Bu eser desteklenen bir SC INBRE hibe--dan Ulusal Enstitüsü genel tıp bilim - NIH (RG P20GM103499) ve CA555536 & CA154664 P.H.H. için Ulusal Kanser Enstitüsü'nden verir Bu program kısmen araştırma kaynakları (5 P20 RR016461) Howard Hughes tıp Enstitüsü öncesi üniversite ve lisans bilim eğitim programı aracılığıyla Charleston Koleji için bir hibe ve hibe Milli Merkezi tarafından desteklenen yapıldı. ve Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (8 P20 GM103499) ulusal sağlık Enstitüleri üzerinden.

1. Kültür ve metabolik etiketleme
<ol><li>Bir kez bir steril 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri kap ortasına doğru havalandırma izin vermek için bir 18'lik iğne ile poke. İlave steril 7 h 9 500 µL aşılamak suyu M. smegmatis 5 µL bir marş--dan ile Kültür yetişkin gece12. Not: Tarifi için bir 7H 9 litre suyu: 4,7 g ticari 7H 9 tozu, 2 mL gliserol, 1 mL Tween 80, 0,85 g NaCl, 5 g Albumin, 2 g dekstroz, (Toplam hacim 1 M'ye getirmek için) H2O.<ol>
<li>
(Dikkat) Standart radioprotection yöntemleri 20 µCi/mL [32P] Na2HPO4kültür ortamıyla spike. Bakteri bir 9 mm kalınlığında akrilik kalkanın arkasında yerleştirilen bir shaker kuluçka 37 ° C ve 1200 rpm ajitasyon, büyümek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Midlog aşamasında (O.D.600 nm ~ 0.5), tüm kültür 2 mL vida-Kapiler tüp içine aktarmak ve 10.000 x g., 2 dk toplamak için süpernatant içeren unincorporated radyoaktif orthophosphate içinde oda sıcaklığında radyoaktif bakteri centrifuging tarafından cips uygun atık konteyner.</li>
</ol>2. Toplam RNA'ların hazırlanması
Not: Toplam RNA'ların (guanidinium thiocyanate, fenol ve kloroform içeren) ticari bir RNA ayıklama reaktif kullanarak bakteriyel çökeltilerini ayıklanır üreticinin protokol sonrası.
<ol><li>1 mL ticari RNA ayıklama reaktif ve yaklaşık 200 µL cam boncuk Pelet üzerine ekleyin. Tüp güvenli bir şekilde kap ve bir homogenizer en fazla ajitasyon altında 2 min için bakteriyel bozabilir (beş numaralı seçilen araç üzerinde ayarlama ( Tablo reçetesigörmek)).</li>
	<li>Santrifüj örneği 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika ' Yeni bir 2 mL tüp süpernatant aktarım ve boncuklar uygun şekilde atın. Kloroform 0.2 mL ekleyin ve tüp el ile 12.000 x g de 15 s. santrifüj 4 ° C'de 15 dakika için shake şiddetle</li>
	<li>Sulu faz örnek yeni bir tüp içine tüp 45 ° de olta balıkçılığı toplamak. Interphase veya organik katman çizim kaçının. 2 renkli precipitant µL ve % 100 isopropanol 0.5 mL ekleyin. Tüp el ile 12.000 x g de 5 s. santrifüj 4 ° C'de 10 dakika için shake şiddetle</li>
	<li>Tüm tüpünden süpernatant kaldırmak ve uygun şekilde atın gibi sıvı kesir radyoaktivite izleri içerebilir. 5 min için Kuru Pelet hava sonra 200 µL serum sodyum sitrat (SSC), % 0,1 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) son X 2 resuspend. Not: Stok 20 bileşimi X SSC 3,0 M NaCl, 0,3 M sodyum sitrat, pH 7,0 olduğunu.</li>
</ol>3. 96 iyi yazıcı plakaları hazırlanması
Not: tRNA microarrays el ile kırk iki 70-mer DNA oligonucleotides 3' sonuna bir 8-pin arrayer kullanarak (terminal CCA hariç) her M. smegmatis tRNA tamamlayıcı birlikte yazdırılır. DNA Oligonükleotid probları yanı sıra iyi plaka ve dizi sonda düzende dizilerini sağlanır (ek dosya 1 - sayfa 1-3 sırasıyla).
<ol><li>Tasarım DNA ilk alınırken tRNA dizileri veya genomik tRNA gibi tRNA veritabanlarındaki tRNA kodlama genler tarafından veritabanı13sondalar. Söve korunmuş 3' ucu kodladıysanız CCA. Tamamlayıcı elde edilen sıra ters. Sipariş sonda üzerinde ilk 70 nükleotit dayalı.</li>
	<li>Kuru DNA probları suda resuspend. Probları konsantrasyon 100 µM için ayarlayın. 96 bir şey-tabak içinde 3 X SSC, %0.01 (w/v) SDS final (seyreltik 60 µL bireysel iyi hisse senedi probları,-ile 6 X SSC'yi destek veriyor, %0.01 (w/v) SDS 60 µL. 50 µM oligos 120 µL hazırlamak</li>
	<li>Plaka folyo buharlaşma veya kontaminasyonu önlemek, hemen donma ve -20 ° C de ihtiyaç kadar tutmak için kapağı.</li>
</ol>4. dizi yazdırma
<ol><li>96-şey plaka (yaklaşık 20 dakika sürer) oda sıcaklığında erimek.</li>
	<li>Amin kaplı cam slaytlar bir elmas kalemi ile etiketleyin. Slaytlar dizin oluşturma birim içine yerleştirin. Kılavuz yerleşimler izleyin ve aşağıdaki gibi yapın.<ol>
<li>Dikkatle Wells Çoğalıcı iğne batır.</li>
		<li>Yavaşça dizi en az basınç (küçük bir direnç hissedeceksiniz) kullanarak cam slaytlarda yazdırın. Blok a ile bitene arrayer temizlemeden yazdırmaya devam etmek</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hazır olduğunuzda sonraki bloğa geçmek, aşağıda açıklanan çamaşır yordamı izleyin.<ol>
<li>Çoğalıcı %5 çamaşır suyu daldırma ve hafifçe çalkalanır.</li>
		<li>Çoğalıcı emici kağıt basın.</li>
		<li>Çoğalıcı distile su içinde daldırma, yavaşça sallayın ve kağıt basın. Bir kez bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Çoğalıcı isopropanol içinde daldırma, yavaşça sallayın ve kağıt basın.</li>
		<li>Çoğalıcı yaklaşık 20 için fan üzerinde kuru s 96-şey plaka sonraki bloğuna geçmeden. Parmak izi istediğiniz sayıya devam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slaytların crosslink oligos 254-nm UV crosslinker kullanarak slayt için Kuru izin.<ol>
