Bu proje (Sandler Vakfı tarafından kısmen finanse edilen) Atılım Biyomedikal Araştırma UCSF Programı, Bağımsızlık Ödülü NIH Pathway (R00HL114738) ve Edward Mallinckrodt Jr Vakfı tarafından finanse edildi. JJ NIH (T32HL007731) bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir. Yazarlar mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir, bu işin, içeriklerinden sorumludur.

Burada özetlenen tüm işlemler Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi, San Francisco tarafından onaylanmıştır. Not: Kısaca, fare göğüs kalbi çıkardıktan sonra, koroner retrograd perfüzyon etkin kolajenaz ve proteaz XIV ile hücre dışı matris sindirimi için kullanılır. ventriküller daha sonra mekanik olarak ayrılmış ve tek bir hücre süspansiyonu içine süzüldü izole edilir. Yerçekimi sedimentasyon yüksek yoğunluğu ile fibroblastlar ve endotel hücreleri gibi stromal hücreler ayrılır kardiyomiyositlerde izole etmek için gerçekleştirilir. Saflaştırılmış kardiyomiyositlerde laminin kaplı polistiren üzerinde hafta kültüre ve adenovirüsün, gen vektörleri ile dönüştürülmüş olabilir. 1. kardiyomiyosit izolasyonu <ol><li> Tamponlar, Cerrahi İstasyonu ve Perfüzyon Aparatı hazırlayın <ol><li> Tab göre tamponlar ve ortamı hazırlayınle 1. </li><li> Su banyosu dolaşan açmak ısıtılmış su ceketi çıkışı 37 ˚C bir sıcaklığa ulaşacak şekilde giriş sıcaklığını ayarlamak. </li><li> % 70 etanol ile yıkama temizleyin perfüzyon sistemi. Daha sonra steril su birkaç hacim püskürtülerek sistemi etanol tüm izlerini silmek. </li><li> Perfüzyon tamponu (Tablo 1) ile perfüzyon sistemi yükleyin. İlk tahliye su sisteminden, daha sonra perfüzyon tamponu 2 hacim ile yıkayın. Daha sonra ısı ceketi iç sütun perfüzyon tamponu ile doldurulur, böylece perfüzyon tamponu ile ölü alanı dolduran, ancak debubbling odası boştur. İPUCU: Herhangi bir hava kabarcıkları debubbling odasının altındaki satırda bulunan olduğundan emin olun. , Inatçı kabarcıklarını çıkarmak tüm stopcocks meşgul ve basınç birkaç saniye hattı içinde birikmesine izin vermek için. Sonra prizinden jet yüksek basınçlı perfüzyon tampon izin düşük musluğunu serbest; akış hızı ve turbulence perfüzyon çıkışının yakınına yakalanan kabarcıklarını çıkarmak yardımcı olacaktır. </li><li> iğnesi olan bir şırınga Hazırlama aort kanülasyon için kullanılır. Perfüzyon tamponu ile dolu bir 1 ml şırınga 18 G, kör bir iğne takın. hava kabarcıklarını çıkarmak ve laboratuar bant ile diseksiyon miscroscope aydınlatıcı bir koluna şırınga tertibatını sabitleyin. İPUCU: Eğimli iğne künt bir iğne uçlu oluşturmak için, tel kesme ile iğne mili transect. ucu düz olana kadar bir zımpara taşı ile ucu bilemek. NOT: kanülasyon sırasında iğneden aortun kaymasını azaltmak jilet kullanarak kanülasyon iğne milini pürüzlendirin için. Birkaç oluklar iğne milinin ucuna 1 cm mesafe içinde oluşturulmuş kadar dönerken göbek ve üst mili tarafından iğne Güvenli, daha sonra ileri geri dik iğne milinin uzun eksenine jilet gördü. Bıçak donuk hale geldiğinde yeni bir jilet geçin. </li><li> Temiz bir koyunmikroskop altında petri kanülasyon kalbi içeren. kanül ucu görüş alanının kenarına yakın olacak şekilde aydınlatıcı kolunu, ancak diseksiyon engel değil. kanül ucu petri kenarına altında olduğundan emin olun. NOT: - petri 215 mikron mesh kare küçük bir (7 cm 2 ~ 5) yerleştirin diseksiyon sırasında kalbi hareketsiz yardımcı olmak. Kalp bu örgü üzerine yerleştirildiğinde, sürgülü ve mekanik manipülasyon sırasında kalbin dönen azaltmak için sürtünme yaratacak. </li><li> aortun sabitleme için kullanılacak kanül iğne göbek etrafında gevşek çift overhand knot ile 2 sütür bağlayın. </li></ol></li><li> Kalp Ekstraksiyon ve kanülasyonu <ol><li> intraperitonal enjeksiyon ile heparin (5 U / g vücut ağırlığı) uygulayınız. Heparin kalbe almasını sağlamak amacı ile 20 dakika bekleyin. </li><li> intraperitoneal enjekte tarafından fare anestezisi% 20 etil karbamat (2 mg, etil karbamat / g vücut ağırlığı) iyonu. (- 5 dk yaklaşık 3) fare derin anestezi altında olana kadar yakından gözlemleyin. NOT: Derin anestezi ayak tutam ve kornea refleksleri hem eksikliği ile teyit edilir. Fare 8 derin anestezi ulaşmış değilse - 10 dakika sonra etil karbamat ek bir dozunu. Anestezi bireysel tepkiler fareler arasında değişecektir rağmen, başarısızlık sonra bile tekrarlanan doz derin anestezi engel olabilir bozulmuş etil karbamat, gösterebilir ilk doz üzerine derin anestezi girmek için. bozulmasını önlemek için, her kullanımdan önce etil karbamat taze solüsyon hazırlanır. </li><li> ameliyat bandı ile her uzuv güvence tarafından ameliyat platformu için fareyi hareketsiz. % 70 etanol liberal bir miktarda kesi alanı dezenfekte edin. Pat laboratuar silin bir ile kurulayın. </li><li> sadece sternum altında doku forseps ile cilt kaldırın. bir uçtan bir uca kesim, küçük makas ile yanal kesi yapmakCildi ve karın ugh. </li><li> nazikçe sternum üzerinden göğüs kafesi kaldırmak için hemostat kullanın. küçük diseksiyon makas kullanarak, aksilla doğru bir V-şeklinde kesi uzatmak. ilk kaburga kesti ve her iki tarafta diyafram delinme. </li><li> hemostatlarla göğüs kafesi kaldırın ve tamamen diyafram transect küçük iris makas kullanmaya devam edin. kalbi ponksiyon özen gösterin. </li><li> rostrally hızlı bir şekilde bağlı hemostat kullanarak göğüs kafesi geri çekin ama dikkatle her iki tarafta aksilla doğru göğüs kafesi üzerinden keserek V şeklinde kesi uzatmak. tam göğüs kafesi orta bölümünü geri çekin ve yerinde tutmak için ekli hemostat uzandı. </li><li> Ince forseps kullanarak perikard çıkarın. </li><li> hafifçe kavisli bir forseps kullanarak kalbi kaldırırken, kalbe bağlı damarları ve arterler transect. Hemen kas kasılmasını yavaş buz soğukluğunda perfüzyon tampon maddesi içinde kalp yerleştirin. </li><li> petri altında kalbi yerleştirinBir diseksiyon mikroskobu (215 mikron mesh küçük bir parçası üzerinde yer diseksiyonu sırasında hareketsiz yardımcı olmak için). İnce iris makas kullanılarak herhangi bir aşırı kalp dışı doku kesin. aorta yakın keserken dikkatli olun. </li><li> brachioencephalic arter yakın aort transect ve kabarcıklar veya doku enkaz açılış girmesine izin vermemeye dikkat çekmek. </li><li> sıvı seviyesi kanül açılması üzerine çıktığı şekilde buz gibi soğuk perfüzyon tamponu ile kalbi içeren petri doldurun. ucu aort kapak hemen distalinde olacak şekilde kanül üzerine aorta kılıf. İPUCU: Biraz kanül sonunda gelişmiş olabilir potansiyel hava kabarcıklarını çıkarmak için önce kanülasyona kanül üzerinde şırınga bastırın, hava embolisi riskini azaltmak için. Buna ek olarak, aort kaplamak ise baloncuklarının