Biz yazının eleştirel okuma ve bu çalışmanın kurs boyunca yaptıkları tartışmalar için laboratuvar diğer üyeleri için Mei Ann Lim ederim. Bu çalışma Yamada Bilim Vakfı ve Royal Society Kısa ziyaret Burslar ve KK AB Marie Curie Uluslararası Gelen Bursu GRR ve BBSRC Projesi Hibe (BB/H002278/1) ve Wellcome Trust Ekipman Hibe (073228/Z/03/Z) tarafından finanse edilmiştir AH

1. Koleksiyonu Larva Sahnelenen <ol><li> Sıra 15 kadın ve silindirik bir Perspex kafeste 15 erkek yetişkin sinekler 25 az 3 saat süreyle yapıştırın maya küçük kepçe ° C ile desteklenmiş agar ve üzüm suyu ile bir Petri kabı yumurtalarını bırakmak için Bir gün plaka 3-4 kez değiştirin ve ilk plaka (O / N yumurta-lay dan yani) atın. Ayrıca ilk günden itibaren plakalar atın. Üzerindeki ikinci günden itibaren, 25 yumurta ° C ile plakaları tutmak Yumurta toplama 7 gün sonra, yeni bir üst sinekler kurmak ile başlar. </li><li> Sonra yaklaşık 24 saat, yumurtalardan çıkan larvaların. Bir inceltilmiş fırça ile veya forseps bir çift ile larva çengel olarak, üzüm agar gelen standart sinek yemek (10 ml) (Şekil 1A) içeren bir şişeye 35 larva transferi. </li><li> 25 3 gün boyunca larva (Yumurta Döşeme sonra 96 ​​saat, AEL) içeren flakon koruyun ° C. </li></ol> 2. Kültür Larva Ventral Sinir Kordonlar Diseksiyon <ol><li> Olmak temizleyin% 70 etanol ile NCH ve eller. 4 boyama blok, 2 forseps çiftleri ve% 70 etanol içeren bir iğne batırın ve hava kurumaya bırakın. </li><li> Aşağıdaki medya ile 4 boyama blok hazırlayın: temizlemek ve Distile Su (DW) ile bir havuz temizliği larvaları için;% 1 penisilin ve Streptomisin, Ecdysone ücretsiz (M3 PS 2 Shield ml ve Sang M3 böcek orta ile ikinci bir larva incelemek için orta); havuzu disseke ventral sinir kablosu (VNCs) M3 PS orta 2 ml ile üçüncü ve bıçak VNCs M3 PS orta 2 ml ile dördüncü. Reaktiflerin tüm RT ön ısıtmaya tabi tutulmalıdır. </li><li> 96 saat AEL larva içeren flakon su ekleyin. Sonra, bir spatula kullanarak, hafifçe ıslak bir kağıt havlu üzerine tüpten larvaları ile gıda yayıldı. Gıda yıkayın DW içeren bir boyama blok 10 larva aktarın. DW 6 kez değiştirin. Sonra M3 PS orta ile değiştirin. </li><li> M3 PS ortam, 2 ml içeren bir lekelenme blok larvaların bir aktarın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, distandart yöntemler 12 kullanılarak dikkatlice larva beyin ssect, ancak doku hasarı en aza indirmek için, aşağıdaki şekilde ilerleyerek özel ilgileneceğim. Larva dorsal yüzü yukarı yerleştirin ve forseps 2 çifti ile anterior ucu (her biri bir el) üçte bir oranında az dorsal tarafında tutun. Anterior bölümü tutarken, forseps ile posterior ucundan uzağa çekin ve epidermisi gözyaşı. Beyin ve VNC anterior yarısı arka kenarından görünür olmalıdır. Dikkatle vücut yağ, gut ve epidermis kaldırarak beyin ve VNC kompleksi izole. VNCs çok zarar olduğunda, VNCs yaralanma bıçaklama olmadan bile tamamen veya kısmen dejenere olacaktır. Dikkate aşağıdaki noktaları atın: </li></ol><ul><li> Çekin veya bu VNC zarar verecektir torasik VNC gelen hayali diskler ve periferik sinirleri gözyaşı etmeyin. Periferik sinirleri kesmek için, birbirine yakın yerleştirilmiş forseps, iki çift periferik sinirleri basılı tutun ve sonra için ile sinirlerin çekinceps. Hayali diskler ve ağız parçaları VNC bağlı bırakılabilir. </li><li> Beyin ekli halka bezi ve lenf bezi bırakın. </li><li> Çok olmayan gıda içerdiği beyin, en yakın olan bir noktada bağırsak kesin. </li></ul><ol start="6"><li> Ucu kesilmiş ve biraz genişletilmiş bir P20 Pipetman kullanarak, taze M3 PS orta içeren bir boyama blok VNC aktarın. Uç yapışmasını VNC önlemek için teşrih için kullanıldığında, yalnızca orta aşağı VNC, birinci pipet kadar iletim ve önce. </li></ol> 3. Drosophila larval VNC Sakatlık Stabbing Bu bölümde VNCs amacıyla bıçaklama yaralanması gerçekleştirmek için, ve time-lapse analiz ve immun için bıçaklandı-VNCs nasıl hazırlanacağını anlatır. Post-bıçaklama kültür şartları ve süresi bölüm 5 (hızlandırılmış analiz için) ve Bölüm 6 (immun için) olarak ifade edilir. <ol><li> Time-lapse için (4-5 yeterince VNCs havuzu sonrave transferi bir VNC), immün için 24 üzerinde M3 PS içeren temiz bir boyama blok. </li><li> Doğu VNC yani sırta ait neuropile mikroskop (Şekil 1B) altında görünümünde olmasıdır. Bu optik loblar eklenmesiyle yalan VNCs için en doğal bir yönelimdir. </li><li> Stab elle dik açı neredeyse dorsal taraftan, diseksiyon mikroskop altında bir tungsten iğne kullanılarak ve VNC karın yarısı (Şekil 1B) hedefliyor. </li></ol> Aşağıdaki özellikle dikkat edin: <ul><li> Sadece bir kez Stab. </li><li> Iğne kadar Stab cam alt vurur. Ancak, iğne ucu zarar vermemek için dikkatli olun. </li><li> Iğne tutucu gövde bıçaklama boyunca ortam temas etmemelidir. </li><li> Yara diseksiyon mikroskop altında görülebilir değildir. </li></ul> Not: Stab-yaralanma ilgisiz dejenerasyonu ProsedürBıçaklama lezyondan VNC ayrı içinde hücre dejenerasyonuna neden olabilir. Neuropile delik içinde Dejenerasyon sonuçları ve bazen delikleri olmayan bıçakladı numunelerin korteks gözlenmiştir. Etkileyen neuropile veya yaygın dejenerasyonu etkileyen dejenerasyonu olan örnekler de VNC yüzey atılmalıdır. Dejenerasyon aşağıdaki gibi tanımlanabilir: <ul><li> Özellikle bıçaklama 22 saatte toraks ventral lateral / alanda, Pürüzlü yüzey. Aşırı durumlarda, VNC çıkıntı görünüyor. </li><li> Floresans immünorektivitesi ile arka sinyal delikler gibi görünür olabilir torasik neuropile delikler veya vakuoller,. </li></ul> 4. İğne ve Forseps Bakım <ul><li> Rutin iğne ucu kadar keskin olup olmadığını kontrol edin. İğne ucu çeşitli deneyler için kullandıktan sonra bükülmüş veya künt olabilir. Bu durumda, bir Arkansas taş ya da eşdeğerini kullanarak uç keskinleştirmek. </li><li> Forseps ipuçları gerekirmükemmel buluşuyor. Ipuçları kullanımı ile zarar görebilir. Bu durumda, bir Arkansas taşlar ya da eşdeğerini kullanarak uç ayarlayın. </li></ul> 5. Stabbed VNCs Kültür ve Time-lapse kayıt G9 - 13 - yaşayan VNC, tüm etiketler aksonların bir GFP protein tuzak doğrultusunda aksonal neuropile görselleştirmek için kullanılabilir, ve glial sürücü repoGAL4 UASdsRed ifade etmek için kullanılabilecek bütün glial hücreler (glia orta hat dışında) görselleştirmek S197Y 14 muhabiri. Crossing G9 tarafından UASdsRedS197Y uçar;; repoGAL4 sinekler, döl larva VNCs canlı dokuda kaydedilebilir yeşil akson ve kırmızı glia ile elde edilir. <ol><li> Havuzlama 4-5 VNCs sonra, 2 M3 PS ml ve bıçaklama VNC karın yarım ihtiva eden bir temiz boyanması blok transferi 1 VNC olarak bölüm 3&#39;te gösterildiği. </li><li> M3 1 ml içeren Poly-L-Lysin kaplı 3,5 mm cam alt Petri kabı bıçakladı VNC aktarınPS. Aşağı VNCs sırt tarafında yerleştirin. Yavaşça VNC çanak sopa izin forseps bir çift düz tarafı kullanarak VNC itin. </li><li> Yavaşça% 7.5 FBS son konsantrasyon işleme M3 PS% 15 FBS ve 1 ml ekleyin. </li><li> Konfokal mikroskobu lazer kullanarak görüntü elde edin. Onun bütün kalınlığı boyunca bir Z-bölüm dizi toplama, VNC tarayın. Biz bir sıcaklık kontrollü çevre bölmesi ile Leica SP2 ters konfokal mikroskop kullanılır. Herhangi eşdeğer konfokal mikroskop çalışması gerektiğini, ancak tarama ayarlarını optimize gerektirebilir. Aşağıdaki gibi zaman atlamalı konfokal mikroskopi için ayarlar vardı: Çevresel odasının Sıcaklık: 25 ° C; 4 kez zoom 20X objektif; 512x512 piksel çözünürlük ile tarama modu xyzt, z = 1 mikron adımları ve 1 saat veya 2 - saat aralıklarla. </li></ol><ul><li> Leica SP2 konfokal mikroskop tarama için