<li>Enerji seviyesi 999,990 µJ/cm2olarak ayarlayın.</li>
		<li>Crosslinker temiz bir yüzey üzerinde slaytlar yüz koy. "Başlat" tuşuna basın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir manyetik karıştırıcı, oda sıcaklığında ve yavaş ajitasyon altında çözüm engelleme 450 mL gecede dizide engelleyin. Toplamak ve dört kat engelleme çözüm yeniden. Not: Engelleme çözüm için reçetedir: 125 mM fosfat tampon (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, %2.25 SDS (w/v), 0,5 mM EDTA, 0.5 X SSC, % 1 BSA (w/v).</li>
	<li>500 mL distile su içinde oda sıcaklığında 2 kez 5 min için slaytlar yıkayın. Slaytlar için 10 centrifuging tarafından kuru s Mikroarray santrifüj oda sıcaklığında. Mağaza diziler için 6 aya kadar kuru ve karanlık bir yerde.</li>
</ol>5. dizi hibridizasyon
<ol><li>Hibridizasyon için önceden slaytlar kaynar suda yıkayın ve tarafından Santrifüjü (4.6) olduğu gibi kuru.</li>
	<li>Dizi içinde hibridizasyon kaset yerleştirin ve radiolabeled RNA örnek yükleyin.</li>
	<li>Otomatik hibridizasyon yıkama istasyonu maksimum tekrarlanabilirlik için çalıştırın.<ol>
<li>Program aşağıdaki adımlardan. 75 ° C'de 2 min için koşul contalar 60 ° C'de sonda tanıtmak Sonda ve örnekleri 5 dk 90 ° C'de denatüre 60 ° C'de 3 h için örnekleri melezlemek<ol>
<li>Slaytları 2 X SSC, % 0,1 (w/v) SDS, akış 10 s ile iki kez 50 ° C'de yıkama ve 20 s. 0.1 X SSC, % 0,1 SDS, akış 10 s ile iki kez 42 ° C'de yıkama slaytlar ve iki kez 0.1 ile 42 ° C'de 20 s. yıkama slaytlar tutun tutun X SSC , akış 10 s ve tutun 20 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuru slayt Santrifüjü (olduğu gibi 4.6) tarafından.</li>
</ol>6. dizi miktar
<ol><li>İnce bir plastik film kullanarak slaytları sarın. Bir gayger sayacı onun en hassas ayarı kullanarak radyoaktif sinyali slaytlarını denetleyin. Slaytlar bir pozlama kaset, oda sıcaklığında 10-90 h bağlı olarak sinyal gücü için bir depolama fosfor ekrana maruz. Not: Geiger sayaçları duyarlılığını farklı olarak bir enstrüman diğerine, pozlama süreleri ampirik olarak optimize edilmiş olması gerekir.</li>
	<li>Slayt bir phosphorimager kullanarak 50 µm çözünürlükte tarama. Ölçmek ve radyoaktivite Koyulukları Mikroarray profiler ile yükseltilmiş ücretsiz görüntü J yazılımını kullanarak her sonda spot arka plan çıkarma.</li>
	<li>Düzenleyebilir ve bir elektronik tablo kullanarak verileri işlemek. Koşullu biçimlendirme aracını kullanarak ısı haritaları oluşturmak. Örneğin her sonda sinyal (‰ ifade edilir) bir kesir olarak toplam sonda sinyalinin temsil eder.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli.">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).</li><li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+over-expression+in+breast+cancer+and+functional+consequences.">tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).</li><li>Gieg&#233;, R., J&#252;hling, F., P&#252;tz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+transfer+RNAs:+similarity+and+variability.">Structure of transfer RNAs: similarity and variability.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).</li><li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs.">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li><li>Torres, A. G., Pi&#241;eyro, D., Rodr&#237;guez-Escrib&#224;, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-L&#233;ger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inosine+modifications+in+human+tRNAs+are+incorporated+at+the+precursor+tRNA+level.">Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level.</a> Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).</li><li>Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Mar&#233;chal-Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+evolution+and+expression+of+Chlamydomonas+reinhardtii+nucleus-encoded+transfer+RNA+genes.">On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes.</a> Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).</li><li>Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+quantitative+high-throughput+tRNA+sequencing.">Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing.</a> Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOt:+A+novel+and+streamlined+microarray+platform+for+observing+cellular+tRNA+levels.">SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels.</a> PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).</li><li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST,+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases.">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-&#946;-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression.">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-&#946;-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li><li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis.">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li><li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GtRNAdb:+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence.">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li><li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli.">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li></ol>