oluşumunu ortadan kaldırmak için çözelti yüzeyinin altında kanül ucu ve aort tutun. </li><li> aşağı önceden bağlı 7-0 ipek sütür kaydırınsadece iğne ucu yukarıda kanülasyon iğne ve pozisyon şaft. ince forseps ile düğüm sıkın. İlk üzerine yerleştirilen ikinci bir dikiş ile bu adımı yineleyin. NOT: iğne ucu öncesi ve sıkıldıktan sonra aort kapağının üzerinde hala emin olun. </li><li> Yavaş yavaş koroner damar sistemi aracılığıyla perfüzyon tampon 0.5 ml çıkarmak için şırınga bastırın. NOT: kanülasyon başarılı olursa, kan koroner arter bırakarak ve dorsal venler ve arterler dışında havuzu görüntülenmiştir olacaktır. ÖNEMLİ: (özellikle diyafram delme) perfüzyon başlangıç ​​hipoksik maruz kalmayı azaltmak ve izole kardiyomiyositlerinin hayatta kalma ve sağlık maksimize etmek için minimize edilmelidir göğüs boşluğunun açılması zamanı. İdeal olarak, bu süre 5 dakikadan daha az olmalıdır. </li></ol></li><li> serpilme NOT: retrograd perfüzyonCihaz uygun standart bir laboratuar sırası üzerinde temiz bir ortamda çalışan veya steril üst düzeye çıkarmak için bir laminer akış başlığı içinde yerleştirilebilir. perfüzyon işlemi tamamlandıktan sonra, ancak, çalışma kontaminasyonu en aza indirmek için, laminer akış altında yapılmalıdır. <ol><li> Nazikçe ama sıkı yavaş ileri geri çevirerek (steril eldiven kullanarak) şırınga kanül göbeğini çıkarın. şırınga kapalı kanülasyon iğne çekerken, yavaş yavaş perfüzyon sırasında hava kabarcıklarının önlemek için iğne hub içine perfüzyon tampon çıkarın. </li><li> perfüzyon çıkış deliğinden aşağıdan sirkülasyon yakalamak tüpünü çıkarın ve atık yakalamak beher ile değiştirin. Perfüzyon çıkış portuna sabitlenir Luer adaptörü iğne göbeğini takın (Şekil 1, 2) su ceket, pompa en düşük ayarda çalışırken (15 RPM, ~ 6 ml / dk). İPUCU: Luer adaptörü iğne hub bağlarken, damlama perfüzyon tampon con izinbaloncuklarının oluşumunu ortadan kaldırmak için, iğne göbek sıvı bağlantısını kurmadan. </li><li> perfüzyon tamponu 8 ml giriş hortumu ile aspire edilinceye kadar sirkülasyon olmadan kalbi serpmek. NOT: Bu adımda, giriş hortumu ile emilen perfüzyon tamponu hacmi kalp pompalanır perfüzyon tamponu, 15 ml elde etmeyi sağlamaktadır, perfüzyon sistemine 7 ml ölü hacim varsayar. </li><li> perfüzyon tampon giriş borusunu sökün. İzin hava sisteminin ölü hacminden daha az giriş tarafından aspire edilmesi. NOT: Bu aşamada emilen havanın hacmi koroner arter (adım 1.3.7 bakınız) hava girmesini önlemek için ayarlanması gerekir. </li><li> Sadece tüpün tabanından, sindirim tamponu (Tablo 1) giriş borusunu yerleştirin. Yavaş yavaş Yem ve giriş borusu tüpü taşmayı önlemek için yeterli hacim aspire izin verin. </li><li> Görselleştirmek ve aralarında hava kabarcığı izleyinperfüzyon tampon ve ısı ceketi üzerinden geçecek şekilde sindirim tampon. ısı ceketi merkezinde perfüzyon tampon seviyesini gözlemleyin hava kabarcığı de-köpüren odasına ulaştığında düşmeye başlar. sindirim tampon de-köpüren odasına ulaştığında, ısı ceketi sıvı seviyesi sabit kalacaktır. ÖNEMLİ: perfüzyon tampon seviyesi çok düşük düşerse, çıkış stopcock kapatın ve havalandırma musluğunu açın. (- Çıkış portu üzerinde 5 inç 3) seviye rahat bir düzeye yükselmesine izin verir. Ardından, perfüzyon pompa durdurmak ve havalandırma musluğunu kapatın. çıkış noktası