, since motor dysfunctions influence mouse behavior in the maze and alter activity scores.
The reproducibility and effectiveness of the presented behavioral tests has already been validated in several independent Uba3a mouse lines with different knockout variants, establishing this set of tests as an excellent validation tool in AS research. Models with the relevant construct and face validity will warrant further investigations to elucidate the pathophysiology of the disease and grant the development of causal treatments.

Yazar Spotlight: Bir Angelman Sendromu Murin Modelini Doğrulamak için Yüksek Derecede Tekrarlanabilir Davranış Testleri Dizisi 

This manuscript presents a set of highly reproducible behavioral tests to validate an Angelman syndrome mouse model.

Angelman Sendromlu Bir Fare Modelinin Davranışsal Karakterizasyonu

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...