Bu teknik daha güvenilir ve verimlidir ve en yaygın kullanılan Langendorff aparat tekniklerine kıyasla kapsamlı bir uygulama veya eğitim gerektirmez. Bu tekniğin temel avantajı, ilk perfüzyon in vivo olarak gerçekleştiği için iskemik zamanı sınırlamasıdır. Bu tekniği uygularken, manifolddaki kabarcıklardan kaçınmak ve sindirim sırasında kalbin aşırı hareketinden kaçınmak önemlidir, bunlar verimi düşürebilir.
Bu tekniği gösteren, Dr. Mark Ziolo'nun laboratuvarında yüksek lisans öğrencisi olan Sarah Sturgill olacak. Yeni hazırlanmış perfüzyon tamponunu kullanarak sıcaklık kontrollü manifoldun temizlenmesiyle başlayın. Bunu yapmak için, 27 gauge'lik bir iğneye vidalayın ve bir luer kilit konektörü kullanarak kabarcıkları temizleyin.
Hiçbir kabarcık kalmadığından emin olun. Kardiyomiyositi izole etmek için, tamamen anestezi uygulanan farenin sternumunu ve orta hatta yanal olarak maruz bırakın, kaburgalardan ve aksilladan proksimal olarak kesin. Daha sonra diyaframı kesin ve kalbi önlemek için sığ kesimler sağlayın.
Sternumu bir hemostatla sıkıştırın ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburgaları geriye doğru katlayın. İnferior vena kava'yı hemen kalbe distal kesmeden önce perikardı kalpten yavaşça çıkarın. 27 gauge'lik bir iğne kullanarak bir dakika boyunca kalbin sağ ventrikülüne üç mililitre buz gibi soğuk temizleme tamponu enjekte edin.
Ardından, cımbız kullanarak kalbi tutun. Vücuttan uzağa çekin ve aortun mümkün olduğunca çoğunu açığa çıkarın. Daha sonra yükselen aortu bir hemostat kullanarak kelepçeleyin ve kalbi eksize edin.
Kelepçeli kalbi hızlı bir şekilde 10 mililitre sıcak perfüzyon tamponu içeren bir polipropilen Petri kabının kapağına aktarın. Kelepçeli kalbi destek platformuna yerleştirin ve manifolda bağlı stabilize edilmiş 27 gauge iğne kullanarak beş dakika boyunca sol ventriküle 37 santigrat derecede 10 mililitre sıcaklık kontrollü perfüzyon tamponu enjekte edin. Ardından, kelepçeli kalbi ve destek platformunu yaklaşık beş mililitre sindirim tamponuna sahip bir Petri kabına aktarın.
Giriş şırıngalarını, 25 mililitre sindirim tamponu içeren 50 mililitrelik bir şırınga için değiştirin. Enjeksiyondan önce herhangi bir kabarcığın manifoldunu ve kalan perfüzyon tamponunu temizleyin. İğneyi dikkatlice sol ventrikül tepesindeki aynı iğne pozisyonuna yerleştirin.
Bir perfüzyon pompası yardımıyla, 50 mililitrelik bir şırınga kullanarak 15 dakika boyunca sol ventriküle 37 santigrat derece sindirim tamponu enjekte edin. Çözeltinin sıcaklığını, 37 santigrat derece çözeltiyi çıkarmak için kalibre edilmiş bir su ceketi ile kontrol edin. Ventrikülleri 10 mililitrelik bir behere aktarmadan önce atriyumdan çıkarın.
Beherin içine üç mililitre sindirim tamponu ekleyin ve ventrikülleri keskin makas kullanarak büyük parçalar halinde kesin. Beheri alüminyum folyo ile örtün ve beş dakika boyunca 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış sallanan bir su banyosuna yerleştirin. Süpernatanı attıktan sonra, doku parçalarını üç mililitre sindirim tamponunda yeniden askıya alın ve yaklaşık dört dakika boyunca veya homojen bir karışım elde edilene kadar tritüre edin.
İşiniz bittiğinde, hücreleri 70 mikrometrelik naylon hücre süzgeci kullanarak 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe filtreleyin. Naylon hücre süzgecini üç mililitre sindirim tamponu ile yıkayın. Filtratı 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir polipropilen tüpe geri koyun ve santrifüj edin.
Peletleri üç mililitre durdurma tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın. Hücre süspansiyonuna, nihai kalsiyum klorür konsantrasyonunu 1.8 milimolar yapmak için 54 mikrolitre 100 milimolar kalsiyum klorür stoğu ekleyin. Canlı hücrelerin 10 dakika boyunca yerleşmesine izin verin ve ölü hücreler içeren süpernatantı çıkarın.
Pelet bir depolama çözeltisinde yeniden askıya alındıktan sonra, hücreler fonksiyonel deneyler ve kültürler için kullanılabilir. İzole hücrelerin parlak alan mikroskop görüntüleri, fare kardiyomiyositlerinin izolasyonunun, membran lekeleri veya yuvarlak kenarları olmayan çubuk şeklinde sessiz hücreler ürettiğini göstermiştir. Hücreler, izolasyon tekniğinin başarısını belirleyen yaklaşık% 80 verim ve yüksek sağkalım oranları göstermiştir.
Başarılı bir izolasyon için, kabarcıkları manifolddan çıkarmak ve iğneyi kalpteki aynı deliğe sokmak en önemlisidir. İzole edildikten sonra, kardiyomiyositler hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için kullanılabilir.