Hiçbir çıkar çatışması ilan etti.

Ürünü test aralığındaki hücre fitness üzerinde önemli etkisi yoktur ancak beta parçacık emisyonları bakteriyostatik ve bakteri yok edici ajanlar14, bilinir. Mercek sayma radyoaktivite toplam-hücre özleri % 25'i ve daha sonra saf toplam RNA'ların % 1'i dahil gösterdi.
Probları aynı boyutlarda, karşılaştırılabilir erime sıcaklığı ve GC içeriğiyle macroarray lekelenme için Tekdüzen bir protokol hibridizasyon ve miktar tarafsız tRNA düzeylerinden spot sinyalleri doğrudan ölçümü için sağlar.
Tekrarlanabilir ve belirli bir noktadır. Onun geniş dinamik alan ve kolayca ayarlanabilir eşiği düşük gibi bol türlerin, sadece dizi pozlama kez9uzatan tarafından polizomlar ile ilişkili tRNA profil oluşturma sağlar. Sonra ilk yatırım için gerekli ekipman, sarf malzemeleri, dahil olmak üzere örnek maliyet çalışan $15-de örnekleri ortalamasını alır.
Nokta olan genom araştırma tasarımı için kullanılabilir herhangi bir organizma için geçerlidir. Vitro yetiştirilmektedir model organizmalar metabolik etiketleme için ideal aday olur. Memeli genleri genellikle birçok isodecoders (tRNA aynı anticodons paylaşmak, ancak onların vücut sekanslarında küçük farklılıklar görüntülemek) kodlamak gibi probları yakın tRNA türler homojen hibridizasyon korumak için kısmen dejenere olması gerekir. Son olarak, yapisan memeli hücreleri toplam RNA kültürleri önemli ölçüde ölçeklendirilmesi gereken süspansiyon gibi M. smegmatis, sonrasını organizmalar göre genellikle daha düşük miktarlarda verim.