dosya boyutu sınırlaması vardır. Bu ayarlarla, 8-9 zaman noktalarında taranabilir. IleDiğer konfokal mikroskoplar, o yani en fazla 24 saat kadar yayılma üzerinde, uzun süre puan için görüntü yığınlarından elde etmek mümkün olmalı. </li></ul> 6. Bıçaklanmış ve Sabit VNCs Kültür ve İmmun Boyamanın <ol><li> Kuyu başına M3 PS 7.5% FBS 500 ul içeren 24 iyi doku kültürü plaka hazırlayın. </li><li> 24 iyi doku kültürü çanak için fazla 24 VNCs diseksiyonu tekrarlayın. </li><li> Ucu kesme ile P20 Pipetman kullanarak, kuyu başına 1 VNC kullanarak, kültür çanak için havuzdan 12 sigara bıçakladı VNCs aktarın. </li><li> Bölüm 3&#39;te tarif edildiği gibi havuz içinde VNCs bir bıçakla kalanı. Bir de her her bıçakladı VNC aktarın. </li><li> Deneye bağlı olarak istenen bir süre için 25 ° C inkübatör içinde 24 oyuklu çanak yerleştirin. Hücre bütünlüğünü en az 24 saat boyunca değişmeden olduğunu. </li><li> Kültür sonra, uç kesme ile P20 Pipetman kullanarak, bir 1.5 ml tüp içinde% 4 formaldehit PEM 250 ul içinde 12 VNCs aktarın. Daha sonra, fixative dikkatle VNCs zarar vermemeye özen üzerinden pipet. Örnekleri karşılamak için sabitleştirici yeterli bir miktar her bir tüp içinde kalmalıdır. Daha sonra, taze fiksatif ekleyin ve hafifçe RT 50 dakika karıştırılır. </li><li> % 0.3 Triton X PBS ile 2 kere yıkayın, sonra oda sıcaklığında% 0.3 Triton X PBS ile 10 dakika süreyle 2 kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.3 Triton X PBS içerisinde% 10 normal keçi serumu ile inkübe edilerek Blok VNCs. Örnekler, en az bir ay için 4 ° C sıcaklıkta saklanabilir. </li><li> 4. en fazla 20 saat için primer antikorlar ile inkübe VNCs ° C. </li><li> Oda sıcaklığında% 0.3 Triton X PBS ile 10 dakika için 3 kere yıkayın, sonra% 0.3 Triton X PBS ile 2 kez yıkayın. </li><li> 4 de daha 16 saat süreyle ikincil antikor ile inkübe VNCs ° C. </li><li> Oda sıcaklığında% 0.3 Triton X PBS ile 10 dakika (floresan ikincil antikorlar kullanılarak eğer karanlıkta) için 3 kere yıkayın, sonra% 0.3 Triton X PBS ile 2 kez yıkayın. </li><li> En azından bir% 50 PBS:% 50 gliserol ile yerine PBSsaat. </li><li> Sonra% 80 gliserol ile değiştirin:% 20 PBS en az bir saat için. </li><li> Bir mikroskop cam slayt üzerine viyolonsel-bant 2 kat (yaklaşık 0,06 mm) yapılan bir pencerede bir VNC monte edin. Yönünü ayarlayın ve pencerenin üzerinde bir lamel (18x18 mm) yerleştirin. İki VNCs Bu yöntemi kullanarak bir slayt üzerine monte edilebilir. </li></ol> Farklı hücresel yanıtları (hücre sayısı ve hücre şekli örneğin değişiklikler) analiz edilebilir, primer antikorlar çeşitli yaralanma kullanma. 7. ImageJ ve Eklentiler bir Aralığı Kullanarak Veri Analizi VNC ilgisiz dejenerasyonu bıçaklama yoksa, örnek olsun lezyon boyutu analizi için sayılır olmalıdır. Bıçaklama elle yapıldığı gibi, lezyon boyutu her zaman farklıdır. Böylece istatistiksel olarak mümkün, bıçaklama etkisini analiz etmek önemlidir. <ol><li> Boyut ölçümü Yara. Yaranın büyüklüğü onarım 15 bir göstergesidir.Bıçaklama lezyon GFP ifade yoksun olarak görünür. Aşağıdaki gibi lezyon alanı, serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılımı kullanılarak veri hızlandırılmış ölçülebilir: <ol><li> ImageJ kullanarak, &quot;Dosya&quot; menüsünden konfokal görüntüleri bir yığın açın, &quot;İthalat&quot; ve buradan &quot;Görüntü dizisi&quot; seçeneğini seçin. Bu bir yığın içine bireysel görüntüleri koleksiyonu dönecek. </li><li> Sonraki &quot;Image&quot; menüsüne giderek bir &quot;Hyperstack&quot; içine &quot;yığın&quot; değiştirmek &quot;Hyperstack&quot; seçin, ardından &quot;Hyperstack için Stack&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Image&quot; menüsünden &quot;Özellikler&quot; kullanılarak voksel boyutu ayarlayın. Veriler Leica SP2 konfokal mikroskop kullanılarak elde, voksel boyutu tarama-yazılım elde edilen ve meta metin dosyasından görüntü ile birlikte kaydedilebilir. , Bölüm 3&#39;te anlatılan bizim ayar ile, piksel boyutları xy = 0,366211 mikron ve z = 0,99709 mm&#39;dir. </li><li> Bir zaman noktasında tüm dilimleri inceleyerek, araç çubuğunda çokgen seçim aracını ile lezyon alanının maksimum anahat çizin. Buİlgilenilen Bölge (ROI). </li><li> &quot;Analyze&quot; menüsüne giderek ROI yöneticisine ROI Ekle, aşağı kaydırın ve &quot;Araçlar&quot;, ardından &quot;ROI yöneticisi&quot;, ardından &quot;Ekle&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Her zaman noktaları için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Her bir ROI alanının boyutu elde etmek için ROI yöneticisi &quot;Tedbir&quot; düğmesine tıklayın. </li></ol></li><li> Time-lapse kayıt sırasında VNC hareketin düzeltilmesi. &quot;Stackreg&quot; ve &quot;Turboreg&quot; plugins 16 (ImageJ web sitesinden <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ): bu eklentiler zaman atlamalı sırasında küçük bir örnek hareketleri düzeltmek için izin verir. Tüm zaman noktalarında ile eşdeğer bir temsili optik bölümü ile bir yığın oluşturun ve eklentileri geçerlidir. Bu zaman içinde nasıl lezyon değişiklikleri görselleştirmek için yardımcı olur. Bu yöntemler ve kullanım kılavuzu ile ilgili ayrıntıları bu eklentileri geliştirilen araştırma grubu mevcuttur. ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/" target="_blank">http://bigwww.epfl.c</a>h / Thevenaz / stackreg /). </li><li> Glial hücre sayımı otomatik. &quot;DeadEasy glia&quot; eklentisi ( <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html</a> ): Bu Drosophila larva VNC içinde REPO-pozitif glial hücre sayısını saymak ve glial değişimi incelemek için geliştirilmiştir numarası yaralanma 17 bıçaklama kaynaklanır. Plug-in 0.1% yanlış pozitif ve% 4,3 yanlış negatifler 17 lik bir hata ile, doğru çalışır. Bu plug-in, ilk etiket anti-REPO antikorlar ile immünofloresan kullanarak numune tüm glia (orta hat dışında) kullanın. Sonra yüklemek eklenti ImageJ yılında, konfokal görüntüleri bir yığın açın ve plug-in çalıştırın. Yaklaşık 30 saniye içinde otomatik olarak glial hücreleri sayar. </li><li> Apoptotik hücre Otomatik sayma. &quot;DeadEasy Kaspaz larva&quot; plug-in ( <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.bioscienc</a>es-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Bu anti-yarılan-Caspase3 etiketli hücre sayısını saymak için geliştirilen ve yeni bir sürüm larva VNCs için adapte edilmiştir. Saplama hasar programlanmış hücre ölümü 11 &#39;de bir artışa neden olur. Kullanmak için bu plug-in anti-yarılan-Kaspaz-3 antikorlar ile immünofloresan kullanarak numunede ilk etiketi apoptotik hücreler. Sonra yüklemek eklenti ImageJ yılında, konfokal görüntüleri bir yığın açın ve plug-in çalıştırın. Yaklaşık 30 saniye içinde otomatik olarak apoptotik hücreleri sayar. </li></ol> 8. Reaktifler <ol><li> Kültür ortamı: kalkan ve Sang M3 böcek ortam,% 7.5 fetal bovin serumu,% 1 penisilin ve% 1 streptomisin. </li><li> % 0.01 steril DW Poly-L-Lysin. </li><li> Sabitleme:% 4 formaldehit, PEM Ultra saf (0,1 M BORULAR, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4) çözümü. </li><li> Immun için Engelleme çözüm:% 0.3 Triton X PBS içinde% 10 normal keçi serumu. </li><li> Anti-Glutamin sentetaz2 antikorları: çözümü engelleme 1:250. </li><li> Anti-GFP antikorları: çözümü engelleme 1:1,000. </li><li> Anti-REPO antikorları: çözümü engelleme 1:250. </li><li> Anti-ELAV antikorları: çözümü engelleme 1:250. </li><li> Anti-yarılan Kaspaz 3 antikorları: çözümü engelleme 1:1,000. </li><li> İkincil antikorları: çözümü engelleme 1:250. </li></ol>

