Biz yazının dikkatli bir okuma için Amie Regan teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma LD ve CCF için DFG hibe FR2938/1-1 için NGFN Artı hibe # 01GS0801, MRC dostluk hibe G1002523 ve NHSBT hibe WP11-05 tarafından desteklenmiştir

1. 4-thiouridine ile Metabolik Etiketleme Deney düzeneği / program ayrıntılı bir plan yapın, hücre kültürü için 4SU eklemek için ne zaman ve örnekleri hasat zaman örneğin. Her durumda arasında en az 5 dakika boyunca Planı. Bir seferde sadece bir durumun hücre tedavisi. Max tutun. 3 - belirli bir zamanda 5 yemekleri. Sıcaklık ve CO2 düzeylerindeki değişiklikler en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk hücreleri tutun. Bu hücresel proteinlere 4SU-etiketli RNA çapraz neden olabilir 4SU eklendikten sonra parlak ışık hücreleri maruz bırakmayın. Etiketleme başlangıcı <ol><li> Çözülme 4-thiouridine (4SU) sadece steril bir Falcon tüp içine her bir durum için 4SU kullanımı ve pipet gerekli miktarda önce. </li><li> Yemekler kapalı hücre kültür ortamı gerekli miktarda (10 cm tabak başına 5 ml) alın ve 4SU içeren Falcon tüp eklemek ve iyice karıştırın. Çıkarın ve yemekleri kalan orta atın. </li> &lt;li&gt; yemekleri 4SU içeren orta geri uygulayın. </li></ol> Etiketleme sonu <ol start="4"><li> Hücrelerinden hücre kültürü ortamı çıkarın. Her plaka için Trizol 5 ml ilave edilir. Çok sayıda zaman noktasında ya da koşullar da dahil olmak üzere karmaşık bir deney için, bu adım en çok iki kişi, orta, Trizol ekleme ve lizat hasat diğer bir kaldırarak yapılır. </li><li> Tam bir hücre parçalama, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Eklendi Trizol ile dikkatli bir şekilde plaka durulama bir 10 ml pipet kullanın. Bu tam hücre parçalama ve örnek kurtarma yardımcı olur. Cilt veya gözlerle temas alırken Trizol son derece tehlikeli olduğu gibi dikkatli olun! Eldeki fenol yanıklar (örneğin polietilen glikol 300 veya endüstriyel metil alkol (70:30) 400) için panzehir var. Polipropilen tüplere örnekleri aktarın. Standart Falcon tüpler) bu yüksek g kuvvetleri karşı değil lütfen unutmayın. Örnekler I Toplam RNA kadar en az bir ay süreyle -20 ° C&#39;de saklanabilirs hazırlanmıştır. </li></ol> 2. Modifiye Trizol Protokolü kullanarak RNA Hazırlık <ol><li> 1 ml kloroform (ml Trizol başına 0.2 ml) ekleyin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalanır. 3 dakika - 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika 13,000 x g&#39;de santrifüjleyin ° C </li><li> Yeni bir 15 ml polipropilen tüpe sulu üst faz (RNA ihtiva eden) aktarın. </li><li> RNA ekleme ½ Çöktürme tamponu ve izopropanol hem de reaksiyon hacmi (3 ml süpernatant, örneğin, 1.5 ml RNA Çöktürme tamponu ve 1.5 ml izopropanol ekleme). </li><li> İyice karıştırın. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 4, 10 dakika boyunca 13.000 x g&#39;de santrifüje ° C Süpernatant atın. </li><li> Kısaca aşağı doğru döndürün (5000 × g 30 saniye) ve 200 ul pipet ile artık izopropanol çıkarın. </li><li> % 75 etanol eşit hacim eklemek ve topak ayrılıncaya kadar tüp çalkalanır. Geride kalan bu kadar çok küçük parçalar halinde o kırılma önlemek yapabilir kaldırmal etanol zor. </li><li> 4, 10 dakika boyunca 13.000 x g&#39;de santrifüje ° C Süpernatant atın. </li><li> Kısaca RNA aşağı Spin ve 200 ul pipet ile kalan etanol çıkarın. 20 ul pipet ile kalan etanol adım ve çıkarın tekrarlayın. Bu iki adım sonra, pelet başka bir kurutma işlemi ifa edilmelidir. </li><li> 100 mg beklenen RNA verim başına H 2 O 100 ul ekleyin ve 5 aşağı yukarı pipetleme ve ile iyice karıştırın - 6 kez RNA çözme yardımcı olmak için. </li><li> Çözülür ve 65 ısıtılarak denatüre RNA ° C&#39;de 10 dakika (çalkalama) ve hemen buz üzerine yerleştirin. </li><li> Üreticinin yönergeleri izleyerek, bir NanoDrop spektrofotometre kullanılarak 260 nm dalga boyunda konsantrasyon RNA ölçün. Bu RNA, en az bir ay boyunca -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 3. Yeni Transkripsiyonu RNA tiol özgü biyotinilasyon <ol><li> 60 ile başlayın - toplam hücresel RNA 80 mikrogram. </li><li> Reaksiyon etiketleme oluşturmaktadır. Aşağıdaki Pipetsipariş (başına mikrogram RNA): <ol class="lalpha"><li> 1 ul 10x biyotinilasyon Tampon </li><li> 7 ul RNA (nükleaz içermeyen H 2 O seyreltilmiş 1 mg RNA içeren) </li><li> 