Hücre tipi, çevre ve stres1,2,3gibi koşullara göre hücresel tRNA seviyeleri dalgalanma. Nokta, tRNA, gözlemlemek için aerodinamik Platform bir özgün, güvenilir ve laboratuvar yetiştirilen organizmalar transfer RNA düzeylerinin hızlı ve hassas miktar sağlar basit tekniği dir.
tRNA son derece kararlı ikincil ve üçüncül yapıları4var. Bunlar da çok sayıda çoğu değişiklikler5görüntüler. Bu özellikler önemli yapısal ve kutuplama ya da bazen doğrudan ve tekrarlanabilir standart kıyaslama RNA miktar teknikleri6kullanarak tRNA profil oluşturma önleyerek sıra yollara barikat temsil eder. Araştırma grupları dünya çapında hücresel tRNA düzeylerini değerlendirmek için yaratıcı ama kez kıvrık teknikleri geliştirmek zorunda kaldılar. Bu yöntemlerden bazıları şunlardır: (1) iki boyutlu elektroforetik ayrımı metabolik olarak etiketli tRNA kombine metodik nokta atama ile Kuzey leke1tarafından; (2) Kuzey tarafından bireysel miktar leke dikkatle standart radyoaktif DNA probları7kullanarak; (3) sonrası ayıklama siyanür fluorochromes ile etiketleme ardından Mikroarray analiz3ve (4) vitro rekombinant demodification enzimler ters transkripsiyon ile kombine ve sonraki kullanarak tRNA değişiklikler sıyırma yüksek işlem hacmi sıralama8.
Basit ve özgün birleşimi iki standart ve basit yaklaşım bir noktadır: organizmalar, radyoaktif toplam RNA'ların ve (2) tRNA macroarrays, sistematik ve kırılan genomik aracı büyüyen sentez, oluşan etiketleme, (1) RNA vücut tRNA ayrımı için en iyi duruma getirilmiş.
Örnekler canlı organizmalar miktar platforma aerodinamik. Onlar doğrudan çıkarma sonra analiz edilir ve önyargıları sonrası ayıklama amplifikasyon veya enzimatik tedavi gerektiren teknikleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde sınırlayan daha fazla işlenen değil. Nokta çok yönlü ve kolayca tanımlamanıza ve ribozomlar çeviri ile fiziksel olarak ilişkili tRNA altgrupları ölçmek için polysome ayırma için kombine edilebilir.
Burada sunulan protokolü Mycobacterium smegmatisiçin optimize edilmiş ve o da başarıyla profil tRNA Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10, fare ve insan hücre kültürleri11 için kullanılan .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass slide indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide arrayer replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash and blot station</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replicator pin dryer</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coated slides</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>K2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridizer / Automated hybridization and washing station</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>Hyb10022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Eppendorf Themomixer</td>
			<td>05-400-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap 2 ml tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21-403-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[32P] Na2HPO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX011001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm glass beads</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>9831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini bead mill</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphore screen</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>BAS-IP SR 0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Typhoon FLA7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>Select series 254 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray centrifuge</td>
			<td>Arrayit Corporation</td>
			<td>MHC110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>700084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use needles</td>
			<td>BD (Becton Dickinson)</td>
			<td>305185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-666-317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precipitant (GlucoBlue)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridisation cassette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>63-0035-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M126-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>A3611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Phosphate buffer pH 7.2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ63974AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays

Transfer RNA (tRNA) genellikle 76-90 nükleotid uzunluğunda olan bol kısa kodlamayan RNA türü bulunmaktadır. tRNA, mRNA içinde kodon amino asit dizileri haline çevirerek protein sentezi için doğrudan sorumludur. tRNA uzun düzenleyici fonksiyonları yoksun ev tutma molekül olarak kabul edildi. Ancak, kanıt büyüyen bir vücudun hücresel tRNA düzeyleri değişen koşullara hücre tipi, çevre ve stres gibi yazışma dalgalanma gösterir. TRNA ifade dalgalanma lehine veya ifade belirli proteinlerin bastırmak gen çeviri, doğrudan etkiler. Sonuçta protein sentezi dinamik kavrama yöntem yüksek kaliteli tRNA profilleri teslim etmek mümkün geliştirme gerektirir. Burada mevcut yöntemi için aerodinamik Platform için gözlem tRNA standları yer almıştır. Hücre kültürleri radyoaktif orthophosphate, radyoaktif toplam RNA'ların guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform çıkarma tarafından takip ile metabolik etiketleme ile başlayan üç adım nokta oluşur ve nihayet hibridizasyon in-house Tarih baskılı macroarrays. tRNA düzeyleri her sonda spot radyoaktivite Koyulukları miktarının tarafından tahmin edilir. Burada sunulan protokolünde Mycobacterium smegmatis mc2' de 155, sık sık bir model organizma tüberküloz çalışırdım nonpathogenic bir bakteri tRNA profil.