<ol>
	<li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity.">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li><li>Leyssen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+promotes+post-developmental+neurite+arborization+in+the+Drosophila+brain.">Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain.</a> EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).</li><li>Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+programmed+cell+death+induces+glial+cell+division+in+the+adult+Drosophila+brain.">Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain.</a> Development. 136, 51-59 (2009).</li><li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).</li><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bases+of+behavioral+plasticity:+establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+genetic+system.">Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li><li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva:+more+sense+than+luck.">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).</li><li>Schleyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavior-based+circuit+model+of+how+outcome+expectations+organize+learned+behavior+in+larval+Drosophila.">A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila.</a> Learn Mem. 18, 639-653 (2011).</li><li>Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-285 (2006).</li><li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+pros-notch+and+pros-NFkappaB+feedback.">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila protocols. , (2000).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>Verkhusha, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+mutant+of+red+fluorescent+protein+DsRed+for+double+labeling+and+developmental+timer+of+neural+fiber+bundle+formation.">An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation.</a> J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).</li><li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+Pros-Notch+and+Pros-NFkB+feedback.">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).</li><li>Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+cell+counting+in+vivo+in+the+larval+nervous+system+of+Drosophila.">Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila.</a> J. Microsc. 46, 202-212 (2012).</li><li>Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeadEasy+caspase:+automatic+counting+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila.</a> PLoS One. 4, e5441 (2009).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li><li>Nicolai, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+dendritic+marker+sheds+light+on+neuronal+connectivity+in+Drosophila.">Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li></ol>