2 ul Biotin-HPDP (1 mg / ml DMF) </li></ol></li></ol> Her zaman biotin-HPDP son ekleyin ve pipetleme hemen karıştırın. Biyotin çökeltiler durumda, DMF içeriği% 40 arasında bir konsantrasyona kadar arttırılabilir. <ol start="3"><li> Rotasyonu ile 1.5 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Kloroform eşit hacimde ekleyin. Şiddetle karıştırın. Aşamalarını başlar ve kabarcıklar yok başlayana kadar 3 dakika - 2 inkübe edin. </li><li> 4 ° C de 5 dakika için 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin Dikkatli bir şekilde yeni bir tüp içine, üst sulu faz transfer. </li><li> Bir kez adımları 3.4 ve 3.5 tekrarlayın. Bu RNA kaybını azaltmak için 2 ml Faz Kilidi Jel Ağır tüplerde bu adımı gerçekleştirmek isteyebilirsiniz. </li><li> RNA ayrılması: eklenti 1/10 5 M NaCI ve hacmi eşit hacimdeSu fazı, izopropanol. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin Süpernatant atın. </li><li> Supernatant 10 dakika 4 ° C&#39;de 20,000 azından% 75 etanol, santrifüj eşit bir hacmi x g ekleyin. </li><li> Kısaca Spin ve 200 ul pipet ile artık etanol çıkarın. </li><li> Kısaca Spin ve 20 ul pipet ile artık etanol çıkarın. </li><li> RNA kurumasına izin vermeyin. 50 yeniden askıya - 100 ul H 2 O (1 mcg giriş RNA başına ~ 1 ul). 6 kez - 5 yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> RNA bozulma dışlamak için electrophoretical analizi ile RNA kalitesini kontrol edin. </li></ol> 4. 4SU-Esas nokta Blot Analizi (İsteğe bağlı) 4SU ​​birleşme kolayca biyotinile edilmiş RNA dot blot analizi ile tespit edilebilir. Bu sorun giderme ve biotinlenmiş DNA oligo kontrole göre 4SU dahil oranlarının tahmin sağlayan isteğe bağlı bir adımdır. Bu tahlil için, biz rAdım 3.2 4SU-etiketli RNA biyotinilasyon için yerine biotin-HPDP bir iyodoasetil-biotin kullanarak ecommend. 4SU-RNA geri dönüşü olmayan bir biyotinilasyon ile sonuçlanır. Bu nedenle, kolon dayalı yöntemler (örneğin, RNeasy) biyotinile edilmiş RNA çok küçük miktarlarda (örneğin, 5 mg) geri kazanılması için kullanılabilir. RNA, bu tahlil için uygun olan biotin-HPDP biotinli olsa da, elde edilen sinyali (Şekil 3) ve zayıf sinyal-gürültü oranı daha az tercih edilir. <ol><li> Bölüm 1 ve 2 de tarif edildiği gibi toplam hücresel RNA 4SU-etiketleme ve izolasyonu için protokol takip edin. </li><li> Iyodoasetil-biotin ile biotin-HPDP yerine bölümünde 3 açıklanan ve tamamen aşırı iyodoasetil-biotin artıkları çıkarmak için iki kloroform ekstraksiyon gerçekleştirmek olarak Biotinylate RNA 4SU-etiketli. </li><li> Açıklanan ya da olgu RNA az miktarda ((örneğin RNeasy) bir sütun tabanlı yaklaşım kullanarak olarak izopropanol / etanol yağış biyotinlenmiş RNA Kurtar &lt;10 mg) Kullanılır. </li><li> 10 dakika süre ile sallanan nükleaz içermeyen su içinde Zeta membran inkübe edin. </li><li> Nükleaz içermeyen su dışında zar atın ve iki temiz kağıt havlu ve sıkıca basarak arasında membran yerleştirerek aşırı sıvı çıkarın. Hava ile kurutma 5 dakika boyunca zarın güzel noktalar ile sonuçlanacaktır. </li><li> Her numune için, buz gibi soğuk nokta benek bağlama tamponu (10 mM NaOH, 1 mM EDTA) kullanılarak 200 ng / ul RNA 20 ul hazırlar. Pipetleme Zeta zara bu seyreltme 5 ul (RNA yani 1 ug) ve aynı zamanda takip eden üç 10-kat seyreltme (örneğin, sırasıyla 100, 10 ve 1 ng RNA) uygulanır. Pipet uçları boş bir raf ile pipetleme eşit olarak dağıtılmış boşluk sağlamak için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir nokta lekesi cihazı kullanın. </li><li> Olumlu bir devam olarak 20 ng / ul 20 ug / ml (yani, 100-0,1 ng oligo), değişen konsantrasyonlarda biyotin-etiketli DNA oligo 5 ul uygulayınpipetleme membran rol. Negatif kontrol olarak biotinlenmiş, 4SU-naif örnek kullanın. </li><li> Açık havada kurumaya 5 dakika boyunca membran. </li><li> Sallama ile 40 ml bloke tamponu içinde 30 dakika boyunca zarın inkübe edin. </li><li> 15 dakika (5 ml PBS + 5 ml% 20 SDS + 10 ul streptavidin-yaban turpu peroksidaz) için 1:1,000, streptavidin-yaban turbu peroksidazı 10 mL &#39;si ile inkübe membran </li><li> 5 dakika boyunca 40 ml PBS +% 10 SDS (20 mi PBS + 20 ml% 20 SDS) içinde iki kez membran yıkayın. </li><li> 40 ml PBS içerisinde iki kez membran yıkayın 5 dakika boyunca +% 1 SDS (38 ml PBS + 2 ml% 20 SDS). </li><li> 40 ml PBS içerisinde iki kez