musluğunu açın ve perfüzyon pompası yeniden başlatın. </li><li> kalpten çıkan çözüm izleyin. perfüzyon tampon son kalbini bırakır ve sindirim tampon kalp ile dolaşan başlar başlamaz, açık kahverengi açık renk değişimi nedeniyle kollajenaz varlığı görülecektir. </li><li> sindirim tamponu ile kalp serpmek15 dakika - yaklaşık 10. Kollajen bozulmuş olarak kalp gitmeden başlayacak ve mekanik destek kaybeder. </li></ol></li><li> Mekanik Ayrışma ve Arıtma <ol><li> kuru petri forseps ve yer ile kanül kalbi çıkarın. Hızlı bir şekilde ince iris makas kullanılarak ekstra ventriküler doku kırpın. yıkamak için taze bir petri içeren perfüzyon tamponuna ventriküllerin aktarın. steril bir kaput petri taşıyın ve taze, kuru petri ventriküllerin aktarın. </li><li> Çevirerek karıştırın, ısı ceketi gelen sindirim tampon 7.5 ml toplayın ve 1 M CaCl2 2.8 ul ekleyin. Petri karıncıklara CaCI2 ile sindirim tamponu 3 ml - 2 ekleyin. NOT: Ca 2 + konsantrasyonu 300 700 uM dan yükseltilir </li><li> En parçalar küçük 1 mm&#39;den 3 olduğu kadar çabuk, ince forseps ile ventriküler doku çiğnemek. kalır eklepetri ayrışmış ventriküllere adım 1.3.2 Ca 2+ takviye sindirim tampon ing ve hafif çalkalama ile karıştırın. </li><li> % 5 CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde petri yerleştirin. Yeterli Kardiyomiyositlerde (aşağıdaki Not bakınız) dokudan serbest bırakıldı kadar petri her 2 dakikada çalkalayın. Not: kuluçka süresi gerekebilir deney ihtiyaçlarına göre ince ayar sindirme derecesinin ayarlanması. Genellikle, uzun inkübasyon süreleri verim ve saflık artırmak, ancak hücre eki ve hayatta kalma oranını azaltabilir. 5-10 dakika, yüksek verim elde etmek için genelde yeterlidir (~ 5-10 x 10 5 hücre kalp başına). </li><li> Laminer akış kaputu geri petri aktarın. ayrıca ayırmak doku pipetle yavaşça, 45 ° açıyla kesilmiş bir transfer pipet kullanarak. </li><li> bir koni içine 215 mikron örgü kat ve 50 ml&#39;lik bir konik üzerinde tutmak için steril eldiven kullanın. Pipetayrışmış doku örgü üzerine süspansiyon ve süzülen 50 ml konik içine boşaltın. Birinci filtre malzemesiyle birleştirilerek, örgü ile petri kardiyomiyositlerde yıkamak için önceden ısıtılmış durdurma tamponu (Tablo 1) 7.5 ml kullanın. Not: Ca + 2 son 1.1 mM yükseltilir ve durdurma tamponu nihai% 2.5 FBS proteaz aktivitesini nötralize. </li><li> 15 ml konik bir hücre süspansiyonu aktarın ve 15 dakika boyunca yerçekimi ile oturmasına izin verin. </li><li> çözeltisi 100 ul hücre üzerinde kalması - dikkatle 50 böyle bir transfer pipeti ile süpernatantı. Önceden ısıtılmış, dengelenmiş kültür ortamı (Tablo 1) 10 ml ilave edilir ve özenli bir şekilde ters karıştırılır. Kardiyomiyositlerde 15 dakika yerçekimi tarafından yerleşmek için izin verin. İPUCU: istediğiniz gibi adımı 1.4.8 tekrarlayın, saflığını artırmak için. </li><li> 100 ul o - dikkatle bir transfer pipet gibi sadece 50 ile süpernatant kaldırmakf çözüm hücreleri üzerinde kalır. </li></ol></li></ol> 2. kardiyomiyosit Kültür <ol><li> Ön kaplama, doku önce hücreler, kaplama 2 saat boyunca 37 ° C &#39;de laminin (10 ug / ml) ve mağaza ile Petri kapları kültür işlemden geçirildi. Hemen önce, kaplama, doku kültürü plaka laminin çözüm aspire. MEM veya PBS ile bir kez yıkayın, daha sonra sigara adsorbe laminin kaldırmak için kalan