Biz Prof fahri Jean-Claude Perriard ve Evelyn Perriard yenidoğan sıçan ve fare kardiyomiyosetlere izolasyon teknikleri içine giriş için (Teknoloji, İsviçre İsviçre Federal Enstitüsü) müteşekkiriz. Biz onların destek için Prof Ju Chen ve Prof Sylvia Evans (UCSD, ABD) teşekkür etmek istiyorum. EE laboratuvar İş MRC Kariyer kurulması Grant tarafından finanse edildi. SL NIH / enstitünün (HL107744) dan bağımsızlık ödül için K99/R00 yolu tarafından desteklenmektedir. TMM Amerikan Kalp Derneği (11POST7310066) bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir.

Aşağıdaki prosedür, neonatal fare kardiyomiyositlerde izolasyonu ve kültürü için iki günlük bir protokol 16,17 açıklanmaktadır. Bütün çözeltiler, steril veya steril filtre edilmiş bulunmaktadır. Bütün araçlar% 75 etanol ile yüzey sterilizasyonu ile sterilize edilir. Ilk doku çıkarma hariç olmak üzere, tüm adımları steril bir laminer akış başlığı içinde bir hücre kültürü yapılmaktadır. Bu protokol, bir-iki çöp (ler) den neonatal fare kalpleri izolasyonu için tasarlanmıştır - yaklaşık 5-14 yavrular, ancak daha büyük çöp boyut ve sıçan neonatal kardiyomiyositlerde için adapte edilebilir. Uygun ölçekli medya / enzim kullanımı. Neonatal kemirgenler ile çalışmak için, yasama ve / veya hayvan bakım programları tarafından belirlenen yerel üniversite kurallar ve kurallar bakın ve kurumsal olarak onaylanmış hayvan protokole uymak. Bu protokol açıklanan tüm yöntemler UC San Diego Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış, ve fede bağlı olmuşturral ve eyalet düzenlemeleri. Gün 1. 1.. Yenidoğan fareler ile Kardiyak Doku İzolasyonu <ol><li> 20 mM BDM 6-8 ile desteklenmiş (Ca2 +, Mg2 + olmadan) PBS 1x 50 ml hazırlayın, ve buz üzerine yerleştirilmiş, iki steril bakteriyel tabaklar içine dağıtılır. </li><li> 50 ml steril Falcon konik tüp içinde yalıtım maddesi 10 ml hazırlayın. Buz üzerinde tüm çözümleri tutun. Ve forseps (kavisli, Dumont No.7) makas (bir düz kavisli bir) sterilize. </li><li> 1-3 günlük yenidoğan farenin yüzey sterilizasyonu için% 75 etanol çözeltisi içinde hızlı bir şekilde çalkalanır. Yavrular steril makas (düz) kullanılarak öldürülmüş, ve göğüs göğüs boşluğuna erişim ve kalp (Şekil 1A, Ek Film S1) izin sternum boyunca açılır. Teknik Yorum: 3 günden daha eski Yenidoğan fareler kullanılır, ama daha az canlı hücrelerin 2 neden olabilir. </li><li> Kalpler ayıklanırkavisli makasla gövde ve 20 mM BDM ile (Ca2 +, Mg2 + olmaksızın), 1x PBS içeren bakteriyel çanak içine hemen transfer buz üzerinde. Aşağıdaki bütün işlemler steril hücre kültürü kaputu gerçekleştirilir. </li><li> (Arzu edildiği takdirde, ve kulakçıklar) Akciğer dokusu, daha büyük bir gemi çıkarın. 