Herhangi bir çıkar çatışması ilan etti.

Biz yaralanma, onarım ve yenilenmesi için hücresel yanıtları incelemektir Drosophila larva MSS yaralanması bıçaklama için bir protokol kurduk. Larva VNCs disseke ve zaman atlamalı mikroskopi ile filme veya glia ve nöronlara, apoptoz veya hücre bölünmesi görselleştirmek için floresan immun giderilen sonra, bıçaklandı edilir. Zaman içinde lezyonun ilerleme ölçülebilir. Bu yöntem yaralanması üzerine ve onarım sırasında hücre sayısı değişikliklerin niceliksel ve istatistiksel analiz için kasten geliştirilen yazılım eşlik ediyor. Biz önce pupa ve daha sonra yetişkin sineğe geçiş 96 saat AEL larvaları (ve bu sabit veya daha da geliştirmek için izin verildi), gelişimsel bir sahne bıçakladı. Onlar Üçüncü dönem sahne ortasında, ve bu nedenle henüz pupa devresi geçiren değildir;; 96 saatte, VNCs bıçaklama için yeterince büyük ve sinir sistemi zaten reklamın buna tam olarak işlevsel benzerULT. Bu biraz daha larva vurmaya mümkün olabilir ve hassas zamanlama araştırma sorusuna uygun seçilmelidir. Ancak, yöneltilen sorulara bağlı olarak, genellikle yaralanma hücresel yanıtları gözlemlemek için bir süre kültür VNCs gerekli olacaktır. 120 saat AEL pupa devresi başlar bir süre sonra, bir süre MSS remodeled ve böylece zaman iyi kaçınılmalıdır. Böylece larva artı kültür bıçaklama için zaman penceresi oldukça sınırlıdır. Larvaları kullanılarak hala yetişkinler kullanarak üzerinde büyük bir teknik avantajı vardır: benzer yetişkin, iken, sinir sistemi hasarına yanıt analiz, zaten larvaları oldukça kolay ve hızlı tamamen işlevsel olmasıdır. Bir tabak içinde kültür olmadan eşdeğer bir sonraki zaman noktasındaki disseke edilir VNCs bir çanak disseke ve kültüre beyinleri ve VNCs büyüklüğü ve morfolojisi karşılaştırırken, bu gelişme, in vivo daha kültürü yavaş görünür. Diğer açılardan,gelişimi normal kültür, doku bütünlüğü korunur ve hücreler canlı çoklu tepkiler gösteriyor sürdürmektedir. Yara genişleme, neuropile onarım ve glial proliferasyon 22 saat sonrası bıçaklama içinde yer alırlar. Bu yaralanma hücresel yanıtları kültüründe yer alan ve bir gün daha uzun eksplantlar korumak için gerek büyük olasılıkla olduğunu gösterir. Uzun süreli kültür arzu olsaydı, protokol bir kültür plaka ekleme 5 kullanma gibi daha fazla optimizasyon isteyebilir. Bu yozlaşan olanlardan kaliteli örnekleri tespit etmek önemlidir. Bu protokol Optimize bazı beceri alır ve kaçınılmaz dejenerasyonu bazı örneklerde meydana gelecektir. VNC doku bütünlüğünün bozulmasına (Şekil 5B) yansıtan bir &#39;karnabahar&#39; görünüm elde edebilirsiniz. Dejenerasyon ayrıca bağımsız olarak VNC dejenerasyon tarafından kabul edilmektedir (Şekil 5C bozulmamış, non-bıçaklandı örneklerde mevcut olabilir ki, bıçaklama </strong&gt;). Bu örnekler atılmalıdır. Dejenerasyon büyük olasılıkla sinirler ve yüzey glia ise koruyucu tabaka gözyaşı kaba diseksiyonu, kaynaklanır. Böylece büyük bir özenle yavaşça incelemek için alınmalıdır. Diğer etkileyen faktörler olarak protokolde belirtilen yıkar ve zamanlara kesinlikle kalarak temiz tutulması ve antibiyotik ile alınmalıdır kültür ortamı, içerir. Sonuç olarak, iğne iğne ve iğne tutucu, boyut ve keskinlik uzunluğu çok önemlidir. Iğne tutucu kültür ortamı bulaşabilen ve künt bir iğne kendini tamir edemez ve yozlaşmaya yol açacak büyük bir yaralanmaya neden olabilir. Bu rutin iğne keskin sürdürmek için önemlidir. Bu protokol, biz geleneksel gal4-UAS sistemini kullanarak glial süreçlerin görselleştirme paralel neuropile görselleştirmek için sinekler bir protein tuzak çizgi yararlandı. Bu araçlar, aynı zamanda, Le gibi diğer ikili ifade sistemleri ile birleştirilebilirgal4 bağımsız xA 19 ve Q-sistemi 20,. Bu hasarına yanıt olarak, akson ve glial süreçler arasında örneğin etkileşimlerin analizine olanak sağlayacak. Ayrıca, bu tür dendritler 21 veya kalsiyum girişini 22 gazetecilere gibi diğer genetik araçlar ile birleştirerek, bu yöntem glial hücreler, nöron akson ve MSS dendritlerin yaralanma tepki arkasındaki hücre biyolojisi analiz için büyük bir fırsat sağlar. Son olarak, bu yöntem yaralanma ve rejenerasyon yanıtları gen işlevi sınamak için, standart genetik mutasyonlar ve gen aşırı ekspresyonu ile kombine edilebilir. Bu protokol başarıyla MSS yaralanması 11 rejeneratif glial yanıtı yatan bir gen ağının keşfine yol açmıştır. Bu hücresel olayları ve meyve sinekleri gen fonksiyonları çözülüyor, gen fonksiyonu evrimsel korunması göz önüne alındığında ma anlayışı hakkında önemli bilgiler sağlamak için muhtemeldiryaralanma ve rejenerasyon mmalian CNS yanıtı.