sıvı aspire. </li><li> Istenen hücre yoğunluğu elde hafifçe ters çevirerek karıştırın kadar ön-ısıtılmış, dengelenmiş kültür ortamı eklenir. (- 20 x 10 4 hücre / cm2, tipik olarak 5) plaka kültür kabına hücre konsantrasyonu istenilen. Kardiyomiyosit izolasyon verimi değerlendirmek için, bir mikroskop altında yoğunluğunu kontrol ederek hemasitometre veya test-plaka üzerinden hücreleri saymak. Protokol bu aşamada 1.0 x 10 6 hücre - Bir yetişkin fare kalp tipik 0.5 sağlar. İPUCU: 96 kuyucuğu kullanıyorsanız, 1000 ul micropip kullanın45 ° açıyla kesilmiş bir ucu ile ette kuvveti kayma nedeniyle hücre hasarı en aza indirmek için. Bu kabarcıkların giriş en aza indirmek için, hücre süspansiyonunun püskürtülmesi sırasında kuyusunun alt temas edilecek şekilde pipet yerleştirin. </li><li> % 5 CO 2 ve% 95 nem ile 37 ° C inkübatör derhal hücre kültür çanak taşıyın. asitlenme önlemek için gerektiği gibi medya değiştirin: Her 1-5 günde hücre yoğunluğuna bağlı olarak değişir. Hücre kültürü yüzeyine bağlanmasını kolaylaştırmak için 6 gün - ilk 3 sırasında kültür çanak işlemeyi en aza indirmek. NOT: hücrelerin tam takılı değil iken, medya değişiklikleri sırasında hücre rahatsızlığı en aza indirmek yarım medya değişikliğini gerçekleştirmek için. Sadece medya yüzeyinin altında pipet tutarken yavaşça medya aspire. Sonra yavaş yavaş sadece kültür çanak duvara medyanın yüzeyi üzerinde pipet tutarak ek medya ekleyin. </li><li> kardiyomiyositlerinin canlılığını değerlendirmek için, kontrolaydınlık mikroskobu altında morfolojisi. Taze izole edilmiş kardiyomiyositlerde aydınlık aydınlatma altında keskin tat kenarlı kabaca çubuk şeklinde bir yapıya (Şekil 2) muhafaza. NOT: tripan mavisi ile hücrelerin boyanarak canlılığı onaylayın. </li><li> Kardiyomiyosit izolasyon saflığını değerlendirmek için, kardiyomiyositlerde tanımlamak için hücre morfolojisi kontrol edin. toplam hücreleri belirlemek için Hoescht 33342 ile çekirdekleri leke. Not: Kardiyomiyositler karakteristik morfolojisi (çubuk şeklinde) ve boyutuna göre olmayan kardiyomiyositlerde arasında tespit edilebilir (yaklaşık 100 - uzunluğu 200 um). Alternatif olarak, taze izole kardiyomiyositlerde alfa-aktinin 26 (Şekil 3C, D) veya kardiyak troponin T 27 olarak kardiyomiyosit-spesifik belirteçler, pozitif leke olacak </li></ol> Adenovirüs 3. gen transdüksiyonu <ol><li> Kurulan m kullanarak adenovirüs hücre lizat hazırlanmasıö n- tem. 21 adenovirüs üretici hücreleri 10 hücre lisatı kullanılarak kardiyomiyositlerde transdüksiyonu. izolasyon gün sonra, 0 veya 1. günde, dikkatli bir şekilde kardiyomiyositlerde içeren ortamda hücre lizatı ekleyin. NOT: yüksek titre adenovirüs hazırlık yaklaşık 48 güçlü ifade başaracaktır - 72 saat. deneysel tasarım uygun enfeksiyon çokluğu ayarlayın. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

İzole kardiyomiyositlerinin genel sağlık Bu protokolün birkaç önemli yönlerini bağlıdır. İlk olarak, perfüzyon kalp çıkartılmasından süresi önemli ve 5 dakika veya daha kısa sürede yapılmalıdır. Kalsiyum çıkarılması hücre-hücre etkileşimleri ayırmak yardımcı olur, ancak negatif hücre sağlığı uzun vadeli etkileyebilir. 29-32 Böylece, bu yeterli EGTA tarafından perfüzyon ilk birkaç dakika boyunca kalsiyum kaldırmak için (etilen glikol tetraasetik asit) şelasyon bulma...