Üç bağımsız biyolojik, test büyüme koşullarda tüm M. smegmatis tRNA arka plan seviyesinden (şekil 1) ifade edilir göstermek çoğaltır. Belirli bu deneyde %2 (Arg (TCT)) ve medyan (şekil 1) % 5 ile % 22 oranında (Cys (GCA)) arasında gözlenen standart sapma her sonda için oluşur. Yanlış değişiklikleri çoğaltır arasında önemli ölçüde dizi hazırlık ve hibridizasyon gibi faktörlerden etkilenmektedir. Gibi örnek hibridizasyon otomatik yüksek tekrarlanabilirlik dikkatli ve tutarlı dizi baskı yoluyla elde edilir. TRNA arasında 5-fold fark Ile (GAT) ve tRNA (Val (TAC), en yüksek ve en düşük bol türler anılan sıraya göre. Nokta tRNA isoacceptors ifade tek tip olmadığını gösteriyor. Isoacceptors aynı amino asit tutun ancak farklı antikodon sıralarını görüntülemek ve bu nedenle farklı kodon mRNA'ların üzerinde kod çözme türü bulunmaktadır. Örneğin, tüm alanin isoacceptors benzer düzeyde ise ifade edilir kabul tRNA farklı tarafından 3-fold en yüksek ve en düşük arginin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> Şekil 1: temsilcisi tRNA macroarray sonuçları. (A) taranan bakteriyel, fare ve insan macroarrays. M. smegmatis diziler sadece 43 Probe prob 48 yerine fare ve insan için kullanın. Sonuç olarak, bakteriyel dizi arka plan ile Harman (probları her dizi üzerinde sekiz kez yinelenir) 40 boş noktalar görüntüler. Bunların çoğu sol üst köşesinde kümelenir. (B) çubuk grafik ve heatmap temsilleri M. smegmatis tRNA profillerinde optimal büyüme koşullar altında. Sonda sinyalleri üç bağımsız deneyler (dahil Bakteriyel büyüme, metabolik etiketleme, ayıklama ve dizi hibridizasyon) ortalama ve toplam tRNA bin değerleri başı olarak ifade edilir. Üç çoğaltır için standart sapmalar hata çubukları ve çubuk grafik ve heatmap turuncu tonları olarak sırasıyla belirtilmiştir. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays at JoVE.com

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Biz orijinal bir transfer RNA analizi platformu nokta (akıcı tRNA gözlemlemek için Platform) adlı tanımlamak. Nokta aynı anda hücresel düzeyde tüm tRNA biyolojik örnekleri, sadece üç adım ve 24 saatten az bir süre ölçer.

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

metabolic-labeling-and-profiling-of-transfer-rnas-using-macroarrays

Research

JoVE Journal

Genetics

5.8K Görüntüleme.  College of Charleston. Biz orijinal bir transfer RNA analizi platformu nokta (akıcı tRNA gözlemlemek için Platform) adlı tanımlamak. Nokta aynı anda hücresel düzeyde tüm tRNA biyolojik örnekleri, sadece üç adım ve 24 saatten az bir süre ölçer.