Hayvanlarda Rejenerasyon hücreler organizmanın büyüme emretti ve tam zaman hissedebilir ve nasıl yapısal bütünlüğünü bir organizmanın sağlanması ve sürdürülmesi olduğunu ortaya koymaktadır. Hücrelerin bu gizemli yetenekleri anlama biyoloji ilgi büyük. Rejenerasyonu teşvik medikal sinirbilim için önemli hedeflerinden biridir. İnsanlarda hasarlı santral sinir sistemi (MSS) yenilenmez. Omurilik yaralanması Kemirgen modelleri hücrelerinin hasarı nasıl tepki anlamak için kullanılır. Ancak, etik kaygılar, yüksek maliyetler ve hayvanların yavaş yaşam döngüsü ilerleme sınırlamaktadır. Meyve sineği Drosophila gelişimsel biyoloji ve nörobilim yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır. Güçlü genetik araçları ve kısa yaşam döngüsü sayesinde, Drosophila recurrently insan ve hastalığın anlaşılması için alaka ile genlerin fonksiyonlarının ve gen ağlarının keşfine yol açmıştır. Evrimsel con bol kanıt vardırinsanlara sinekler gen fonksiyonu servation. Son yıllarda, sinir sistemi yaralanmaları için çeşitli paradigmalar Drosophila kurulmuştur. Bazı duyusal 1 ve motor aksonlar 2 dahil olmak üzere periferik sinirlerin kanat veya aksotomi koş periferik sinirlerin zarar oluşmaktadır. Ancak, periferik ve santral sinir sistemi birçok açıdan farklı, ve de birçok hayvanlarda periferik sinir sistemi CNS yapamam ise oluşturabildiği bilinmektedir. Böylece, CNS CNS rejenerasyon, doğrudan yaralanma anlamak daha uygun olacaktır. Bir iğne ile Stabbing yaralanma başarıyla yaralanma 3,4 yanıt araştırmak için Drosophila yetişkin beyin uygulanmıştır. Başka bir yaklaşım kullanarak, Ayaz ve ark. Kopmuş CNS bir Piezo elektrik microdissector sahip kültürlü yetişkin beyinlerinde aksonlar, ve 4 gün 5 için kendi rejenerasyon analiz. Bu daha sonra deney grubu u avantajıps onlar büyük ilgi şüphesiz beyin, odaklanmak olduğunu. Dezavantajı beynin sadece motor ve duyusal kontrolü ile uğraşan VNC, çok daha karmaşık olmasıdır. Erişkin beyni üzerine Çalışma aynı zamanda daha fazla zaman alıcıdır. Erişkin eclosion için yaklaşık 10 gün sürer ve sonra olgunlaşma için ek 5 gün ise larva, 4 gün içinde deneyler için hazır. Kaldırmak zordur kalın kütikül, kapsüllü çünkü yetişkin beyin, işlemek için de daha zordur. VNC omurgalı omuriliğe işlevsel olarak eşdeğer olan daha da cazibesi vardır. Drosophila larvalarının yaygın nöroloji 6-9 için bir model organizma olarak kullanılır. Kesinlikle larva konuşma bir gelişim aşamasında olmasına rağmen, aynı zamanda bir hayvan tam olarak işlevsel olarak kabul edilebilir. Larva koku alma, tat ve nosisepsiyon, öğrenme ve bellek gibi hareket, farklı duyuları vardır. Böylece, larva VNC wgibi MSS yaralanma için ideal bir model olarak seçilmiştir. Larva ve pupa VNCs hala 24 saat 10 için hücresel bütünlüğü koruyarak, çanak disseke ve kültüre edilebilir. Bu da yaralanma sonra bu süre boyunca için time-lapse kaydedilen veya bu süre içinde herhangi istenilen zaman bir noktada kültür ve sabit olabilir VNC, uygulanabilir öne sürdü. Burada, Drosophila larva VNC kullanan MSS yaralanması için deneysel bir paradigma sunuyoruz. VNC ilk larva diseke edilir ve bıçaklama yaralanma bir tungsten iğne ile manuel olarak uygulanır. VNC sonra bir cam alt lamel üzerine yerleştirilir ve konfokal mikroskobu time-lapse lazer ile çekildi. Alternatif olarak, VNCs zaman istenilen süre kültüre edilebilir ve yaralanma hücresel etkileri immun ve konfokal mikroskopi kullanılarak sabit örneklerde analiz edilebilir. Yara alanı ölçülür, ve hücre nu kantitatif analiz edilebilirmber (hücre çoğalması ve hücre ölümü) kasıtlı olarak geliştirilmiş olan yazılım ile gerçekleştirilebilir. Büyük örnek boyutları kolayca istatistiksel geçerliliği sonuçları neden ele alınabilir. Bu yöntemler başarıyla MSS yaralanması 11 glial rejeneratif yanıtı yatan bir gen ağı keşfetmek için Drosophila güçlü genetik ile kombine edilmiştir.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr><td> Blok Boyama </td><td> Brunel Mikroskop </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Forseps No: 5 </td><td> örneğin Güzel Bilim Araçları </td><td> örneğin 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Tungsten iğne: çubuk çapı 0.5 mm; ucu boyutu, 1 mikron, uzunluğu, 2 inç </td><td> Roboz Cerrahi Alet </td><td> RS-6065 </td><td></td></tr><tr><td> İğne tutucu </td><td> Roboz Cerrahi Alet </td><td> RS-6060 </td><td></td></tr><tr><td> Arkansans taşlar: Dumont Forseps için Tamir Takımı </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 29000-00 </td><td></td></tr><tr><td> 27 mm cam taban 35 mm Petri kabı </td><td> Iwaki </td><td> 3930-035 </td><td></td></tr><tr><td> Çevre odası ile Leica SP2 AOBS konfokal inverted mikroskop </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Shield ve Sang M3 böcek orta (ecdysone ücretsiz) </td><td> Sigma </td><td> S3652-500 ml&#39;lik </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin ve streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu tuz (PBS) </td><td> 12 Bkz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Sigma </td><td> F7524 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P1399-25mg </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehit,% 10, metanol ücretsiz, Ultra Saf </td><td> Polysciences </td><td> 04018-1 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Fare anti-glutamin sentetaz antikor </td><td> Millipore </td><td> MAB302 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan anti-GFP antikorlarının </td><td> Life teknolojileri </td><td> A11122 </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti-antikorlar REPO </td><td> Gelişim Çalışmaları Hibridoma bankası </td><td> 8D12 </td><td></td></tr><tr><td> Sıçan anti-antikorlar ELAV </td><td> Gelişim Çalışmaları Hibridoma bankası </td><td> 7E8A10 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan anti-aktif kaspaz 3 antikorlarının </td><td> Abcam </td><td> ab13847 </td><td></td></tr><tr><td> Normal keçi serumu </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-tavşan Alexa Fluor 488 </td><td> Life teknolojileri </td><td> A11034 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare Alexa Fluor 647 </td><td&gt; Life teknolojileri </td><td> A21236 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-sıçan Alexa Fluor 647 </td><td> Life teknolojileri </td><td> A21247 </td><td></td></tr></tbody></table>