membran yıkayın 5 dakika boyunca +% 0.1 SDS (40 mL PBS + 200 ul% 20 SDS). </li><li> Iki temiz kağıt havlu arasında membran yerleştirerek ve sıkıca bastırarak aşırı sıvı çıkarın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre ECL kullanarak membrana bağlı HRP gözünüzde canlandırın. </li><li> Plastik folyo / torbaya membran yerleştirin, hava kabarcıkları ve karanlıkta 2 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Membran maruz1 Film - 5 dk. </li></ol> 5. Streptavidin kaplı Manyetik Boncuk kullanarak Etiketli ve Etiketsiz RNA ayrılması <ol><li> Isı ° C bir su banyosunda 65 (örnek başına 3 ml) bir yıkama tamponu. </li><li> Nükleaz içermeyen H 2 O taze 100 mM ditiyotreitol (DTT) hazırlayın Ultra-ince terazi gözü üzerine yerleştirildi, temiz bir 50 ml Falcon tüpüne DTT toz, 30 mg - 15 şişeden bunu. Nükleaz içermeyen H 2 O gerekli miktarda tartılır ve ekleyin </li><li> Isı ° C 10 denatüre dk ve buz üzerinde hemen yer 65 RNA örnekleri biotinlenmiş. </li><li> Yer manyetik stand içine sütun μMacs. Biz bir anda birden fazla 12 örnek (- 8 örnekleri uygun olan 6) işlemek için değil tavsiye. </li><li> 1 ml oda sıcaklığında tampon yıkama ile ön dengeye Miltenyi sütunlar. Bu yaklaşık 15 dakika sürer. </li><li> Bu arada, 50 streptavidin boncuk 100 ul - biyotinile edilmiş RNA 100 ul. Rotasyonu ile 15 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. </li> &lt;<html> li&gt; sütunları herhangi artık boşaltma başlatılan değilse bu hafifçe bir eldivenli parmak ile sütunun üstüne basarak kolaylaştırılabilir. Bir kez akışını sütunları kolayca tahliye başlamıştır. </li><li> Sütunlara RNA / boncuk uygulayın. Akış-size etiketsiz RNA fraksiyonu (bkz. bölüm 7) kurtarmak istediğiniz sürece atın. </li><li> 0.9 ml 65 ° C yıkama tampon maddesi (65 ° C&#39;de tampon pipetleme 1 ml&#39;lik pipet uçları shrink). Ile üç kez yıkayın </li><li> 0.9 ml oda sıcaklığında yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. </li><li> Pipet 700 ul Tampon yeni 2 ml tüpler içine RLT (RNeasy MinElute Temizleme Kiti, Qiagen) ve sütunları altına koyun. </li><li> Sütununa 100 mM DTT, 100 ul ekleyerek RLT tampon içine yeni kopyalanan RNA Zehir. </li><li> 100 mM DTT başka bir 100 ul ekleyerek sonra aynı tüp içine ikinci bir elüsyon turda 3 dk gerçekleştirin. </li></ol> 6. Yeni kopyalanan RNA geri kazanımı ontent &quot;&gt; üreticinin talimatları izleyerek RNeasy MinElute Temizleme (Qiagen) protokolü ile devam edin. 25 ul nükleaz içermeyen H 2 O ölçün RNA konsantrasyonlarda Zehir bir Nanodrop Spektrofotometre kullanarak. göndermeden önce RNA çözülme ve yeniden dondurmak için ihtiyaç önlemek için bir yüksek verimli test için, hemen yeni transkripsiyonu RNA sonra cDNA hazırlanıyor tavsiye arındırılır. üreticinin talimatları cDNA sentezi için 20 ul cDNA sentezi karışımı yeni transkripsiyonu RNA 2.5 ul kullanın. 1 ile Mah-PCR kontrolleri gerçekleştirin : cDNA karışımı 10 dilüsyonları -80 ° C&#39;de saklayın RNA. 7. Etiketsiz, Sınırsız RNA (İsteğe bağlı) geri kazanımı Durumda ilişkisiz RNA geri gereken, akış yoluyla (sütunlara RNA-streptavidin boncuk çözüm ekledikten sonra) ve sonraki yağış için ilk yıkama toplamak ve birleştirmek. Genellikle thi olarak ilişkisiz RNA sadece 50% çöktürmek için yeterlidirin başlangıç ​​malzemesinin&gt;% 80 içerir. <ol><li> Izopropanol eşit hacimde (tuz yıkama tamponu önce, 1 M NaCl içeren olarak ilave edilmesi gerekir). </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin Süpernatant atın. </li><li> Supernatant 10 dakika 4 ° C&#39;de 20,000 azından% 75 etanol, santrifüj eşit bir hacmi x g ekleyin. </li><li> Kısaca Spin ve 200 ul pipet ile artık etanol çıkarın. </li><li> Kısaca Spin ve 20 ul pipet ile artık etanol çıkarın. </li><li> RNA kurumasına izin vermeyin. 100 ul H 2 O içinde süspanse 6 kez - 5 yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Çalkalama ile 10 dakika boyunca 65 ° C&#39;de inkübe edilir ve buz ile doğrudan transfer. </li><li> RNA bozulma dışlamak için electrophoretical analizi ile RNA kalitesini kontrol edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays.">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+the+yeast+genome+defined+by+RNA+sequencing.">The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing.</a> Science. 320, 1344-1349 (2008).