Kültürlü kardiyomiyositlerde sıklıkla in vitro iyi kontrollü bir ortamda hücre davranışlarını izlemek için kullanılır. Örneğin, morfolojik, elektrik, biyokimyasal veya mekanik hücre özellikleri, oluşturulmuş ortam içinde 1,2 ve küçük moleküllü ilaçlar, peptid, gen düzenlenmesi, 3 ya da elektriksel uyarıya tepki olarak tasarlanmış substratlar üzerinde incelenebilir. 4, hücresel içeriği olabilir Ayrıca, tanımlanan eş-kültür ile kontrol edilebilir. 5 Bu in vitro deneyler, büyük ilaç ya da genetik ekranlar yararlıdır ve kardiyomiyosit biyoloji içeren araştırmalar çeşitli in vivo yöntemlerinde tamamlar. Uzun süreli kültür fenotipik değişim elde etmek için zaman uzun zaman gerektirebilir deneysel yollar sağlar. Zamanında bir örnek olduğunu dediferansiyasyon hücre döngüsü yeniden giriş ve hücre bölünmesi genellikle üzerinde çalışılan se Erişkin memeli kardiyomiyosit çoğalması, biridirhaftaya veral gün. Burada 6,7, uzun kültür süresi, genetik manipülasyon, 7,8 işlevsel farklılaşma bozukluğunun (örneğin, sarkomerik demontaj) 9 ve potansiyel transkripsiyon dediferansiyonunu kolaylaştırır. 6 sonraki hücre döngüsü yeniden giriş ve hücre bölünmesi daha uzun kültür dönemleri gerektirmektedir bölünme birden mermi deneysel hedef, özellikle gözlemlemek. Kardiyomiyosit hücre döngüsünün önemi önceden mevcut kardiyomiyositlerinin farksızlaşma ve çoğalması zebrabalıkları ve neonatal farelerde kalp rejenerasyon sorumlu gösterilmiştir kalp rejenerasyon, birkaç yeni anahtar bilimsel çalışmalar için merkezi. 10-12 Böylece, olasılık memeli yetişkin kardiyomiyositlerde farksızlaşma ve hücre döngüsü yeniden giriş uyarmak için insan kalbi rejenerasyon 13-15 anahtar soruyu kalır Ben n memeli kardiyo hücre döngüsünü okuyan in vitro deneylermiyositler ağırlıklı nedeni fare modelleri ile karşılaştırıldığında uzun dönem kültür göreceli kolaylığı, sıçan kaynakları kullanılmıştır. 16 Bununla birlikte, faregiller sistemlerinin her ikisi de, in vitro ve in vivo olarak yararlı olan, iyi karakterize transjenik araçları ve hastalık modellerinde zengin bir kaynak sunar protokoller. Örneğin, Cre tabanlı soy izleme in vivo yenidoğan fare kalbinde miyokard rejenere kaynağı olarak önceden varolan kardiyomiyositlerinin belirlenmesini sağladı. Soy-takip yenidoğan fare kardiyomiyositlerde 12 In vitro çalışmalar stromal ile etkileşimlerin inceleme sağlamıştır fibroblastlar ile ko-kültür yoluyla hücreler. 5 Ancak, onun zorluklar nedeniyle, 17 birkaç rapor yetişkin fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu ve uzun vadeli kültürü var. 18,19 yalnız kısa süreli kültür için geçerli yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu zor bir görev olduğu bilinmektedir. Bu protocol kısa vadeli hem de uzun vadeli soruşturma hem de kullanılabilir yetişkin farelerin canlı kardiyomiyositlerde ulaşmak için nasıl adım adım yönergeler sağlar. Bu protokolü kullanılarak izole kardiyomiyositlerde verimli adenoviral vektörlerin hafta boyunca 20,21 ve kültürlü kalıt edilebilir. Bu yöntemler, in vitro kardiyomiyosit biyolojisi okumak için güçlü sistem sağlar. Burada tarif edilen yöntemler Langendorff retrograd perfüzyon varyasyonları kullanarak önceki eserlerinden çeşitli unsurları dayanmaktadır. 18,22 birkaç protokoller kısa süreli kültür ve çalışma, 23-25 ​​avantajı için yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu yayınlanan olmasına rağmen Bu protokol kültürüne yeteneği izole kardiyomiyositlerde uzun vadeli olduğunu. Bu ektopik gen ekspresyonunu içeren ve hücre yeniden programlama stratejileri gibi uzun süreler gerektiren hücresel süreçlerin çalışmasında yararlı olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Equipment</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heated water jacket</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Circulating heated water bath, Isotemp</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Laboratory pump</td>
			<td style="width:148px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:99px;">323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hemostats</td>
			<td style="width:148px;">Exelta</td>
			<td style="width:99px;">63042-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue forceps</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">470128034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 curved forceps</td>
			<td style="width:148px;">FST</td>
			<td style="width:99px;">91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:148px;">FST</td>
			<td style="width:99px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small dissection scissors</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">470128034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Extra fine bonn scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td style="width:99px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Fine spring scissors</td>
			<td style="width:148px;">FST</td>
			<td style="width:99px;">91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Name</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Materials</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NaCl</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">KCl</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4-7H2O</td>
