Biz Asos ile laboratuar sağlamak için bir bütün olarak ICV bolus cerrahi ile ilgili, hem de Isis İlaç tavsiye sağlamak için Isis Pharmaceuticals Curt Mazer teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, biz bu makaleye için Carey Shaner teşekkür etmek istiyorum. TMM ve SLD NIH Hibe P50AG005681, K08NS074194 ve R01NS078398 tarafından desteklenmektedir.

Aşağıdaki protokol St Louis Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Deney hayvanlarının kullanımı için Sağlık kuralları Ulusal Sağlık Enstitüleri uygun değil. Bu cerrahisine ilk defa ise, biz 14 başlamadan önce bir giriş olarak kemirgen operasyonlarında vallahi makale bakarak öneririz. Asos ozmotik pompa infüzyon ve tek ICV bolus hem boyunca fare MSS teslim edilebilir. Bu nedenle, aşağıda ayrıntılı prosedürü iki parça halinde kadar bozuldu. Her yöntem için artılarını ve eksilerini Tartışma bölümünde değinilecektir. Protokolleri kullanılan koordinatları yetişkin C57BL6 ve B6C3 fareler içindir. Sorumlu sıçan koordinatları Tablo 1&#39;de bulunabilir. Alzet ozmotik POMPA 1. Alzet Ozmotik Pompalar hazırlanması <ol><li> Steril bir drap uzandıE ve doğrudan kısırlık korumak için bir şey dokunmamaya dikkat çekerken dikkatle üzerine aşağıdaki öğeleri bırakın: ozmotik pompa (lar), akış modülatörü (ler), 1 ml steril şırınga (ler), neşter bıçak ve boru bölümleri (boru = 5 pompa 1 adet). 14 gün, 28 gün ve 42 gün (Şekil 2A): fareler için, pompalar için üç seçenek vardır. </li><li> Kapağını çıkarın ve 15-20 ml serum fizyolojik ile steril 50 ml konik tüpler doldurun. Kadar 6 monte pompa konik tüp başına eklenebilir. </li><li> % 100 etanol ile bir p60 Petri kabı doldurun. Etanol kateter uygun sayıda ekleyin. Fareler için, kateter uzunluğu 2.5 mm&#39;dir. </li><li> Gerekli olduğu kadar çok 1.5 ml lik Eppendorf tüpleri içine her ASO filtre. Tüp doldurmak için steril% 0.9 tuzlu su ile dolu bir Eppendorf tüpü içerir. </li><li> Her şey hazırlandıktan sonra, steril eldiven koymak. Steril olmayan bir şey dokunmamaya dikkat edin. Gerekirse eldiven değiştirin. </li><li> Her ASO kullanılmak üzere, bir 1 ml şırınga dolguve üst deliğe iğne yerleştirerek ve yavaş yavaş kadar aşırı sızıntı doldurarak loadpumps. Pompaların doldurulana kadar devam edin. </li><li> Akış modulatöru kapağını çıkarın ve pompa takın. Bir 3-5 mm boşluk bırakarak, hemen hemen tüm yol akışını-modülatör itin. </li><li> Neşter bıçak kullanarak, 5 eşit parça halinde boru her parça kesti. Hortumun bir parça alır, bir 1 ml şırınga kullanarak steril tuzlu su ile doldurun ve Hortumun bir ucunu akış modülatör üst yerleştirin. Daha sonra etanolden bir kanül almak ve borunun diğer ucuna bağlanmalıdır. Pompa şimdi tam monte edilir. </li><li> Astar için tuzlu su ile steril bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içine tam olarak monte edilmiş pompa yerleştirin. Astar ilaç dağıtım başlatmak için sıvı içinize yanı sıra uygun sıcaklığa gelmesini pompalar için izin verir. Astar süresi: 14 gün pompalar: 4-6 saat, 28 gün pompalar: 40 saat, 42 gün pompalar: 60 saat. Pompa montajı bittiğinde, bir temiz konik tüpler ve yer kap37 ° cerrahi kadar C su banyosu. </li></ol> 2. Ön cerrahi Prosedürü <ol><li> Alan sterilize ve steril bir alan oluşturmak için masa üstü ve stereotaksi üzerine steril örtüler bırakmaya% 70 etanol ile