</li><li>Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+repertoire+of+a+eukaryotic+transcriptome+surveyed+at+single-nucleotide+resolution.">Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution.</a> Nature. 453, 1239-U1239 (2008).</li><li>D&#246;lken, L., Ruzsics, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li><li>Yang, E., van Nimwegen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decay+rates+of+human+mRNAs:+correlation+with+functional+characteristics+and+sequence+attributes.">Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes.</a> Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).</li><li>Friedel, C. C., D&#246;lken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+principles+of+mammalian+transcriptional+regulation+revealed+by+RNA+half-life.">Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life.</a> Nucleic Acids Res. 37, e115 (2009).</li><li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing.">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463, 457-463 (2010).</li><li>Windhager, L., Bonfert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+short+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. , (2012).</li><li>Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+6-thioguanosine+and+4-thiouridine+into+RNA.+Application+to+isolation+of+newly+synthesised+RNA+by+affinity+chromatography.">Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography.</a> Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).</li><li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay.">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).</li><li>Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+newly+synthesized+RNA+in+cells+and+animals.">Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Rabani, M., Levin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells.">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. , (2011).</li><li>Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TU-tagging:+cell+type-specific+RNA+isolation+from+intact+complex+tissues.">TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues.</a> Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).</li><li>Miller, C., Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 458 (2011).</li><li>Weintz, G., Olsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphoproteome+of+toll-like+receptor-activated+macrophages.">The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages.</a> Mol. Syst. Biol. 6, 371 (2010).</li><li>Lipsett, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+4-thiouridylic+acid+from+the+soluble+ribonucleic+acid+of+Escherichia+coli.">The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).</li><li>Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+Transcriptional+Profiling+of+Cellular+and+Viral+Gene+Expression+during+Lytic+Cytomegalovirus+Infection.">Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection.</a> PLoS Pathog. 8, e1002908 (2012).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+technical+reports.+Modification+of+the+TRI+reagent+procedure+for+isolation+of+RNA+from+polysaccharide-+and+proteoglycan-rich+sources.">Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources.</a> Biotechniques. 19, 942-945 (1995).</li><li>Friedel, C. C., D&#246;lken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA:+implications+for+transcriptomics.">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).</li><li>Friedel, C. C., Kaufmann, S., D&#246;lken, L., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HALO+-+A+Java+framework+for+precise+transcript+half-life+determination.">HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination.</a> Bioinformatics. , (2010).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Yeni transkripsiyonu RNA Metabolik etiketleme ölçüde ilgi biyolojik soruya cevap daha uygun şablonlar sunarak mikroarrayler ve RNA-seq gibi yüksek verimli teknolojilerin gücünü artırır. İşbu Protokol kapsamlı optimizasyon yapıldı. Bu yeni transkripsiyonu RNA&gt; 1000 kat zenginleştirme sağlar ve yüksek tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Yeni transkripsiyonu RNA sadece 4SU hücrelerin maruz kalma döneminde gerçek zamanlı transkripsiyonel aktivitesini tasvir gibi bir 4SU-e...