			<td style="width:148px;">Fisher</td>
			<td style="width:99px;">S25837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4-7H2O</td>
			<td style="width:148px;">Fisher</td>
			<td style="width:99px;">S25414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taurine</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">86329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Butane dione monoxime (BDM)</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:148px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:99px;">BP310100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">G-7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Insulin</td>
			<td style="width:148px;">Novo Nordisk</td>
			<td style="width:99px;">393153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">EGTA</td>
			<td style="width:148px;">Amresco</td>
			<td style="width:99px;">0732-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Protease, type XIV</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:148px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">MEM</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:99px;">15-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">FBS, heat inactivated</td>
			<td style="width:148px;">JRS</td>
			<td style="width:99px;">43613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Primocin</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:99px;">NC9141851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Ethyl Carbamate</td>
			<td style="width:148px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:99px;">AAA44804-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:295px;">215 micron mesh</td>
			<td style="width:148px;">Component supply</td>
			<td style="width:99px;">U-CMN-215-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">20 G blunt ended needle</td>
			<td style="width:148px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:99px;">305183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">20 G beveled needle</td>
			<td style="width:148px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:99px;">305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Lab tape</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">89097-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:295px;">Surgical tape</td>
			<td style="width:148px;">3M</td>
			<td style="width:99px;">1527-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Silk suture, 7-0</td>
			<td style="width:148px;">Teleflex</td>
			<td style="width:99px;">15B051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mouse anti-alpha-actinin antibody</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">A7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:99px;">A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes

Kültürlenmiş kardiyomiyositlerde vivo sistemler tamamlayıcı olan teknikler kullanılarak kardiyomiyosit biyolojisi okumak için kullanılabilir. Örneğin, in vitro kültür saflığı ve erişilebilirlik biyokimyasal analizler, canlı görüntüleme ve elektrofizyoloji üzerinde hassas kontrol sağlar. kardiyomiyositlerinin uzun süreli kültür kısa vadeli kültürlerde tamamlanamaz ek deneysel yaklaşımlara erişim imkanı sunmaktadır. Örneğin, dediferansiyasyon hücre döngüsü yeniden giriş ve hücre bölünmesinin in vitro soruşturma şimdiye kadar büyük ölçüde uzun vadeli kültüründe daha sağlam gibi görünen sıçan kardiyomiyositlerde, sınırlı olmuştur. Ancak, transgenik fare hatları ve iyi gelişmiş hastalık modellerinde zengin bir araç seti durumu kalp araştırma için fare sistemleri cazip kılmaktadır. çeşitli raporlar yetişkin fare kardiyomiyosit izolasyon bulunmasına rağmen, az sayıda çalışma uzun vadeli kültürünü göstermektedir. Burada yer alan, bir adım adım bir yöntemdiryetişkin fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu ve uzun süreli kültür. İlk olarak, retrograd Langendorff perfüzyonu etkin gravite sedimantasyon, ardından arıtma için proteazlarla kalp sindirimi için kullanılır. farksızlaşma Aşağıdaki izolasyon bir süre sonra, hücreler giderek kültür tutunur ve hafta içinde kültürlenebilir. Adenovirüs, hücre lisatı etkin izole kardiyomiyositlerde transduse etmek için kullanılır. Bu yöntemler kalp biyoloji okumak için basit, ama güçlü bir model sistemi sağlar.

Bir vahşi tip yetişkin ICR (CD1) fare kalp tipik başarılı bir izolasyondan 500.000 ile 1 milyon kardiyomiyositlerde verir. Hemen izolasyonundan sonra, hücreler, sağlam sarkomer bir çok çubuk biçimli bir görünüm (Şekil 3A) korumak ve kardiyomiyosit kasılma ile ilgili fonksiyonel çalışmalar için de kullanılabilir. çubuk şeklindeki kardiyomiyositlere (% 90 üzeri) yüksek bir yüzdesi etkili perfüzyon ve sindirim bir göstergesidir. Canlı Kardiyomiyo...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

isolation-culture-and-transduction-of-adult-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

26.5K Görüntüleme.  University of California, San Francisco. This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability. 

Video: Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...