1.. Kardiyomyosit İzolasyon Malzeme (Şekil 1) Forseps Microdissecting Doku forseps Narin hemostatik forseps Hemostatik forseps Microdissecting, tırtıklı, kavisli forseps Çalışma makas, düz Çalışma makas, kavisli 15 ml Falcon tüpleri (5) 60 mm Petri Fosfat Tamponlu Salin (PBS) Naylon Mesh - 400 mikron gözenek boyutu Küçük huni Balmumu kaplı, örgülü ipek 4-0, 19 mm uzun, 7-10 cm Non-derialtı iğne, küt uç, 24 G veya ticari hayvan besleme iğne (W/1-1/4, 24 x 1) Heparin sodyum Ketamin / ksilazin karışımı Pasteur Pipetler OptiVision Diseksiyon Goggles IonOptix MMSYS sistemi Not: hücreleri kültür ise, bu protokolü başlamadan önce hücre kültüründe 2. kısmına bakınız. Not: Tüm fareleri için bakımonaylanmış IACUC düzenlemeleri, uygulamaları ve prosedürlerine göre bir bariyer tesisi ve kurban. Not: Ön işleme başlamadan için, tüm sistemin Langendorff sistemine (Şekil 2A, Şekil 3) tüm öğeleri uygun ve eksiksiz kolajenaz aktivitesi sağlamak için 37 ° C&#39;ye ısıtıldı sağlamak için önceden ısıtılmış olmalıdır. <ol><li> 150 USP birimleri karın boşluğu içine heparin sodyum erişkin fareler (~ 12 hafta) enjekte edilir. </li><li> Bir kilo bağımlı doz (Tablo 1), bir ketamin / ksilazin karışımı bir enjeksiyon ile anestezi. <ol><li> 80:12 mg / kg ketamin: ksilazin tarifi: 2.6 ml ketamin (100 mg / ml) + 0.4 ml ksilazin (100 mg / ml) + 37 ml PBS. Nihai: ketamin = 6.5 mg / ml; xylazine = 1 mg / ml </li></ol></li><li> , Işletme ped sedasyon fareyi Güvenli kalp kesip, ve bir oda sıcaklığı PBS tabak veya% 0,9 tuz (Şekil 1J) içine yerleştirin. Physiologic tuzlu dokunulmamış kalp odası içinde kan daha iyi ekstrüzyon ve 1,6 aşamasından önce aort kolay tanımlama için sözleşme sağlar. Fareler onlar derinden arka bacak ayak tutam refleksi ve önceki torakotomi başlangıcından solunum hızının yavaşlaması kaybı ile anestezi sağlamak için kontrol edildi. </li><li> Aorta belirlemek ve maruz OptiVision diseksiyon gözlük (Şekil 1A) kullanın. Aort kökü açıkça görülebilir olup olmadığını kabın vizüalizasyon yapar, ancak, aort etrafındaki doku çıkarma hücre izolasyonu optimizasyonu için gerekli değildir. </li><li> Prime perfüzyon tamponu ile pompa (Tablo 2). Sıcaklık kullanılarak prosedür uzunluğu boyunca 37 ° C ısıda tutulur gereken bir su banyosu (Şekil 2B) dolaşan, kontrol edilir. </li><li> Langendorff cihazına (Şekil 2A) üzerine kalp monte edin. İki mikro diseksiyon forseps (Şekil 1D-E) kullanılarak, pruzak ucunda silikon tüp ile non-derialtı, künt uç iğne (24 G) etrafında aort ime. Alternatif olarak (W/1-1/4, 24 x 1), ticari hayvan besleme iğne kullanılabilir. 24 G iğne ya da hayvan besleme iğnesi üzerindeki silikon tüp oluk üzerinde dikiş güvenliğini sağlayacaktır. Bir çorap gibi iğne aorta yerleştirin. (Şekil 2C). <ol><li> Not: Bu ciddi olacak gibi, sol ventrikül içine aort kapağı boyunca uzanan olmadığı iğnenin ucu ideal doğru innominat için aort kökü distalinde, aortta aittir emin olmak önemlidir, ancak etkin bir şekilde koroner arter üzerinden kalbinden serpmek için tampon yeteneğini sınırlar. </li></ol></li><li> Kravat doğru innominat arter altında, çıkan aorta düzeyinde olduğunu sağlanması, aortun üst etrafında (7-10 cm uzunluğunda) sütür ipek küçük bir uzunluğu (Şekil 1K) bağlayarak iğneye kalp Securey, ancak iğnenin ucu üzerindedir. </li><li> Uygun bir ortam sıcaklığını korumak için konik camın iç (Şekil 2B) içine kalp indirin. </li><li> 1 ml / dk &#39;lık bir hızda 5 dakika boyunca perfüzyon tamponu ile kalp serpmek ve perfüzyon konik cam toplamak ve kalp zarf izin vermek için cam odacık çıkış kelepçe. Kalp sindirim için, Şekil 3&#39;te şematik olarak gösterilmiştir. <ol><li> Bu noktada kalp artışın hacmi görmelisiniz. Buna ek olarak, kalp dokusundaki kan doku solgunluk neden perfüzat ile değiştirilecektir. </li></ol></li><li> Perfüzat drenaj çıkış kelepçeyi çözün. Enzim tampon kabın (Şekil 2E) perfüzyon tampon haznesinden boru taşımak için bir pompa durdurun. 