Gen ekspresyon profili hücresel süreçleri ve ilgili karmaşık bir etkileşim ağı incelemek için kullanılan önemli bir araçtır. MRNA bolluk ile ilgili çalışmalar genellikle altta yatan moleküler mekanizmaları, temel anlayışlar elde etmek için tercih edilen yöntem olmuştur. Tam transcriptome mikroarrayler 1 ve RNA (RNA-seq) 2-4 daha yakın, yeni nesil sıralama gelişimi bu yaklaşım hızlandırdı. Bu teknolojilerin hücresel gen ifadesinin karmaşıklığı anlayışımızı devrim olsa da, onların şablon örnek doğal özelliklerine, yani toplam hücresel RNA nedeniyle önemli sınırlamalar karşı karşıya. RNA düzeylerinde İlk olarak, kısa vadeli değişiklikler transkripsiyon oranlarındaki değişimler maç, ancak RNA ilgili transkript yarı ömrü üzerinde doğal olarak bağımlı değildir. Bir transkripsiyon faktörü için kısa süreli bir transkript, örneğin kodlama beş kat indüksiyon, toplam RNA kolayca tespit olacak isebir saat içinde, bir metabolik enzim için uzun ömürlü transkript, örneğin kodlama aynı indüksiyon, neredeyse görünmez kalacaktır. Buna ek olarak, hatta bir kapatma (&gt; 1.000 kat yük atma) bir RNA beş saatlik yarılanma ömrü ile ortalama bir genin transkripsiyon oranı tam sadece sadece iki yönlü tarafından azaltmak için, toplam RNA düzeyleri için beş saat sürer . Bu nedenle, toplam RNA analizi düzenleme fonksiyonları 5 ile transkripsiyon faktörleri ve genler için kodlamak birçoğu kısa ömürlü transkript kadar düzenleme tespiti, yanadır. Ayrıca, düzenlemenin gerçek kinetik kaskad gizlenmiş ve birincil sinyal olaylar ikincil ayırt edilemez. Her ikisi de, sırayla, alt biyoinformatik analizler önemli sapmayla neden olabilir. İkinci olarak, toplam RNA düzeylerinde değişiklikler RNA sentezi ya da çürüme değişikliklere mal edilemez. Ikinci ölçümleri transcripti engelleme hücre invaziv yaklaşımlar, örneğin gerektiriraktinomisin D 6, ve zaman içinde devam eden RNA çürüme genişletilmiş izleme kullanarak. 5 memeli hücrelerinde ortalama mRNA yarı ömrü ile - 10 saat 5,7, en genlerin mRNA düzeyleri sadece iki kat transkripsiyonel tutuklama birkaç saat sonra daha az azalmıştır olacaktır. Bunlar, çok küçük farklar temel matematiksel denklem üslü doğası nedeniyle hücresel genlerin çoğu için mRNA&#39;nın yarı ömür kabaca kesin ölçümler ile sonuçlanabilir. Son olarak, süre toplam hücresel RNA RNA-seq genlerimizin yarısını yaklaşık alternatif yapıştırma olayları 8, temel kinetik hem de tam olarak anlaşılamamıştır kalır RNA işleme doku ve bağlama özgü düzenleme rehberlik dinamik mekanizmaları tabi olduğunu ortaya koydu. Buna ek olarak, RNA, özellikle katkı kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar için, belirlenecek kalır, diferansiyel gen ekspresyonu için işlem. Toplamda, bu sınırlamalar için önemli engeller temsilaltta yatan moleküler mekanizmaların biyoinformatik kinetik modelleme. Yakın zamanda bu sorunların 5,7,9 üstesinden gelmek için, olarak adlandırılan yüksek çözünürlüklü gen ekspresyon profili, bir yaklaşım geliştirdi. Bu, 4-thiouridine (4SU-etiketleme), doğal olarak oluşan üridin türev kullanarak yeni transkripsiyonu RNA metabolik etiketleme dayalı ve hücre büyümesi ve gen ekspresyon minimal girişim (bkz. Şekil 1) 5 ile yeni transkripsiyonu transkript doğrudan erişim sağlar 10-12. Hızla alımı, 4SU-trifosfat için fosforilasyon, ve yeni transkripsiyonu RNA içine dahil edilmesi 4SU sonuçlarına ökaryot hücrelerin maruz kalma. Toplam hücresel RNA izole edildikten sonra, 4SU-işaretli RNA fraksiyonu tiol-biotin ve özellikle yeni kopyalanan RNA arasında bir disülfid bağı oluşturma biyotinile olup. &#39;Toplam hücresel RNA&#39; ardından nicel (&#39;yeni transkripsiyonu&#39;) ve etiketsiz (&#39;öncesi existin etiketli ayrılabilirStreptavidin-kaplı manyetik boncuklar kullanılarak yüksek saflıkta G &#39;) RNA dır. Son olarak, etiketli RNA sadece disülfid bağ yarma bir indirgeyici madde (örneğin, ditiyotreitol) eklenmesi ve Tanelerden yeni kopyalanan RNA bırakarak Tanelerden geri kazanılır. Yeni transkripsiyonu RNA 4SU maruz kalma süre boyunca her genin transkripsiyonel aktivitesini gösteriyor. Dakika ölçeğinde 4SU-etiketleme böylece ökaryotik gen ifadesinin bir anlık görüntü ve aşağı akım biyoinformatik analizleri (promotor analizi) için ideal bir şablon sağlar. Kararlı durum koşulları kabul edilebilir durumda, oranları yeni transkripsiyonu / toplam, yeni transkripsiyonu / etiketsiz ve etiketsiz / RNA hassas RNA yarı ömrü 7,13 için non-invaziv erişim sağlar. Buna ek olarak, 4SU-etiketleme az 5 dakika (5 dakika 4SU-RNA) sonra arıtılmış bu yeni transkripsiyonu RNA dikkat etmek önemlidir 15 ve 60 dakika 4SU-RNA daha gençtir.RNA-seq ile birlikte tek bir deneysel ortamda 4SU-etiketleme ultra-kısa ve giderek daha uzun hem yaparken, RNA işleme kinetik nükleotid çözünürlükte 9 ortaya çıkar. Son olarak, sayısal modelleme ile birlikte yeni transkripsiyonu ve toplam RNA zaman tabii ki analiz RNA sentezi ve çürüme 14 entegre bir analiz sağlar. Sonuç olarak, bu yaklaşım, ökaryotik hücrelerde RNA sentezi, işleme ve bozulmanın dinamiklerinin doğrudan analizi sağlar. Bu memeliler, böcekler (Drosophila), amfibi (Xenopus), ve maya 5,15,16 dahil olmak üzere tüm büyük model organizmalarda geçerlidir. Bu mikroarray analizi 5,17, RNA-seq 9,13,14 ile doğrudan uyumludur, ve in vivo 12,15 uygulanabilir. Burada, detaylı metodoloji, etiket izole ve kültürlü memeli hücrelerinde yeni transkripsiyonu RNA arındırmak için. Ayrıca, potansiyometre olarakal sorunlar ve tuzaklar tartışılmıştır.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-thiouridine</td>