1x PBS çözeltisi içinde yıkama kalpler (Ca olmadan 2 +, Mg2 +), 20 mM BDM (buz üzerinde) ile kan kaldırın. Aktarım 20 mM (buz üzerinde), BDM forseps kullanılarak ya da perfore kaşık (Şekil 1 B) ile (Ca2 +, Mg2 + olmaksızın), 1x PBS içeren ikinci bakteri çanak içine birinci çanak kalpleri yıkanmıştır. </li><li> Aktarım temizlenmiş / izolasyon ortamının bir damla (yaklaşık 250 ul; Şekil 1C) içine kalpleri yıkanmış, kurutulmuş (buz üzerinde) üçüncü bir bakteri tabağına ve küçük parçalara (yaklaşık 0.5-1 mm 3 ya da daha küçük içine kalpleri kıymaya kavisli makas kullanımı; Şekil 1D, 1E). </li><li> Bir konik içine kıyılmış kalpleri aktarıntüp (buz üzerinde), izolasyon ortamında 10 ml içeren, ve gece boyunca 4 ° C&#39;de, hafifçe çalkalanarak inkübe edin. </li></ol> Gün 2. 2. Hücreler doku enzimatik sindirim ve Kaplama <ol><li> Kolajenaz / dispaz karışımı (Roche) 15 mg tartılır ve 20 mM BDM (sindirim ortamı) ile takviye edilmiş 10 ml L15 orta 5 enzim karışımı çözülür. Steril filtresi yeni bir steril bir 50 ml Falcon tüpü içine, hücre kültürü kaputu sindirim ortam. </li><li> 30 ml L-15, 20 mM BDM ile takviye edilmiş bir ortam, ve kaplama orta hazırlayın. </li><li> 1 saat arasında, en az kolajen çözeltisi (Sigma C-8919) ile kaplayın, hücre-kültür plakaları. Steril bir laminer akış hücre kültürü kaputu kollajen çözüm (yeniden kullanılabilir) ve kuru kollajen kaplı hücre kültür kaplarına çıkarın. </li><li> 4 ° C ila predigested kalpleri içeren konik tüp kaldırmak Doku parçaları (Şekil 1G) birleştirilmelidir. Doku parçaları batar izintüpün alt ve (herhangi bir doku parçaları gevşek değil emin olun., normalde, izolasyon ortamının yaklaşık 1 ml tüp içinde kalabilir) süpernatant kaldırmak. Sindirim sıvısının 5 ml ve 1 dakika boyunca oksijen ya da hava ile doku parçaları ve oksijenat süspansiyona, 20 mM BDM ile desteklenmiş L-15 5 ml. </li><li> Sindirim çözeltinin sıcaklığını ayarlamak için yaklaşık 2 dakika için 37 ° C su banyosuna sindirim ortam içinde kardiyak doku parçaları ihtiva eden kapalı konik tüp aktarın. </li><li> 20-30 dakika süre ile hafif bir çalkalama (60rpm daha fazla ayarlanmış 37 ° C&#39;de, örneğin karıştırıcı) ile 37 ° C &#39;de kardiyak doku parçaları inkübe edin. . Sindirim kez büyük enzim karışımı ve lot numarası Dikkat bağlı olabilir: daha uzun kuluçka dönemleri veya daha yüksek enzim konsantrasyonları hücre canlılığını azaltabilir. </li></ol> Teknik Yorum: 102696: Biz (Kat.No. Roche Bir kollajenaz / dispase karışımının kullanımını tavsiye38001) çok az çok partiye değişkenlik sahiptir. Fare kardiyomiyositlerde izolasyonu için klasik enzim tripsin ve / veya Worthington (Cat No CLS-2) &#39;den temin kollajenaz tip II 3,16-20 olduğunu. Bununla birlikte, kolajenaz II performans çok partiye önemli ölçüde farklı olabilir. Worthington genellikle sindirim süresinin optimizasyonu ve kullanım enzim için çeşitli kolajenaz daha test edilmesi için izin verir. Seçenek olarak ise, Worthington, önceden test edilmiş enzim karışımı ile bir kardiyomiyosit izolasyon kiti sattığı fare kardiyomiyositlerde 17 (: NCIS Cat No) izolasyonu için uyarlanabilir dahildir. <ol start="7"><li> Taze steril 50 ml konik falcon tube steril hücre süzgeç (40-100 um naylon örgü) yerleştirin. 