1 ml / dk da enzim tamponu (Tablo 2) ile kalp serpmek başlamak için pompayı yeniden başlatın. Enzim tampon zarf izin vermek için tekrar çıkış kelepçekalp. <ol><li> Burada, enzim, perfüze kalp ve bağ dokusu sindirerek olduğu gibi, kalp soluk olur ve yapısal bütünlük azalacaktır. </li><li> , Sindirilmiş kalpten ventrikülleri kesilmiş konik camdan kalbi kaldırın, forseps ile yavaşça kalp sıkmak ve küçük bir Petri kabındaki Perfüzatın birkaç damla toplamak ve tek bir hücre bırakarak olup olmadığını görmek için kontrol etmek için zaman belirlemek için . </li><li> Acemi için bir manometre ile perfüzyon hattı bağlamak için yararlı olduğunu. Kalp sindirilir oluyor zaman bağ dokusu direncini tutmaz gibi basınç hızla azalacak. Manometre iğnenin konumunu aort kapağının olup ventrikülde olduğundan emin olmak için, aynı zamanda acemi için yararlıdır. Düşük basınç iğne ventriküler odası olan ve yüksek basınç iğne valfı temas olduğunu göstermiştir olduğunu gösterir. </li></ol></li><li> Bir çanak içine kalpten ventriküller Cutventrikül basınç size perfüzeye tek hücreleri görmek mümkün olduğunda önemli ölçüde düşmesi veya başladığında transfer tampon (A) (Tablo 2) dolu. Bu genellikle ~ 7-10 dakika sürer. </li><li> Yine (Şekil 1C) mikro diseksiyon forseps kullanarak, ayırmak için küçük parçalar halinde ventrikülleri kıyma. Başarılı bir sindirim dokusunun en ayrışma üzerine amorf olmasıyla birlikte, kıyma sonra doku neredeyse hiç katı topakları bırakacaktır. <ol><li> Ayrıca, doku ayırmak ucu bir ~ 45 ° açıyla kesilmiş olmuştu hangi bir plastik Pasteur pipet (Şekil 4) kullanılarak in / out çözüm pipetle için. Bu modifikasyon, doku ezilir olarak pipet böylece hücrelerde kesme stresi miktarını azaltarak iç çap alanı artırmak için hizmet eder. </li><li> Forseps ile doku diseksiyon önce bireysel odaları ayırmak ve ayrı ayrı atriyal, sol ventrikül veya righ ayırmak mümkündürt ventriküler hücreler. </li></ol></li><li> Kelepçeler kullanarak küçük bir huni (Şekil 1L) için kareli örgü (Şekil 1M) Güvenli ve bir 15ml Falcon tüp (Şekil 1i) içine bu filtreleme cihazı yerleştirin. </li><li> Çanak hücre çözümü kaldırmak ve Falcon tüpüne çözelti filtre değiştirilmiş Pasteur pipet kullanın. </li><li> (Canlı hücre sedimantasyon 2-4 dakika sürer) canlı hücrelerin tüp dibe çökmesine izin verin. </li><li> 4 ayrı 15 ml Falcon tüpleri içine dört kalsiyum çözeltiler (Tablo 3) her birinin kısım 2.5 ml. </li><li> Yine, standart bir Pasteur pipeti kullanılarak, dikkatli bir şekilde borunun altından hücre pelletini kaldırmak ve kalsiyum çözeltiler ilk hücreleri aktarın. </li><li> Hücreler son çözelti haline gelene kadar hücreler tüp dibe ve sonraki kalsiyum Çözeltilerin adımı 1.17 tekrar izin verin. </li><li> Hücreler FOURT yerleşmek izin vermeyinh kalsiyum çözeltisi. Tüp kap ve yan çevirin. </li></ol> 2. Hücre Kültürü <ol><li> Izolasyon, levha 1 ug / ml fare doğal cam kapak slipleri üzerine laminin ve 37 ° C&#39;de en az 1 saat boyunca inkübe edilir ve% 2 CO2 önce. Ayrıca, kaplama ve kültür ortamı (Tablo 4), 37 ° C&#39;de inkübatör içinde sıcak ve% 2 CO2 izin verir. Bu ortam içerisinde çözünmüş CO2 dengelenmeye olanak vermektedir. <ol><li> Medyadan üst çıkarmayın. Basitçe kontaminasyonu önlemek için üst gevşetin. </li></ol></li><li> Izole edilmiş hücreler Falcon tüpün altındaki pelet izin verin. </li><li> Ortam kaplama en uygun miktarda bir standart plastik Pasteur pipet kullanılarak ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. </li><li> Uygun boyutlu bir yemek laminin kaplanmış lamelleri hücreleri Plate ve 37 ° C de inkübe edilir ve% 2, en az 30-60 dakika boyunca CO2 hücreler lamelleri uymak için izin vermek. </li><li> ** Adenovirüs ile transfekte ise, kaplama ortamın uygun bir miktarda virüs sulandırmak ve virüs ihtiva eden ortam ile tabak içinde kaplama ortamı değiştirin. Virüs, 37 ° C 2 saat ve% 2 CO2 için hücreler üzerinde inkübe olsun. ** </li><li> Çanak kaplama ortamı çıkarın ve kültür ortamı ile değiştirin. </li><li> Lamelleri hücrelerin rahatsız etmeyecek şekilde dikkatlice her gün kültür ortamı değiştirin. </li></ol> Bu prosedür kullanılarak, hücreler, başarılı bir şekilde 72 saat boyunca kültürlenmiştir. Transfekte edilmiş kültürlenmiş hücreler ve GFP görüntüleri, Şekil 5&#39;te bulunabilir. 3. MMSYS Sistemi <ol><li> Ark lambası ilk başlatıldığı sağlamak MMSYS sistemini güçlendirin. </li><li> Pompadan MMSYS odasının uygun giriş ve çıkışları (Şekil 6) için tüpler bağlayın. </li><li> Prime kalsiyum tampon maddesi (B) ile, sistem (Tablo 2). </li><li> Bir yak yerleştirinodasına ve vidalarını sıkın (Şekil 6E) içine opriately ölçekli cam lamel. En MMSYS odaları 22 mm veya 25 mm kare lamelleri kullanabilirsiniz. Lütfen odası için uygun lamel belirlemek için MMSYS kullanım kılavuzuna başvurun. </li><li> Küçük bir Eppendorf tüpüne, hücre çözeltisinin 500 ul aktarın. </li><li> Hücrelerin küçük tüpe 0.5 ul Fura2-AM (1 ug / ul stok çözeltisi) ekleyin ve bunları 5-7 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verir. Bu Fura2-AM hücre zarı boyunca hızlı pasif