 <td>Carbosynth</td>
 <td>T4509</td>
 <td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 &deg;C in aliquots of 50-500 &mu;l, discard unused reagent, do not refreeze.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trizol</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td>
 <td>WARNING - CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>372978</td>
 <td>WARNING - HAZARDOUS TO HEALTH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isopropanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>650447</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate, nuclease-free</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8532</td>
 <td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5M nuclease-free NaCl</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>71386</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free H2O</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>W4502</td>
 <td>Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA precipitation buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>459844</td>
 <td>Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>51237</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15575-020</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Biotinylation Buffer (BB)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylformamide (DMF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link biotin-HPDP</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21341</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0032 005.152</td>
 <td>Optional for the chloroform extraction step.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeta membrane</td>
 <td>BIORAD</td>
 <td>162-0153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Dot blot binding buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-oligo</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>5'-biotin, 25 nucleotides, any sequence</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulphate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BPE9738</td>
 <td>For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 &deg;C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21333</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffer saline</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10010-015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dot blot blocking buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-horseradish peroxidase </td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>SA5004</td>
 <td>Store at -20 &deg;C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 &mu;l Streptavidin-HRP before use. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ECL reagent</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>RNP2109</td>
 <td>Use following the manufacturer's instructions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super RX, X-RA Film, 18x24 cm</td>
 <td>Fujifilm</td>
 <td>47410 19236</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&mu;Macs Streptavidin Kit</td>
 <td>Miltenyi</td>
 <td>130-074-101</td>
 <td>Store the beads at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P1379</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Washing buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>43817</td>
 <td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Store columns at 4 &deg;C, remaining components of the kit at room temperature.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.692.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.694.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV/VIS spectrophotometer</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>NanoDrop 1000</td>
 <td>Or equivalent. Use low volume (1-2 &mu;l) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene 15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>VWR International</td>
 <td>525-0153</td>
 <td>In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 &times; g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-25</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JLA-16250</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adaptors for 15 ml tubes</td>
 <td>Laborger&auml;te Beranek</td>
 <td>356964</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5430 R</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Thermomixer compact</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic stand</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-042-109</td>
 <td>One stand holds 8 &mu;Macs columns.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath</td>
 <td>Grant</td>
 <td>SUB Aqua 5</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultra-fine scale</td>
 <td>A&amp;D</td>
 <td>GR-202</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel iBase Power System</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G6400UK</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G4020-01</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