20 mM BDM ile desteklenmiş 5 ml L-15 ile Pre-ıslak hücre süzgeç. Yaklaşık 10-20 kat için önceden ıslatılmış 10 ml hücre kültürü pipet ile hafifçe çiğnemek doku fragmanları. Doku parçaları çoğunlukla suspensio içine hücreleri serbest, bu aşama sırasında dağılmalıdırn (şekil 1 H). </li><li> Büyük doku parçaları çöktürmek edelim ve hücre süzgeç (Şekil 1i) yoluyla taze konik tüp içine askıya hücreleri içeren transferi yüzer. </li><li> 5 ml ortam içinde sindirim sindirilmemiş doku parçaları yeniden askıya ve nazik çalkalama ile 37 ° C&#39;de ilave bir 5-10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Kalan doku parçalarının devam sindirim sonra, yavaşça 10-20 kez doku çiğnemek ve ilk hücre süzgecinden sindirmek itibaren konik tüp içeren hücrelere ekleyin. Her sindirilmiş hücre geçişine imkan vermek için 20 mM BDM ile desteklenmiş 5 ml L-15 ile hücre süzgeç durulayın. </li><li> Santrifugat konik bir tüp 300 rpm&#39;de 5 dakika (yaklaşık 50-100 xg) askıya kardiyomiyositlerde ihtiva etmektedir. (Çoğunlukla fibroblastlar ve endotelial hücreleri içeren) süpernatantı ve ortam maddesi 10 ml yeniden askıya hücre topağı. </li><li> 10 cm hücre kültür çanağı (Şekil 2A) içine ve 1 boyunca inkübe Plate hücrelerHücre kültürü inkübatöründe -3 hr. Bu ön kaplama aşaması, kaplanmamış hücre kültür çanağı (Şekil 2C) için uygun olacak olan, fibroblastlar ve endotel hücreleri (Şekil 2B) kaldırır. </li><li> İnkübasyondan sonra, transfer yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler, steril bir Falcon konik bir santrifüj tüpüne (15 ml veya 50 ml) &#39;den (art arda yemeğin üzerinde kaplama orta pipetleme ile yeniden askıya hücre) 10 cm kültür çanak yapışmayan kardiyomiyositlerde yıkama ve. İsteğe bağlı: hücre süspansiyonu ek fibroblastlar kaldırmak için ön kaplama adımı tekrarlayın. Eğer arzu edilirse, yapışkan fibroblast ve endotelial hücreler daha fazla kültürlendi olabilir. </li><li> (Neubauer hemositometresi kullanarak, örneğin 21 boyanarak mavi dışlama tripan) hücreleri saymak. </li><li> Cm 2 (Şekil 2B için yaklaşık 1.5 x 10 5 hücre yoğunluğunda olan kollajen kaplı hücre kültürü çanaklarına Plate hücreleri aynı zamanda bakınız kaplama üzerine, Tablo 1 &#39;de yorumlarve kaplama). Hücre kültürü inkübatör içine yerleştirin yemekleri ve bağlılık ve kardiyomiyositlerdeki yayılmasını sağlamak için 12-18 saat boyunca rahatsız bırakın. </li></ol> 3. Gün - neonatal kardiyomiyositlerin Kültür <ol><li> 37 ° C su banyosunda bakım ortamı ve Prewarm hazırlayın. Neonatal fare kardiyomiyositlerin lipozomal transfeksiyon için çoğalma inhibitörleri veya kronotropik maddelerin eklenmesi veya prosedür için Tablo 1 &#39;e bakın. </li><li> Bir gün sonra kaplama kardiyomiyositler hücre kültürü kabına yapışan ve optimal sözleşme kendiliğinden başlamak olmalıdır (Şekil 2E, 2F; Ek Film S2, izolasyon / kültür işlemi sırasında ortak sorunlar için bkz Tablo 2). Ilave 1-5 gün boyunca bakım ortamına, ve kültür ile orta kaplama değiştirin. Gerektiğinde orta değiştirin. </li></ol>