difüzyon yoluyla hücre içine &quot;yük&quot; olanak sağlar. <ol><li> Fura-2 yüklü hücreler, tüpün dibine pelet olsun ve kalsiyum tamponu B, 500 ul ile aşırı yıkama Fura </li></ol></li><li> Oda ışıkları kapatın. </li><li> Standart bir Pasteur pipeti kullanılarak, bölmenin (Şekil 6C) merkezine &quot;yüklü&quot; hücre çözeltisinin (hücre konsantrasyonuna bağlı olarak) 1-2 damla damla ve hücreler, t izino 5 dakika boyunca lamel üzerine yerleşmek. <ol><li> Oda içindeki hücre yoğunluğu, bir örtüşmeyen hücreler kolayca MMSYS veri toplama platformunda izlenebilir şekilde olmalıdır. </li></ol></li><li> Dikkatlice bölmesi boyunca kalsiyum tamponu (B) akmaya başlar. </li><li> 37 ° C oda sıcaklığı artırmak <ol><li> ÖNEMLİ: akış başlatılmıştır kadar ısıtma cihazları açmayın. Bu ciddi geribildirim thermocoupler (Şekil 6A) zarar verebilir. </li></ol></li><li> Bağlantı telleri (Şekil 6B) üzerinden odası MyoPacer bağlı olduğundan emin olun ve 1.5x hücreler için pacing eşiği de hücreleri 5 Hz hızlanmaya başlar. </li><li> Doğru frekansta yenerek bir hücreyi seçin ve çerçeveleme boşluğuna taşıyın. </li><li> Tüm hücre yatay olarak yönlendirilmiş, pencerenin merkezinde böylece sarkomerlerin ap ile, kamera ve çerçeveleme açıklık ölçüleri ayarlayınebeveyn. <ol><li> Hücre uzunluğu için hücrenin kenarına (sağ ve sol) fotodiyot göstergeleri kırmızı ve yeşil ayarlayın. Hücrenin kenarlarında beyaz / siyah kontrast optimize etmek için kontrastı ayarlayın. Daha fazla ayrıntı için Ionoptix kılavuzuna başvurun. </li></ol></li><li> Iyi tanımlanmış sarkomerlerin ihtiva eden hücrenin bir alanda Kutuyu ve güç spektrumu (kırmızı) ve tepe optimize etmek için odak ayarlayın. Ayrıca mavi yumuşatma pencere ve siyah kontrast bilgilerini optimize etmek için mikroskop parlaklığını ayarlayın. </li><li> Kırmızı güç spektrumu (tepe noktası) ve mümkün olan en az arka planın kadar yakalamak için yeşil eşik çubukları ayarlayın. </li><li> Kayda başlamak. </li><li> Yeterli veri kaydedildikten sonra, geçici kaydı durdurmak için &quot;Pause&quot; a tıklayın ve izleme penceresinin odak ne boyutları ne değişmiş olmasını sağlamak, hiçbir hücre veya hücresel materyal olabilir hangi lamel bir alana mikroskop sahne taşımak görüldü. Lenkayıt gth araştırmacının deney protokolüne bağlı olarak değişir. <ol><li> Not: &quot;Dur&quot; tıklandığında Kaydı sonlandırmak ve hiçbir arka plan o hücre için kayıtlı olmak mümkün olacak. </li></ol></li><li> Bir arka plan ölçüm kaydetmek için &quot;Devam&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> Yeterli arka plan Kaydı sonlandırmak için &quot;Durdur&quot; butonuna tıklayınız kaydedildikten sonra. </li><li> Tek bir. ZPT dosyasında bu hücre için tüm izlerini kaydetmek için &quot;Dosya &gt;&gt; Kaydet&quot; i tıklayın. </li><li> Yeterli hücre kaydedildi kadar 3.20 - 3.12 tekrarlayın adımları. </li><li> Kaydedilen verilerin analizi ile ilgili talimatlar için IonOptix-MMSYS Kullanım Kılavuzu 12 danışın. Vahşi tip kardiyomiyositlerin karakteristik kaydedilen veriler, Şekil 7&#39;de gösterilmiştir. </li></ol> 4. Patch Kelepçe Farklı hücre tipleri Patch sıkıştırma de bu dergide 25-28 daha önce tarif edilmiştir. Bu nedenle bazı eleştirmen odaklanmakyetişkin kardiyomiyositlerin başarılı yama sıkma için al parametreler bizim protokol tarif kullanılarak izole edilmiştir. <ol><li> Bir pipet çektirmenin ve borosilikat cam (filamanla: OD 1,5 mm, ID 0.86 mm - 10 cm uzunluğunda) kullanarak pipet çözüm (Tablo 5) ile doldurulduğunda ~ 2.0-3.0 MQ sergileyen bir pipet çekin. </li><li> Yangın lehçe hafifçe Narishige veya diğer düşey yangın parlatıcı kullanarak pipet ucu. Yama pipet direnci alev parlatma sonra 2-4 MO olmalıdır. </li><li> Bilgisayara, amplifikatör (Axopatch 200B), AD çevirici (Digidata 1440A, Axon Instruments) ve Mikromanipülatör (MP-285) açın. Tam hücre yama kenetleme için, daha önce tarif edildiği gibi standart parametreler ile başlar. </li><li> Kültürlü yetişkin CMS için, inkübatör bunları kaldırmak ve yavaşça CMs oda sıcaklığında PBS ile kaplanmıştır hangi lamel yıkayın. </li><li> Yavaşça lamel kaldırmak ve ters mikroskop (Nikon TE 2 perfüzyon odasında yerleştirin000). <ol><li> (Emme) perfüzyon sistemine ve çıkış için giriş sadece lamel yüzeyi üzerinde olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Uygun hücre dışı çözeltisi (Tablo 5) ile perfüze başlayın. </li><li> Taze ayrışmış yetişkin CMS için, yukarıdaki gibi perfüzyon sisteminde bir kollajen kaplı lamel yerleştirin. <ol><li> Hücreleri, sıvı