metabolic labeling of newly transcribed rna for high resolution gene expression profiling of rna synthesis, processing and decay in cell culture

Tam transcriptome mikroarrayler ve yeni nesil sıralama gelişimi hücresel gen ifadesinin karmaşıklığı anlayışımızı devrim yarattı. Tutulan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması ile birlikte, altta yatan kinetik hassas ölçümler giderek daha önemli hale gelmiştir. Burada, bu güçlü yöntemler şablon örnekleri de çalışma, yani toplam hücresel RNA içsel özellikleri nedeniyle önemli sınırlamalar karşı karşıya. Birçok durumda toplam hücresel RNA değişiklikler yeterli çözünürlüğe sahip temel moleküler olayları ve kinetik temsil etmek için ya çok yavaş ya da çok hızlı bir şekilde ortaya çıkar. Buna ek olarak, RNA sentezi, işlenmesi ve çürüme değişiklikler katkısı kolayca ayırt edilmez. Biz son zamanlarda bu sınırlamaları aşmak için yüksek çözünürlüklü gen ekspresyon profili geliştirdi. Yaklaşımımız 4-thiouri ile yeni transkripsiyonu RNA metabolik etiketleme dayanmaktadıryemek (böylece de 4SU-etiketleme olarak anılacaktır) tiyol-spesifik bir biotinilasyon ve Streptavidin-kaplı manyetik boncuklar kullanılarak yeni kopyalanan RNA arasında sıkı bir arıtma takip eder. Bu, omurgalılarda, Drosophila ve maya da dahil olmak üzere bir organizma geniş için de geçerlidir. Biz başarılı, transkripsiyon faktörü faaliyetlerinin gerçek zamanlı kinetik çalışma RNA yarı hayatımızın hassas ölçümler sağlamak ve RNA işleme kinetik yeni bakış açıları elde etmek için 4SU-etiketleme uygulanır. Son olarak, sayısal modelleme altta yatan moleküler mekanizmaları entegre, kapsamlı bir analiz oluşturmak için kullanılabilir.