an injury paradigm to investigate central nervous system repair in drosophila

Bir deneysel yöntem meyve sineği Drosophila kullanarak merkezi sinir sistemi (MSS) yaralanma hücresel cevaplarının araştırılması için geliştirilmiştir. Hayvanlarda Anlama onarım ve rejenerasyon biyolojide önemli bir sorudur. Hasarlı insan MSS yeniden ve rejenerasyon teşvik etmek nasıl bir anlayış tıbbi nörobilim ana amaçlarından biridir gelmez. Drosophila güçlü genetik araç MSS yenilenme sorunu çözmek için kullanılabilir. MSS ventral sinir kablosu (VNC, omurgalı omurilik eşdeğerdir) bir lezyon bir tungsten iğne ile elle uygulanır. VNC sonradan zamanla lezyon gelişimini takip amacıyla 24 saat için lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak time-lapse filme alınabilir. Alternatif olarak, daha sonra sabit ve konfokal mikroskopi ile nöron ve glial hücreleri görselleştirmek için immünofloresan kullanılarak boyandı, kültüre edilebilir. Cha, uygun işaretleri kullanmahasarının bir sonucu olarak hücre morfolojisi ve hücre durumda nges görselleştirilebilir. ImageJ ile ve bilerek geliştirilen eklentileri, niceliksel ve istatistiksel analizler zaman ve hücre proliferasyonu ve hücre ölümü ile yaralanmanın etkileri üzerinde yara boyutu değişiklikleri ölçmek için yapılabilir. Bu yöntemler büyük örneklem boyutlarının analizine izin verir. Onlar MSS rejenerasyon ve onarım altında yatan moleküler mekanizmalarının araştırılması Drosophila güçlü genetik ile kombine edilebilir.