içerisinde olacağından, yavaşça hücre tamponu ile çözüm değiştirin. </li></ol></li><li> Modifiye Pasteur pipet (Şekil 4) kullanılarak, yavaşça, hücre dışı tampon hücreleri tekrar süspansiyon bir kısım almak ve lamel üzerine yerleştirin. </li><li> Hücrelerin 4.4 olarak perfüzyon başlamadan önce 10-15 dakika boyunca birleşmeye izin verin. </li><li> Geri dolgu bir Microfil (Dünya Hassas Aletler, 28 G) iğne kullanılarak hücre içi tampon ile tüm hücre yama pipet. Hava kabarcığı pipet ucu vardır emin olun, hafifçe hava kabarcıkları $ tirilmi $ yüzey için yüzmesine izin dokununÇözeltinin ce. </li><li> Mikroelektrot ve iç çözümü arasında temas sağlamak, pipet-tutucuya dolu yama pipet takın. <ol><li> Biz gümüş klorür elektrotları kullanır, ancak çamaşır suyu gecede daldırarak gümüş teller en az haftada bir kez &#39;klorid edilmesine&#39; ilgileneceğim. </li></ol></li><li> Yavaşça banyo elektrot banyo / hücre dışı çözelti içinde her zaman batırılır sağlamak, banyo içine pipet indirin. Şu anda herhangi bir sıvı değme potansiyelleri ofset. Büyük kavşak potansiyeller elektrotlar üzerinde gümüş klorür bozulan bir belirtisi olabilir. </li><li> Sağlıklı silindirik yetişkin CMs mikroskop tespit ve görüş alanında ortalanır. Daha önce tarif edildiği gibi, mikromanipülatör hareket eden ve odak ayarlama bir arada yakın bir yama pipet yakınlık ve CM yüzeyi sağlar. <ol><li> Onlar aynı odak düzlemi kere, biz görsel bir arada kullanınhücre ve (Axopatch 200B mevcut) test darbesinin zasyon. </li><li> Pipet direnci (pipet hücrenin yüzeyi ile temas halinde olduğunu düşündüren) ve hücre silindirik bakmaya devam yarısında azalır sonra, hafif bir emme kullanılarak gigaohm sızdırmazlık tesis. </li><li> CMS için, negatif baskı kurmak için ağız emme tercih. Bir gigaseal başarıyla elde edilirse, biz yine bütün hücre yama modunu kurmak için hücreye &#39;break-in&#39; nazik ritmik ağız emme kullanmak. </li></ol></li><li> Sağlıklı CMS Tipik istirahat potansiyelleri -85 -90 mV sıralanmıştır. Bir gigaseal elde edildikten sonra, I = 0 Pa şimdiki kelepçe kullanarak istirahat membran potansiyelini ölçmek. <ol><li> Dinlenme membran potansiyeli depolarize olması durumunda bu, bozuk bir hücre ya da bir zayıf mühür gösterebilir. </li></ol></li><li> CMs yüzey alanının çok büyük hücreler olduğundan, dikkatli dikkat özellikle w, tazminat kapasitans için ödenmesi gerekiyorörneğin, sodyum kanalı olarak tavuk hızlı bir şekilde aktif hale akımları üzerinde çalışılacak gerekmektedir. Yeterli kapasite tazminat kullanılarak elde edilemezse çarkı üzerindeki tazminat ayarları yerleşik, alt eşik geriliminde prepulses ve zıt kutuplu uygulanmış ve kaydedilen sinyal çıkarılır çıkan cari gerekebilir. Böyle bir protokol kolayca Axopatch programlanmıştır. </li><li> Tam hücre yama modu bir kez kurulduktan sonra, dengeyi sağlamak için 15 dakika beklemek ve önceki başlangıç ​​voltaj ya da akım kelepçe protokolleri için, contanın istikrarı sağlamak için. Bu daha önce tarif edilmiştir, standart protokoller ve diğer dergi kullanımı ve bir değerlendirmeye olmayacaktır. </li></ol>

<ol>
	<li>Chlopcikova, S., Psotov&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+cardiomyocytes-a+model+for+the+study+of+morphological,+biochemical+and+electrophysiological+characteristics+of+the+heart.">Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart.</a> Biomedical Papers. , (2001).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).</li><li>Ballou, L. M., Lin, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+and+mTOR+kinase+inhibitors.">Rapamycin and mTOR kinase inhibitors.</a> J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Tubule+Function+in+Mammalian+Cardiac+Myocytes.">T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes.</a> Circ Res. , (2003).</li><li>Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decompensation+of+pressure-overload+hypertrophy+in+G?q-overexpressing+mice.">Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice.</a> Circulation. , (1998).</li><li>Lieu, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+Transverse+Tubules+Contributes+to+Non-Uniform+Ca+2+Wavefronts+in+Mouse+and+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).</li><li>Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+cardiac+hypertrophy+in+transgenic+disease+models+by+calcineurin+inhibition.">Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).