1. Başlangıç ​​Malzeme ve Beklenen Verim 4SU-maruz kalma 1 saat (saat) ardından yeni transkripsiyonu RNA yaklaşık 1 temsil - toplam hücresel RNA 4%. Artık hücre büyümesi / çoğaltma için hesaba RNA sentezi gibi bu büyüme-tutuklandı hücrelerde daha düşük olacaktır. Toplam RNA 80 mg - 1 saat etiketleme, biz 60 ile tahlil başlayan tavsiye. Biyotinilasyon adımdan sonra görmek zor olan küçük RNA pelet toplam RNA sonuçların az 30 mikrogram ile başlayan ve bu nedenle ...

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture at JoVE.com

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Toplam hücresel RNA, kısa vadeli RNA sentezi ve çürüme değişikliklerin yanı sıra, RNA işleme kinetiğini incelemek için kötü bir şablon sağlar. Burada, 4-thiouridine ile yeni kopyalanan RNA metabolik etiketlenmesi tarif, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için izin veren yeni transkripsiyonu RNA tiyol-spesifik bir biotinilasyon ve saflaştırma takip etti.

Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

metabolic-labeling-newly-transcribed-rna-for-high-resolution-gene

Research

JoVE Journal

Biology

27.0K Görüntüleme.  Max von Pettenkofer Institute. Toplam hücresel RNA, kısa vadeli RNA sentezi ve çürüme değişikliklerin yanı sıra, RNA işleme kinetiğini incelemek için kötü bir şablon sağlar. Burada, 4-thiouridine ile yeni kopyalanan RNA metabolik etiketlenmesi tarif, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için izin veren yeni transkripsiyonu RNA tiyol-spesifik bir biotinilasyon ve saflaştırma takip etti.

Video: Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biyoloji

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile<em&gt; İn Vitro</emAdiposit Kültür&gt; RNA pull-down

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...