Burada Drosophila larva VNC bıçaklama yaralanma gerçekleştirmek ve time-lapse kullanarak ve konfokal mikroskopi immün hasara hücresel yanıtları analiz nasıl gösterir. Time-lapse veriler için, lezyonun G9 aksonal işaretleyici (Şekil 2) taşıyan örneklerin neuropile içinde GFP-negatif alanı olarak görüntülenmiştir. Bıçaklama Kısa bir süre sonra, küçük GFP-negatif alanlar, delikler veya vakuoller gibi, (Şekil 2A) görünmeye başlar. Böyle GFP-negatif alanlarda genellikle (Şekil 2A) bıçaklama sonra 6 ila 8 etrafında saat kadar büyütebilirsiniz. (Şekil 2B) Daha sonra, GFP-negatif alanları küçültmek ve hatta yok olabilir. Bıçaklama sonra 22 saat olarak, yara tarafından işgal edilen alan (Şekil 2A, B) bıçaklama sonra 6-8 saat idi maksimum alanı daha genel olarak daha küçüktür. Benzer şekilde glial süreçlerinde DsRed-negatif bölge başlangıçta da artar, fakat ShrinBıçaklama sonra 22 saat ile ks. İlginçtir, genellikle DsRed pozitif glial süreçleri öncesinde kendi kayboluş (Şekil 2C) için neuropile olarak GFP-negatif delikleri doldurun. Sabit numuneler, ince glial süreçleri ve yaralanma onların yanıt immun kullanma time-lapse görüntüler ile daha iyi çözünürlük ile görüntülenebilir. Bu, tüm glial hücreler (glia orta hat dışında) görselleştirmek için sinekler bir zar gergin raportör (örneğin, UAS-mCD8GFP) ifade indüklemek için repoGAL4 glial sürücüsü kullanarak, örneğin, gerçekleştirilebilir. Bu, aynı zamanda neuropile ilişkili glial hücreleri (Şekil 3A, B) etiketler anti-GS2 gibi diğer glial belirteçler ile kombine edilebilir. Burada gösteriyor ki ventral sinir kablosu ventral bir göçük (Şekil 3A, ok başları) yaralanma sonucu bıçaklama, dorsal taraftan bıçakladı rağmen. Stabbing daha ciddi neuropile ve neuropile ilişkili glial hücreler inci etkileyecek gibi görünüyorbir yüzey ve korteks glial hücreler (Şekil 3B). Onlar hala kortekste örgüt gibi onların örgü korumak ise glial süreçleri, neuropile içinde dağınık görünür. Döküntü parçaları gibi normal hücrelerden farklı olduğu GS2-pozitif hücre kalıntıları, Yaralanma sonuç çok daha küçük ve bir hücre gövdesi ile bağlı değildir. Bu neuropile ilişkili glial hücreler (Şekil 3B) zarar ortaya koymaktadır. Dejenere neuropile ilişkili glial hücreler ayrıca elektron mikroskobu 15 tarafından gözlenmiştir. Anti-cleaved Kaspaz-3 + apoptoz boyama yaralanmaya bıçaklama üzerine apoptosise maruz gösteren neuropile ilişkili glial hücreleri 15 görülmektedir. Neuropile ilişkili glial hücreler aynı zamanda nöronal artıkları 15 ve GS2 fagosite + sinyal da glial işlemler tarafından apoptotik nöronlarının yutulma açığa olabilir gösterilmiştir. Kaspaz-cleaved + apoptotik hücre ayrıca (en azından Elav + nöronların karşılık bazıları, kortekste gözlenen <strong&gt; Şekil 3C). Sabit örnekleri kullanma ve immün ayrıca proliferasyon ve apoptoz etkileri, yaralanma hücresel yanıtları kantitatif analizleri sağlar. Bunun için, biz bilerek sırasıyla otomatik glial hücreler ve apoptotik hücre sayısını saymak için iki ImageJ eklentileri, DeadEasy Kaspaz Larva ve DeadEasy Glia geliştirdi. Onlar larva VNCs çalışmak doğrulanmış ve çok doğru olarak oylandı. Bu kullanılarak, 22 saat (Şekil 4A), 15, bıçaklama zedelenmesi sonucu REPO-pozitif glial hücre sayısında bir artış görülmesi mümkündür. 6 saat post-bıçaklama (Şekil 4B) 15 tarafından anti-cleaved-Kaspaz-3 apoptotik hücre sayısında bir artış vardır. Drosophila MSS hasarına yanıt olarak glial proliferasyon ve apoptoz tür artış omurgalı MSS yaralanma tepki anımsatır. Bu pro çok önemli bir yönütokol VNC diseksiyonları kalitesidir. Bu VNCs bağlı olarak hasar ya da yok edilip diseksiyon sırasında anlatmak için zordur. Bu nazik diseksiyonlar gerçekleştirmek için özellikle dikkat çekmek için önemlidir. Ancak, kötü kalite örnekleri kaçınılmaz üretilen, ve bu, daha sonraki aşamalarda tespit ve atılır esastır edilecektir. Bizim ellerde, VNC dejenerasyonu yaralanma ilişkisiz gibi görünen, ancak bunun yerine kaba diseksiyon nedeniyle. Biz yaralanma yara kritik bir boyutu görülmektedir değil, ve biz bozulmamış tüm yaralandı örnekleri analiz. VNCs kendi bütünlüğünü korumak, VNC yüzey düzgün ve parlak bakmak eğilimi gösterir ve neuropile hiçbir delik (Şekil 5A) görülmektedir. VNCs bozulması VNC ventral ve lateral alanlarda (Şekil 5B) ve pürüzlü yüzeyi 24 saat sonrası diseksiyon tarafından kabul edilebilir. Bıçaklama yaralanma ilgisiz neuropile bozulması da oluşabilir ve bu neuropile saat olarak kabul edilmektedirimmunohistokimyasal numunelerin arka sinyal oles. Dejenerasyon bu belirtileri olan numuneler (Şekil 5C) atılmalıdır. Bizim ellerde, diseksiyon ve sağlam ve bıçaklanmış kontrol yaralanma (yw) sinekler için başarı oranı% 70 civarında her ikisi de. Bu oran deneyler yapan kişinin beceri ile değişir ve genotipi ile olacaktır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig1.jpg" /> Şekil 1. Şematik çizim larva yaralanma evreleme ve bıçaklama. (A) gün 0 anda, sinekler 3 saat süreyle bir üzüm suyu Petri kabındaki yumurtalarını bırakmak için izin verilir. 1. günde, yumurtadan ilk evre larvalar (L1) toplanır ve onlar başka bir 3 gün boyunca tutulur standart maya besini içeren flakon yerleştirilir. 4. günde, larva gıda şişeden alınır ve bıçaklama deneyler için kullanılır. Larva merkezi sinir sistemi (B) Yanal görünümü.Ventral sinir kablosu karın bölgesi sırt tarafında bir iğne ile bıçaklandı. Anterior sola ve sağa posterior. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50306/50306fig2.jpg" /> Şekil 2. VNC lezyonun Time-lapse ilerlemesi. GFP etiketli akson ve DsRed-etiketli glial hücreleri ile canlı VNCs üzerine Konfokal mikroskopi. Genotip:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + (A) lezyon aksonal neuropile üzerindeki floresan eksikliği tarafından kabul edilmektedir. Bıçakladıktan sonra, GFP-negatif delikleri sonra büyüklükleri ve sayıları artan, görünür. Bıçaklama sonra 9 saat yaralanma bıçaklama sonra her zaman noktasından 5 optik kesit Projeksiyonlar. (B) aksonal neuropile lezyonun. Bu görüntüler yaralanma bıçaklama sonra farklı zaman noktalarında gelen tek optik bölümleridir. Her bir numune içinde eşdeğer pozisyonlarda, adet, aynı dilim numarasını belirlemek için,hızlandırılmış veri yığın kanal zaman noktası olarak seçilmiştir. Karşılaştırarak desenleri bıçaklama etkilenmeyen bölgede G9 ve repoGAL4&gt; UASmCD8GFP görselleştirilir, dilimler Z ekseninde eşdeğer pozisyon olarak doğrulandı. Kesikli çizgiler (A, B) yara kenarına göstermektedir. Neuropile üzerindeki yaraların (c) yüksek büyütme. GFP-negatif delik DsRed pozitif glial süreçleri ile dolu, ve daha sonra (ok başları) kayboldu. Yatay görünüm. Anterior kadar. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig3.jpg" /> Şekil 3,. VNC lezyon Hücresel karakterizasyonu. Anti-GFP ve anti-GS2 bir neuropile ilişkili glial hücre işaretleyicisi ile boyanmış Tüm glial hücreler (midline glia hariç) bir membran gergin GFP muhabiri taşıyan VNCs. Genotip:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + (A) &#39;dan VNCs bokböceği vurulmuşsal tarafında, ama bu (ok başları) ventral bir göçük neden olur. Tek optik kesit Sagital görünümü kadar dorsal ve sol ön. (A, B) yaralanma Stabbing korteks ve yüzey glial hücreler daha ciddi neuropile ilişkili glial hücreleri etkiler. Tek optik kesit GS2 pozitif hücresel enkaz Sakatlık sonuçları (B ok başları). (B) Yatay görünüm, anterior kadar. Arrowheads GS2 işaret + hücre döküntüleri. (C) anti-apoptotik işaretleyici yarılan-Kaspaz-3 ve nöronal hasar işaretleyici üzerine kortekste ölen hücrelerin bazı nöronlar olduğunu gösteren anti-Elav arasında Colocalisation. np, neuropile; cx, korteks. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50306/50306fig4.jpg" /> Şekil 4. DeadEasy kullanılarak glial hücreler ve apoptotik hücre otomatik sayma. (A) &#39;DeadEasy Larvaların glia&#39; kullanılarak Örnek REPO pozitif saymakglial hücreler. Left: anti-REPO antikorları ile boyandı VNC ventral yarıları; orta: eklenti tarafından tanımlanan hücreler gösterilerek DeadEasy Larva glia den çıktılar; sağa: birleştirme. Sağdaki sayılar, yaklaşık 30 saniye içinde optik konfokal bölümlerden oluşan bir yığının bütün olarak otomatik olarak sayılır REPO-pozitif hücrelerin sayısını bulunmaktadır. Bıçakladı VNCs içinde glia artar sayısı. &#39;DeadEasy Kaspaz larva&#39; kullanarak (B) Örnek. Left: anti-yarılan-kaspaz 3 antikor ile boyandı 5 optik konfokal bölümden projeksiyonlar; ortasında: eklenti tarafından tanımlanan hücreler gösterilerek çıkış; sağ: birleştirme. Sağdaki sayılar, yaklaşık 30 saniye içinde optik konfokal bölümlerden oluşan bir yığının bütün olarak otomatik olarak sayılır kaspaz-pozitif hücrelerin sayısını bulunmaktadır. Apoptotik hücre sayısının bıçakladım VNC de artar. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50306/50306fig5.jpg" /> Şekil 5,. Degenerat örnekleriiyon. (A) Sağlıklı bir VNC. Yozlaşma belirtisi vardır. (B) Toraks tarafı bıçakladı örnekte yozlaşan (ok başları) &#39;dir. Asterisk lezyon yeri gösterir. (C) torasik neuropile (beyaz ok başı) ve korteks (turuncu ok başı) olmayan bir bıçaklanarak VNC içinde delikler. Hasarlı neuropile ve geniş vakuolizasyon ile örnekler atılmalıdır. İşte VNCs neuropile ilişkili glial belirteç anti-Abanoz ile boyandı. Yatay görünüm, anterior kadar.