</li><li>Muthuchamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+a+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+mutation+in+alpha-tropomyosin+manifests+cardiac+dysfunction.">Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction.</a> Circ. Res. 85, 47-56 (1999).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).</li><li>Epstein, F., Hunter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+for+cardiac+hypertrophy+and+failure.">Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure.</a> New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).</li><li>Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+modifies+Ca+2++signaling+during+excitation-contraction+coupling+in+neonate+cardiac+myocytes.">Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes.</a> Cell Calcium. , (2007).</li><li>Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Na+/Ca2+-exchanger+overexpression+on+excitation-contraction+coupling+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes.">Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).</li><li>Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mechanism+of+action+potential+prolongation+in+ventricular+myocytes+from+dogs+with+pacing-induced+heart+failure.">Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure.</a> Circ. Res. 78 (2), (1996).</li><li>Splawski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+SCN5A+sodium+channel+implicated+in+risk+of+cardiac+arrhythmia.">Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia.</a> Science. 297, 1333-1336 (2002).</li><li>Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes:+methods+for+cellular+genetic+physiology.">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).</li><li>Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+cardiac+hypertrophy+in+mice+by+calcineurin+inhibition.">Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition.</a> Science. , (1998).</li><li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+diazoxide-induced+formation+of+reactive+oxygen+species+and+loss+of+cardioprotection+in+connexin+43+deficient+mice.">Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice.</a> Circ. Res. 97, 583-586 (2005).</li><li>Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+connexin+43+in+ischemic+preconditioning+does+not+involve+intercellular+communication+through+gap+junctions.">Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).</li><li>Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+atrial-specific+and+inducible+expression+of+an+atrial+natriuretic+factor+transgene+in+an+in+vivo+murine+model+of+cardiac+hypertrophy.">Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).</li><li>Nakamura, A., Rokosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LV+systolic+performance+improves+with+development+of+hypertrophy+after+transverse+aortic+constriction+in+mice.">LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).</li><li>Bostr&#246;m, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PGC1-?-dependent+myokine+that+drives+brown-fat-like+development+of+white+fat+and+thermogenesis.">A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis.</a> Nature. 481, 463-468 (2012).</li><li>Liao, R., Jain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes.</a> Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).</li><li>Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+of+adult+ventricular+rat+heart+muscle+cells+in+serum-free+primary+culture.">Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).</li><li>Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 689, 205-214 (2010).</li><li>Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+and+Perfusion+Techniques+for+Studying+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+oocytes.">Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Recording+of+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+Oocytes.">Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes.</a> J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).</li><li>Arman, A. C., Sampath, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Recordings+from+Mouse+Retinal+Neurons+in+a+Dark-adapted+Slice+Preparation.">Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).</li><li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+patch+clamp+recordings+from+motor-neuron+and+target+skeletal+muscle+in+zebrafish.">Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).</li><li>Maier, S., Westenbroek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpected+role+for+brain-type+sodium+channels+in+coupling+of+cell+surface+depolarization+to+contraction+in+the+heart.">An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).