Video: Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Genetik

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. Here, we present a method to selectively up-regulate protein expression of desired genes in cultured cells by means of synthetic antisense non-coding RNAs known as SINEUPs. This positive control of gene expression is at the post-transcriptional level and exerted by an inverted short interspersed nuclear element (SINE) repeat at the 3&#697; end of SINEUPs that comprises its effector domain (ED). SINEUPs can specifically bind to any protein-coding mRNA of choice through its binding domain (BD), a region designed to complement the sequence within the 5&#697; untranslated region (5&#697; UTR) and around the start codon of the mRNA. Target-specific SINEUPs designed in this manner are transfected to cultured cells, and protein and RNA are extracted for downstream analyses, generally 24-48 h post-transfection. SINEUP-induced protein up-regulation is detected by Western-blot analysis and RNA expression is measured using real-time quantitative reverse transcription PCR. We have observed that BD design is critical for achieving optimum SINEUP activity and that testing different BD sizes and positions with respect to the start codon of the target mRNA is recommended. Therefore, we describe here a semi-automated high-throughput imaging method based on fluorescence detection that can be implemented to target mRNA fused with green fluorescent protein (GFP). SINEUPs specifically enhance translation within normal physiological range of the cell, without altering the target transcript level. This method has been successfully employed against a range of endogenous and exogenous targets, in a wide variety of human, mouse, and insect cell lines along with in vivo systems. Moreover, SINEUPs have been reported to increase antibody production and work as an RNA therapeutic against haploinsufficient genes. The versatile and modular nature of SINEUPs makes them a suitable tool for gene-specific translational control.

SINEUPs are synthetic antisense non-coding RNAs, which contain a binding domain (BD) and an effector domain (ED) and up-regulate translation of target mRNA. Here, we describe detection methods for SINEUPs in cultured cell lines, analysis of their translation-promoting activity by Western-blot and a semi-automated high throughput imaging system.

Özellikle mRNA çeviri geliştirebilirsiniz RNA'ların kodlamayan SINEUP deneyleri bağlı hücre

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since 2007. These studies have confirmed that lncRNAs are altered in almost all diseases. However, studying the functional roles for lncRNAs in the context of disease remains difficult due to the lack of protein products, tissue-specific expression, low expression levels, complexities in splice forms, and lack of conservation among species. Given the species-specific expression, lncRNA studies are often restricted to human research contexts when studying disease processes. Since lncRNAs function at the molecular level, one way to dissect lncRNA biology is to either remove the lncRNA or overexpress the lncRNA and measure cellular effects. In this article, a written and visualized protocol to overexpress lncRNAs in vitro is presented. As a representative experiment, an lncRNA associated with inflammatory bowel disease, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), is shown to be overexpressed in a Jurkat T-cell model. To accomplish this, the activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technique is used to enable overexpression at the endogenous genomic loci. The activating CRISPR technique targets a set of transcription factors to the transcriptional start site of a gene, enabling a robust overexpression of multiple lncRNA splice forms. This procedure will be broken down into three steps, namely (i) guide RNA (gRNA) design and vector construction, (ii) virus generation and transduction, and (iii) colony screening for overexpression. For this representative experiment, a greater than 20-fold enhancement in IFNG-AS1 in Jurkat T cells was observed.

Traditional cDNA-based overexpression techniques have a limited applicability for the overexpression of long noncoding RNAs due to their multiple splice forms with potential functionality. This review reports a protocol using CRISPR technology to overexpress multiple splice variants of a long noncoding RNA.

Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein interactions, and regulation of parental gene transcription. In classical next generation RNA sequencing (RNA-seq), circRNAs are typically overlooked as a result of poly-A selection during construction of mRNA libraries, or are found at very low abundance, and are therefore difficult to isolate and detect. Here, a circRNA library construction protocol was optimized by comparing library preparation kits, pre-treatment options and various total RNA input amounts. Two commercially available whole transcriptome library preparation kits, with and without RNase R pre-treatment, and using variable amounts of total RNA input (1 to 4 &#181;g), were tested. Lastly, multiple tissue types; including liver, lung, lymph node, and pancreas; as well as multiple brain regions; including the cerebellum, inferior parietal lobe, middle temporal gyrus, occipital cortex, and superior frontal gyrus; were compared to evaluate circRNA abundance across tissue types. Analysis of the generated RNA-seq data using six different circRNA detection tools (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC, and CIRCexplorer) revealed that a stranded total RNA library preparation kit with RNase R pre-treatment and 4 &#181;g RNA input is the optimal method for identifying the highest relative number of circRNAs. Consistent with previous findings, the highest enrichment of circRNAs was observed in brain tissues compared to other tissue types.

Circular RNAs (circRNAs) are non-coding RNAs that may have roles in transcriptional regulation and mediating interactions between proteins. Following assessment of different parameters for construction of circRNA sequencing libraries, a protocol was compiled utilizing stranded total RNA library preparation with RNase R pre-treatment and is presented here.

RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNA'ların Tanımlanması

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...