Watch this Scientific Journal Video about An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila at JoVE.com

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Santral sinir sistemi rejenerasyon ve onarım araştırmak Drosophila larva ventral sinir kablosu kullanarak bir yaralanma paradigma açıklanmıştır. Kasıtlı geliştirilen yazılım ve genetiği ile kantitatif analiz ile birlikte zaman atlamalı ve sabit örneklerde konfokal mikroskopi lazer tarama, ardından bıçaklama MSS rejenerasyon ve onarım moleküler mekanizmalarının araştırılması için kullanılır.

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

an-injury-paradigm-to-investigate-central-nervous-system-repair

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

13.2K Görüntüleme.  University of Birmingham. Santral sinir sistemi rejenerasyon ve onarım araştırmak Drosophila larva ventral sinir kablosu kullanarak bir yaralanma paradigma açıklanmıştır. Kasıtlı geliştirilen yazılım ve genetiği ile kantitatif analiz ile birlikte zaman atlamalı ve sabit örneklerde konfokal mikroskopi lazer tarama, ardından bıçaklama MSS rejenerasyon ve onarım moleküler mekanizmalarının araştırılması için kullanılır.

Video: An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Nörobilim

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Sinir Sistemi Yeniden Yapılanma, Modülasyon ve Modelleme için Anatomik olarak İlham Almış Üç Boyutlu Mikro-Dokulu Mühendisli Sinir Ağları

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are limited resources directing scientists in the techniques for measuring and analyzing these variables. This protocol describes the methods for measuring RSNA and mean arterial pressure in anesthetized rats. The protocol also includes the approaches for accessing the brain during RSNA recordings for central nervous system (CNS) manipulations. The RSNA recording technique is compatible with pharmacologic, optogenetic, or electrical stimulation of the CNS. The approach is useful when an investigator will measure short-term (min to h) autonomic responses in non-survival experiments to correlate anatomically with CNS nuclei. The approach is not intended to be used to obtain chronic (survival) recordings of RSNA in rats. Discharges in RSNA, averaged rectified RSNA, and mean arterial pressure can be quantified and analyzed further using parametric statistical tests. Methods for obtaining venous access, recording mean arterial pressure telemetrically, and brain fixation for future histological analysis are also described in the article.

Methods for measuring sympathetic and cardiovascular responses to central nervous system (CNS) manipulations are important for advancing neuroscience. This protocol was developed to assist scientists with measuring and quantifying acute changes in renal sympathetic nerve activity (RSNA) in anesthetized rats (non-survival).

Yanıt Merkezi sinir sistemi manipülasyonlar imzalat Sıçanlarda Böbrek sempatik sinir faaliyette akut değişiklikler miktarının

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are ...