</li><li>Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+micromechanical+properties+of+cultured+rat+atrial+myocytes+measured+by+atomic+force+microscopy.">Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy.</a> Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).</li><li>Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+mechanical+pulse+of+single+cardiomyocytes+with+the+atomic+force+microscope.">Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope.</a> European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).</li><li>Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Gr&#252;tter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Viscoelastic+Behavior+of+Cultured+Airway+Smooth+Muscle+Cells+with+Atomic+Force+Microscopy:+Stiffening+Induced+by+Contractile+Agonist.">Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist.</a> Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bu yazıda, fare kalp başarılı izolasyonu ve yetişkin CMS kültürü için gerekli teknikleri tarif var. Bizim teknik, yukarıda tarif edilen metotlar kullanılarak CM fonksiyon uyarılma ve daha sonra çalışma için izin verir. Yetişkin CMS işlevselliğini eğitim için kritik parametre izole CMS sağlık ve kalitesidir. Yukarıda tarif edildiği gibi, teknik adenoviral / lentiviral kültüründe enfeksiyonları ve hücresel uyarılımın ve kontraktil fonksiyon analizi kullanılarak gen ekspresyonunun manipül...

Kalp-damar hastalığı olan kemirgen modellerinde potansiyel terapötik hedefler 1,3 belirlenmesi için temel bir hastalık mekanizmalarının 1,2 açıklık yanı sıra için etkili araçlar olarak hizmet etmişlerdir. Özellikle, (örneğin basınç aşırı olarak) edinilmiş kalp hastalıklarının hem kemirgen modellerinde 4,5 ve transgenik fare modellerinin kullanımının kalp hastalığı 6-8 anlayışımızı gelişmiş var. Tek hücre düzeyinde kalp 11-13 hücre uyarılabilirliğini ve uyanlma-kasılma kaplin altında yatan tek tek proteinler de sinyal iletim 3,9,10 ve değişiklikler çalışma hücre kültürü tekniklerinin kullanımı in vivo fare modelleri tamamlayıcı var. Bununla birlikte, yetişkin CM yapısı ve fonksiyonu yansıtır yeterli hücre çizgilerinin olmaması önemli bir sınırlama olmuştur. Araştırmacılar, heterolog sentezleme sistemlerinde, örneğin iyon kanalları gibi tek tek proteinler, inceleyerek bu üstesinden gelmek çalışmışlardır <sup&gt; 14, ve bu çalışmalar iyon kanal biyofizik veya protein kaçakçılığı, CMS yerli mikro yetersiz temsili açısından yararlı bilgiler bize vermiş ise önemli bir kısıtlamadır. İkinci olarak, bu heterolog hücrelerin çoğu olgun bir kasılma aparatı yok çünkü, bu kasılma fonksiyonunu ve hücresel uyarılmayı ve daralma arasındaki karmaşık etkileşimi incelemek mümkün olmamıştır. Bu nedenle araştırmacılar, in vitro fonksiyonel çalışmaların çoğu için temel kardiyak hücre kültürlerine döndü. Son olarak, izole kardiyomyosit çalışmalar skar veya fibrozis ve fiber yönlendirme etkisi dahil çok hücreli hazırlık faktörlerin olmayan kasılma fonksiyonu değerlendirmesini sağlar. İlköğretim yenidoğan sıçan ventrikül kardiyomiyositler (NRVMs) kültür nispeten kolay, gen ifadesini 15 işlemek için adenovirüslerden ve lentivirüsler ile enfekte olabilir olduğu birnd nedenle başarıyla 1 kullanılır, ancak kendi sınırlamaları var olmuştur. Bir fizyolojik mikroortam 1 ​​sağlamak ve sinyal alanın beygir olmasına rağmen, morfoloji ve NRVMs ve yetişkin cardiomyoctyes subselüler örgüt arasındaki önemli farklar onları erişkin kalp iyonik eritici ve uyarılma-kasılma kenet soruşturma için yetersiz bir model yapmak . En önemlisi NRVMs kesin bir t-tüp şeklindeki alt sistem 4 yoksundur. Ca 2 + akı ve dinamikleri olgun t-boru ve sarkoplazmik retikulum (SR) yapısı 6, Ca 2 + dinamikleri ve NRVMs yılında kalp kasılmasında fonksiyonel çalışmalarda kritik bağımlı olduğundan erişkin kardiomyositlerindeki bu kritik süreçlerin doğru bir yansıması değildir. Ayrıca, sinyal yollarının bazı bileşenler, böylece başka bir hastalık süreçlerini incelemek için sınırlama ve i sağlayarak, yenidoğan ve yetişkin farelerin 9 arasında farklılıkNRVMs hücresel uyarılmayı ve kasılma Mpact. Son olarak, kasılma makine dağıtım kontraktil ölçümlerin doğruluğunu sınırlayan çok yönlü ve düzgün olmayan hücre kısalmasına yol açar. Izole edilmiş yetişkin kardiyomiyositlerde kullanılması bu nedenle, daha doğru bir in vitro model sistemi sağlar. Farelerin