Kalp hastalıklarının çalışma hayvan modellerin kullanımı Kardiyovasküler araştırmalarda standart haline gelmiştir. Bu modellerin yakından biyokimyasal karakterizasyonu (örneğin, biyokimyasal ya da biyo-mekanik uyarıcılara kalp hücrelerinin doğrudan yanıtları eğitim), genellikle kalp dokularının veya kardiyomiyositlerin izole edilmesini gerektirmektedir. Kalbin fizyolojik tepkileri araştıran çalışmalar ex vivo (örneğin 40 asetilkolin, ya da iskemi reperfüzyon s...

Kemirgen kalp hücrelerinin başarılı ayrışma ve kültürü için erken raporlarının 1960 1,2 dayanıyor. O zaman bile, Harary ve Farley kültürlü kardiyomiyositler &quot;periyodik kontraktilitenin gereksinimleri çalışma için benzersiz bir sistem sağlayabilir [ve olabilir] [dayak] işlemi için çeşitli metabolik yolların katkısını belirlemek için bir araç sağlamak&quot; olduğunu fark ettim. Genç farelerde ve özgün protokolden Harary ve Farley izole ve kültürlü kardiyomiyositler yılda uyarlanmış ve birçok bilim adamı tarafından değiştirilmiş olmasına rağmen, genel izolasyon ve kültür prosedür büyük ölçüde değişmedi. Ancak, daha iyi enzimler 3, standart çözeltiler 4,5, ve izolasyon prosedürü sırasında 6-9 hücreleri korumak için, tersinir kanal ve myosin ATPase inhibitörü BDM ilavesinin anlamlı hücre verimi ve canlılığı geliştirdi. Yenidoğan cardiomyo vs Adultcytes Neonatal fare veya sıçan izole edilmiş ve kültürlenmiş Kardiyomiyositler yetişkin kardiyomiyositlerde kültürler üzerinde çeşitli avantajları vardır. Yetişkin fare veya sıçanın 10 kardiyomiyositlerin izolasyonu kıyasla önemlisi, yenidoğan fare veya sıçan kalpleri için izolasyon prosedürü, daha kolay ve daha az maliyetlidir. Neonatal kardiyomiyositlerde büyük hücre verimini artırmak, ayrışma sonra bir kalsiyum-içeren bir ortam içine tekrar başlatmak için çok daha az duyarlıdır. Yetişkin kardiyomiyositler genellikle kasılmasını uyardığı volta ihtiyaç duyarken, genellikle kendiliğinden kaplamadan sonra hücreler 20 saat yenerek sonuçları Rediferansiasyon döngüsü - Başka bir büyük avantajı yenidoğan fare kardiyomiyositler daha hızlı farksızlaşma tabi olmasıdır. Yetişkin kardiyomiyositlerde transgenik DNA&#39;nın başarılı gönderim viral vektörler gerektirir ise Neonatal kardiyomiyositlerde, hali hazırda daha da lipozomal transfeksiyon yöntemleri ile transfekte bulunmaktadır. Neonatal kardiyomiyosit aksines, yetişkin kemirgen kardiyomiyositlerinin 11-13 kültür miyofibriler bozulması ve kontraktil aparat nihai yeniden kurulması soruşturma için izin verir. Yetişkin kardiomyositlerindeki Bu karakteristik morfolojik değişiklikler, 1-2 haftalık dönemlerde ortaya çıkar. Farksızlaşma - Rediferansiasyon döngüsü böylece insan kardiyomiyopati 14 gözlenen patolojik değişikliklerin taklit eden, fetal gen program reexpression eşlik eder. Neonatal kardiyomiyositlerin kültürüne de yetişkin fare kardiyomiyositlerin diğer bir avantajı, uzun bir süre boyunca kültüre yeteneği, bu hücredir. Fare kardiyomiyositler vs sıçan Sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü canlı hücrelerin daha yüksek verim ve artan transfeksiyon oranları dahil olmak üzere mouse yenidoğan kardiyomiyositlerinin, o üzerinde bazı faydaları vardır. Ancak, kardiyak hastalıklar için genetiği değiştirilmiş fare modellerinin geniş kullanım (örn. &lt;/ Em&gt; dilate kardiyomiyopati 15 için bir model olarak kas lim protein knockout fare) neonatal farelerden türetilen kardiyomiyositlerin için izolasyon prosedürü uyarlanmasına yol açmıştır. Neonatal sıçan ve fare kardiyomiyositlerde izole edilmesi için kullanılan protokoller hemen hemen aynı olmasına rağmen, daha büyük bir bakım ikincisi için uygun bir enzim karışımı seçiminde dikkate alınmalıdır. Gerçekten de, neonatal fare kardiyomiyositlerde azaltılmış verim ve hücre canlılığı ile sonuçlanan genel olarak Overdigestion karşı daha hassastır. Neonatal farelerden türetilen kardiyomiyositlerde yenidoğan sıçan kalplerinde türetilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında biraz daha küçük olduğu için Ayrıca, kaplama yoğunluğu, ayarlanmalıdır. Morfolojik elektrofizyolojik, biyokimyasal, hücre-biyolojik ve biyomekanik parametreleri hem de myofibrillogenesis süreci için araştırılması için bir çok kullanıma sahip, kültürlü neonatal kardiyomiyositlerde çalışma için çok yönlü sistemlerinden biri haline gelmiştirin vitro kardiyak hücre fonksiyonları. Başarılı bir tahlil için ilk adım, ancak, neonatal fare kardiyomiyositlerde izole etmek için kolay ve güvenilir bir yöntem bağlıdır. Bizim protokol birçok kaynaktan metodolojisini çizer ve tekrarlanabilirlik ve sağlamlık için optimize edilmiştir. Biz kardiyomyosit-verim ve canlılığını etkileyen faktörleri tartışmak ve izolasyon ve kültür koşullarının optimizasyonu için çeşitli seçenekler sunar.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0753</td>
			<td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 &deg;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II3</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>e,g, cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank's balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-199</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-030-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-155</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-045-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6126</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-6501</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% collagen solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8919</td>
			<td>extracellular matrix for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>alternative to Sigma collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td>appropriate filter size:40 &mu;m-100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2 &mu;m</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>for sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight scissors</td>
			<td>e.g. Fine Sciences Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 7 forceps</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated spoon</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td>optional, for transfer of heart tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>e.g. Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>e.g. Prosource Scientific</td>
			<td>3500</td>
			<td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>14-432-23</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>e.g. BD Medical</td>
			<td>14-820-19</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipette</td>
			<td>e.g. Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>for standard culture of cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>for live cell imaging with inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>172958</td>
			<td>for preplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escort III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3037</td>
			<td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td>substitute for Escort III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers and media: 
			<ul>
				<li>Isolation medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				0.0125% trypsin 
				in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)</li>
				<li>Digestion medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix 
				in L15 medium</li>
				<li>Plating medium 
				65% DMEM high glucose 
				19% M-199 
				10% horse serum 
				5% fetal calf serum 
				1% penicillin/streptomycin</li>
				<li>Maintenance medium 
				78% DMEM high glucose 
				17% M-199 
				4% horse serum 
				1% penicillin/streptomycin 
				optional: 
				1 &mu;M AraC 
				1 &mu;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine</li>
			</ul>
			The plating and maintenance medium can be stored at 4 &deg;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