her şeyi silin. Bu, tüm ameliyat boyunca steril alanın dikkatli olmak önemlidir. Aşağıdaki açın: Boncuk Sterilizatör, ısıtma pedi, Işık, Dijital Okuma ve Oksijen / İsofluranın Sistemi (Şekil 1). </li><li> Forseps 1 çift, 1 kavisli hemostat, küçük makas 1 çift, küçük kavisli künt makas 1 çift, 1 sıçan kemik kesici: Tek bir ameliyat veya bir bütün toplu ameliyatları rutin gibi birini yaparak, aşağıdaki öğeleri gerekecektir , 1 düz hemostat, 5-0 naylon sütür,% 70 etanol ile 1 konik tüpler,% 95 etanol ile 1 konik tüp, iyot ile 1 konik tüp, hidrojen peroksit ile 1 konik tüp, steril pamuklu paket, süper 1 şişe tutkal, 1 tüp antibiyotik merhem, göz 1 tüpyağ ve 1 elektrikli tıraş makinesi. </li><li> 15 saniye için boncuk sterilizatör içine makas, forseps, ve kavisli hemostatı iki çift ipuçları yerleştirin. Çıkarın ve% 70 etanol içinde. Birden fazla ameliyat yaparken, hayvanlar arasında araçların ipuçları yeniden sterilize. </li><li> % 4 izofluran ve O 2-0,4 L / dk ve odasına doğrudan gaz akışını açın. Biz anestezi uygun miktarda teslim olmasını sağlamak için yılda en az bir kalibre bizim izofluran / oksijen sistemi var. Yeri odasında fare ve nefes kadar beklemek önemli ölçüde yavaşlar. Fareyi çıkarın ve fare tamamen bilinçsiz olmasını sağlamak için bir ayak tutam gerçekleştirin. </li><li> Kadar göz arasında &#39;de omuz üstünden saç tıraş. Fare uyanmak başlarsa fare bir ayak tutam ile teyit, yine tamamen bilinçsiz kadar, odasına geri fare yerleştirin. Stereotaksi üzerine anestezi fare yerleştirin ve burun üzerinde burun konisi itin.Dişleri ve kemikleri kırılgan gibi nazik olun. </li><li> Fare anestezi tutmak için stereotaksi için gaz akışını yönlendirmek. Bu zaman zaman fare ameliyat boyunca bir ayak tutam tamamen bilinçsiz olduğundan emin olmak için kontrol etmek önemlidir. Kulak çubukları ile baş sabitleyin. Biz lateral ventrikül hedef olsa da, kulak çubukları tesviye tercih, mükemmel düzeyde kafatası nedeniyle ventrikül büyük olması gerekli değildir. </li><li> Bakım için% 2.0 için izofluran seviyesini aşağı çevirin. Her bir göz damlasını, göz merhemi. Videoda görüldüğü gibi boyun ve baş sadece temel maruz böylece, fare üzerinde bir steril örtü yatıyordu. Daha sonra traş alanının merkezinde başlayan ve çubuk çubuk iyot batırılmış bir pamuk takip,% 95 etanol batırılmış bir pamuk ile ilk dışa doğru hareket eden bir dairesel hareketlerle baş ve boyun üst silerek cerrahi alan dezenfekte edin. </li><li> Biz sağlayan bir rektal prob geri besleme sıcaklık kontrollü ısıtma sistemi kullanmanızı öneririzfare sıcaklığı istikrarlı bir 37 ° C &#39;de devam Fare sıcaklığı ameliyat sırasında azalırsa, ameliyat sonrası iyileşme daha uzun sürebilir ve ortaya çıkan hipotermi protein Tau 15 ilişkili mikrotübül bir hiperfosforilizas dahil olmak üzere, anormal protein aktivite yol açabilir. Isıtma sistemi kurduktan sonra, artık ameliyat için hazırız. </li></ol> 3. Alzet Ozmotik Pompa implantasyonu <ol><li> Ameliyat başlamadan önce, steril eldiven yeni bir çift koymak. Daha sonra, forseps ve makas küçük bir çift kullanarak, gözler arasında en fazla hayvanın kafatası üzerinde boyun tabanından deride bir kesi yapmak </li><li> Yukarı bakacak şekilde eğrisi ile künt makas alın ve sol bacak doğru boyun sırt dibinde cilt altında kaydırın. Hiçbir direniş