genetik manipülasyonu ile mümkün bilginin olağanüstü büyüme farelerden izole edilmiş fonksiyonel kardiyomiyositlerde elde önemini vurgulamaktadır. Aslında, fare modellerinde izole yetişkin CMS karakterizasyonu birçok biyolojik ve patolojik olaylara ışık tutmuştur. Transgenik fare modellerinde izole CMs ve böylece de elde edilen bilgiler tamamlayıcı, iskemi / reperfüzyon 17,18 gibi hastalık modellerinde kazanç ya da proteinlerin fonksiyon kaybı tek hücre 2,16 kasılma özelliklerini ve canlılığı çalışmaları için izin in vivo çalışmalardase fareler. Ya da (fizyolojik hipertrofisi modelleme için) egzersiz 5,21 incelenmesi için izin verir (mimikler hipertansiyon veya aort kapak darlığı böyle enine aort daralma kaynaklı basınç yüklenmesi gibi) edinilmiş kalp hastalığı 3,19,20 sıçan modellerinde izole erişkin CMS Kullanımı tek hücre düzeyinde hücresel uyarılımın ve uyanlma-kasılma kaplin ile bu işlemlerde rol sinyal iletim etkileşimi. Ayrıca, yetişkin CMS adenoviral odaklı gen ifadesi kullanılarak gen ifadesini işlemek için yeteneği bize karmaşık sinyal yollarının bileşenlerini incelemek için fırsat tanıyor. Elektrofizyolojik bir perspektiften bakıldığında, tüm hücre voltaj ve izole yetişkin CMS güncel kelepçe deneyler Başlangıçta iyonik akılarının doğasını durulaştırmada ve çeşitli hastalık durumlarında kritik olmuştur. Nedeniyle hücre zarının karmaşık yapısı ve diferansiyel proteYetişkin Cms ve NRVMs ya da heterolog hücre hatları arasında iskele yapılarda, yetişkin hücrelerin yama yeteneği belirli zar proteinleri, yapısal proteinler, ve yetişkin kalp elektrofizyolojik parçaları üzerinde iyon kanalı etkileşim ortaklarının etkileri çok daha iyi bir temsilini verir. , Yetişkin kemirgen kardiyomiyositlerin okuyan tecrit ve yetişkin fareler kardiyomiyositler zorlu olmuştur kültüre, canlı fare kardiyomiyositlerin izole etmek ve viral kullanarak daha fazla genetik manipülasyon izin kültür onları korumak için metodoloji sistematik ve doğru açıklama için ihtiyaç çağıran böyle önemli avantajlara rağmen vektörleri. Önceki çalışmalar akut izole fare yetişkin CMS veya kültür sıçan yetişkin CMS ya kullandık. İkincisi yetişkin fare cm daha kültüre kolaydır ve in vitro olarak gen ifadesini manipüle en deneyleri sıçan yetişkin cm kullandık. Birkaç çalışmaları başarıyla değişmiş ve functi araştırdıkdeneyler kapsamında büyük bir sınırlama sunulması yetişkin fare CMS onal gen ifadesi. Bu nedenle, burada detaylı olarak izolasyon 7,8,22, kültür 3,10,15,23, adenoviral enfeksiyon 11-13,15 ve yetişkin fare ventriküler cardiomyoctyes fonksiyonel analizi için önceki soruşturmalarda modifiye gibi metodolojileri, mevcut. Bu izolasyon protokolünün kadar 72 saat boyunca başarılı bir şekilde kültürlendi ve geçici olarak adenovirüs ile transfekte sahip Ca2 +-dayanıklı, uyarılabilen kardiyomiyositlerde sonuçlanır. Bu izole edilmiş hücrelere ait işlevleri MMSYS 14,24 ve görüntüleme sistemi ayrıca tartışılacaktır yama kelepçe kullanılarak değerlendirilebilir.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of 			Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S7653</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P9333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H3375</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Phosphate 			Monobasic</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S8282</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-glucose minimum</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G8270</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taurine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T0625</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2,3-Butanedione 			monoxime</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>B0752</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase B</td>
 <td>Roche Applied 			Science</td>
 <td>11088807001 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase D</td>
 <td>Roche Applied 			Science</td>