Kültürlü neonatal kardiyomiyositler uzun myofibrillogenesis ve miyofibriler fonksiyonlarını incelemek için kullanılır olmuştur. Kültürlü kardiyomiyositler kolay soruşturma ve manipülasyon biyokimyasal yolların ve kendiliğinden kardiyomiyositlerin dayak biyomekanik özellikleri üzerine etkileri için izin verir. Aşağıdaki 2 günlük protokol neonatal fare kardiyomiyositlerin izolasyonunu ve kültür açıklar. Biz kolayca yenidoğanlardan kalpleri incelemek kardiyak doku ayırmak ve kardiyak hücre-nüfustan kardiyomiyositlerin zenginleştirmek için nasıl göstereceğim. Bu hücre ayrışması için farklı bir enzim karışımlarının kullanımı, ve hücre canlılığı üzerindeki etkilerini tartışır. İzole edilmiş kardiyomiyositlerde sonra morfolojik elektrofizyolojik, biyokimyasal, hücre-biyolojik ya da biyo-mekanik bir çok analizde kullanılabilir. Biz sadece piyasada mevcut çözümlerini kullanarak, sağlamlık ve tekrarlanabilirlik için protokol optimize edilmiş ve enzim karışır show az lot partiye değişkenlik. Biz de kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü ile ilgili ortak sorunları çözmek ve izolasyon ve kültür koşullarının optimizasyonu için çeşitli seçenekler sunuyoruz.

Bu protokolü kullanarak, 8 bir gün eski yenidoğan farelerin (Şekil 1A, 1B, Ek Film S1) kalplerini izole. Yıkama ve makas (Şekil 1 C-1F) ile kalpleri kıyma işleminden sonra doku fragmanları, yumuşak çalkalama ile 4 ° C&#39;de gece boyunca izolasyon ortamı içinde önceden sindirilmiş edilmiştir. Predigestion (Şekil 1G) takiben, taze ortam içine sindirim doku parçaları transfer ve nazik çalkalama ile 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca doku parçaları in...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Birincil fare kardiyomyosit kültürleri miyofibriler organizasyon ve fonksiyon soruşturma için önemli araçlardan biridir. Aşağıdaki protokol neonatal fare kalpleri birincil kardiyomiyositlerde izolasyonunu ve kültür açıklar. Elde edilen kültürler, daha sonra kardiyomiyosit biyomekanik, biyokimyasal ve hücre-biyolojik tahlillerin çeşitli için kullanılabilmektedir.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

isolation-and-culture-of-neonatal-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

62.0K Görüntüleme.  King’s College London.  Birincil fare kardiyomyosit kültürleri miyofibriler organizasyon ve fonksiyon soruşturma için önemli araçlardan biridir. Aşağıdaki protokol neonatal fare kalpleri birincil kardiyomiyositlerde izolasyonunu ve kültür açıklar. Elde edilen kültürler, daha sonra kardiyomiyosit biyomekanik, biyokimyasal ve hücre-biyolojik tahlillerin çeşitli için kullanılabilmektedir. 

Video: Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Biyoloji

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...