olmalıdır. Varsa, makas kaldırıp tekrar deneyin. Bu, ozmotik pompa için deri altı cep oluşturur. </li><li> Wipe bir pamuklu çubukla takip steril pamuklu çubukla temiz kafatası, bregma geliştirmek için hidrojen peroksit batırılmış. </li><li> Pompaların sterilite korumak için pompaları içeren 50 ml konik tüpler silin. Dikkatlice pompa konik tüp kenarlarına temas edip etmediğini özen göstererek, kavisli hemostat kullanarak konik tüp bir pompa almak. Forseps ile pompanın tabanı tutun ve kavisli hemostatla şekilde geri kalanında akış modülatör itin. </li><li> Akış modülatör ve boru kavisli hemostat ile bir araya pompa tutun. Boyun dibinde deri altına pompa takın ve şu ana kadar bu direniş olmadan gidecek gibi sol bacak doğru geri itin. Kateter dokunmatik bir şey izin için dikkatli olun. </li><li> Kavisli hemostatla, üst kaide karşılayan oluk de kanül kapmak. Yerine kanül sürücü hareket ettirin ve yerine sabitleyin. </li><li> Kanül baz süper yapıştırıcı bir damla yerleştirin. Irinh sürücü ve boru düz geri işaret böylece pozisyona kanül üst. </li><li> Bregma için kateter ucu dokunun ve Dijital ekranda koordinatları sıfır. Kateter kaldırın ve sağ-arka 0.5 mm (Şekil 2B) yanal olarak 1,1 mm hareket etmektedir. Kavisli hemostatla yolumdan cilt tutun. </li><li> Plastik kanül tabanı güvenli bir kafatasının üst karşı basılana kadar kafatası ile ince metal kateter sürün. Metal kateter göreli ince kafatası nedeniyle farelerde kafatası doğrudan sürülebilir. Sıçan kullanıyorsanız, kateter indirmeden önce kafatasında bir delik açın. </li><li> Uzak kafatası Üzerinde yapışkan olan herhangi bir cilt çekin. Yerine kanül / kateter tutan kanül sürücü ile, tam kuru tutkal için 1-2 dakika bekleyin. </li><li> Kateter yerleştirme değerlendirmek için, pratik zaman, boru (Şekil 2C) ile% 2.5 FastGreen Boya 20-40 ul enjekte. 2-3 dk, Perfüzyonun bekleyin1X PBS 0.03% heparin ile e fare, ve beyin çıkarın. Kateter yerinde koronal kesin. Kateter ventriküle yerleştirildi durumunda, boya fare ventriküler sistemine (Şekil 2B) boyunca perfüze edilir. </li><li> Sürücü yükselterek kavisli hemostatla kateter yerinde tutun. Yavaşça kanül düzgün kafatasına güvenli olduğundan emin olmak için hemostat bırakın. </li><li> Bir pamuklu çubukla, kanül üst bastırın. Kanül üst ve taban arasındaki koru içine sıçan kemik kesme makineleri takın. Hala pamuklu çubukla tuşuna basılı iken kanül üst kapalı klibi. Kesme seviyesi denemek ve devam böylece kafatası kanül ayırmak için değil. Kanül Neşesiz geliyor yoksa, hızlı bir şekilde yeniden yapıştırıcı ve ek 2 dakika süreyle bir pamuklu çubukla basınç uygulayın. </li><li> Sağ kanül üzerinde ekstra dikkat, 5-0 dikiş ipliği, düzenli hemostat ve forseps, tam açılış boyunca dikiş kullanma. Bir runnin kullanınkafatası üzerinde büyük bir kesi nedeniyle g yatay yatak sütür (bkz. Şekil 5). </li><li> Baş ve boyun antibiyotik merhem bir dab uygulayın. Sökün kulak çubukları ve burun konisi gevşetin. Kurtarma için bir ısınma pad üzerinde stereotaksi ve yerden fareyi çıkarın. Tipik olarak 10-30 dakika arasında değişen, iyileşme süresi boyunca yakından fareler izleyin. Fare dolaşıyor ve kendisini tımar başlayana kadar her 2-3 dakikada bir kontrol edin. </li></ol> 4. Ameliyat sonrası Bakım <ol><li> Ilk hafta için ameliyat sonrası günlük fareler