 <td>11088858001 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease 			XIV from Streptomyces griseus</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P5147</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin from Bovine 			Serum</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Minimum Essential 			Media</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>51411C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin solution 			from bovine serum</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A8412</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G3126</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P4333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Insulin-transferrin-sodium 			selenite media supplement</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>I1884</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cesium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/289329?lang=en&amp;region=US" target="_blank">289329</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G3291</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adenosine 			5'-triphosphate magnesium salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9187</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene 			glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic 			acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>E3889</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cesium Hydroxide 			Solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>232041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetraethylammonium 			hydroxide solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>86643</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>OptiVisor optical 			glass binocular 			visor</td>
 <td>Dohegan Optical 			Company Inc.</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue 			forceps, 5.5", 1x2 teeth</td>
 <td>Roboz Scientific</td>
 <td>RS-8164</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moloney 			forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated </td>
 <td>Roboz Scientific</td>
 <td>RS-8254</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont 			#3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm</td>
 <td>Roboz Scientific</td>
 <td>RS-4966</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Packer 			Mosquito Forceps 5" Straight Flat</td>
 <td>Roboz Scientific</td>
 <td>RS-7114</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro 			Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp </td>
 <td>Roboz Scientific</td>
 <td>RS-5917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm</td>
 <td>Roboz Scientific</td>
 <td>RS-5907</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes

Kültür birincil kardiyomiyositlerindeki (CMS) kullanımı, kalp hastalığı anlayışımızı ilerleyen kalp hastalığı olan kemirgen modellerinde güçlü bir tamamlayıcı sağladı. Özellikle, hasta koşulları ve hastalığa neden olan mutasyonlar ile iyon homeostazı, iyon kanalı fonksiyonu, hücre uyarılabilirliğini ve uyanlma-kasılma kuplajı ve değişiklikler çalışma yeteneği kalp hastalıkları hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ayrıca, kültür yetişkin CMS taklit etmek yeterli ölümsüzleştirdi hücre hattı eksikliği ve yenidoğan CMS sınırlamaları (erişkin CMS yapısal ve işlevsel biyomekanik özelliği nedeniyle birçok eksikliği olan), sinyal yolları arasındaki karmaşık etkileşimin anlayışımızı engel var iyon kanalları ve erişkin izole kardiyomiyositlerin okuyan önemini güçlendirilmesi erişkin kalp kasılma özellikleri. Burada, adenoviral-Expre ile gen ekspresyonunun izolasyon, kültür, manipülasyon için yöntemler sunmakssed proteinleri ve erişkin fare kardiyomiyositlerin sonraki fonksiyonel analiz. Bu tekniklerin kullanımı hücresel eksitabilitesi düzenleyen yolları, Ca 2 + dinamiklerini ve kasılma sinyalizasyon içine mekanik anlayış geliştirmek ve kardiyovasküler hastalık çok daha önemli fizyolojik karakterizasyonu sağlamak için yardımcı olacaktır.

Çubuk şeklinde, çizgili ve (kendiliğinden dayak değil) hareketsiz hücrelerde (Şekil 5A) yetişkin cardiomyoctyes sonuçlarının izolasyonu. Ölü hücreleri yuvarlak bakmak ve hiçbir çizikleri mevcut olacaktır. Hareketsiz hücreler kültürlendi ve gen ekspresyonu (Şekil 5B ve 5C) işlemek için adenovirüs ile transfekte edilmiş olabilir. Kültür 24 saat, canlı hücrelerin morfolojisi değişmez sonra hala Ca2 +-toleranslı ve bunlar saha uyar...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes at JoVE.com

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

isolation-culture-functional-characterization-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

24.3K Görüntüleme.  Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School.  Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir. 

Video: Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Yetişkin Mouse Hipokampal dentat girus diseksiyonu

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...