izleyin. </li><li> Bir fare ağrı veya sıkıntı gibi görünüyor, biz ağrı gidermek için en fazla 5 gün boyunca her 24 saat bir kez Carprofen bir 5 mg / kg deri altı enjeksiyonu ile fare sağlayan tavsiye ederiz. </li><li> Bir enfeksiyon olması görünüyorsa, cömertçe günlük bölgeye antibiyotik merhem uygulamak ve yara doğru iyileşir sağlamak için bir Katılan Veteriner danışın. </li><li> R5-0 naylon dikiş dikiş ipliğinin gelen tahrişi önlemek için ameliyat sonrası 7-10 gün kaydının silinmesi. </li></ol> 5. Alzet Ozmotik Pompa değiştirme veya kaldırma Pompa aktif ASO beslerken yapıldıktan sonra, ya değişti ya da tamamen kaldırılabilir. <ol><li> Aşağıdaki değişikliklerle yukarıda aynı ön-cerrahi prosedürü takip edin: 1) Eğer kavisli makas, eğri hemostat, sıçan kemik kesiciler, ne de Dijital Ekran gerekmez, ve fare yerine başkanı hazırlıyor 2), tıraş ve Pompa ve boru kavşağında fare arka dezenfekte. </li><li> Forseps ve makas kullanarak, dik pompa / boru kavşak, fare arkasında bir 1.5 cm kesi olun. Dikkatle önemli ölçüde çekerek / bu kateter kavanoz olabilir boru üzerinde koymadan kesi dışarı pompa çekin. </li><li> Pompayı kaldırmak için, hakkında 0.5 cm akışını modülatörü üzerindeki boru klibi ve boru t yapıştırıcı temaso mühür onu kapattı. Kuru tutkal için 1-2 dakika bekleyin. Boru geri kesi ve dikiş kapalı içine yerleştirin. Sütüre cilt ve yer ısıtılmış bir kurtarma pad üzerinde fareyi üzerine dab antibiyotik merhem. </li><li> Pompa değiştirmek için, taze% 95 etanol ile dolu bir 10 cm tabak birlikte pompa hazır hale gelmiştir. Kateterler yeni pompa ile gerekli değildir. </li><li> Forseps ile yeni bir pompa tut. Etanol içine parmaklarınızı batırın, pompa tutun, ve akış-modülatör atın. Daha sonra, dikkatlice ve yavaşça tüp ve kanül bağlı akış modülatöründen eski pompa çekin. En kısa sürede onu olduğu gibi, yavaş yavaş akış modülatörü Farenin dış ile hiç temas etmez sağlamak, üzerinde yeni pompa kaydırın. </li><li> Deri altı paket ve dikiş cilt geri kesiden yeni pompa yeniden takın. Kurtarma pad üzerinde yara ve yerde fare dab antibiyotik merhem. </li><li> Sadece pompa implantasyonu olduğu gibi, p kontrol etmek için ameliyattan sonra günlük fareler izlemekain / rahatsızlık ve enfeksiyonlar. Gerekli gördüğü gibi Carprofen ve antibiyotik ile tedavi. </li></ol> ICV BOLUS 6. Ön cerrahi Prosedürü <ol><li> , 2) ile sterilize edilmiş su ve yük ile 10 ul Hamilton şırınga ve iğne temiz 1) kavisli makas, eğri hemostat ya da fare kemik kesiciler gerekmez: aşağıdaki değişikliklerle birlikte yukarıda Bölüm 2&#39;de olduğu gibi aynı önceden cerrahi prosedürü izleyin ASO ve 3) kanül sürücü bulunduğu stereotaksik aparat için şırınga ve iğne takın. </li></ol> 7. ASO Bolus Enjeksiyon <ol><li> Forseps ve makas küçük bir çift kullanarak, gözler arasında en fazla boyun tabanından bir kesi yapmak. </li><li> Çubukla bregma geliştirmek için hidrojen peroksit batırılmış bir pamuk takip steril pamuklu çubuk, temiz kafatası silin. </li><li> Yerine şırınga / iğne taşımak ve güvenli. İğnenin kesik kısmı arka baktığından emin olun. Altiğne Bregma dokunduğu kadar. Koordinatları tüm Zero. Doğru 1.0 mm ve 0.3 mm anterior (Şekil 3A) yanal olarak iğne hareket ettirin. </li><li> Iğne deliği kafatasının üst ile aynı hizada sadece kadar yavaşça kafatası yoluyla iğne sürücü. Yine, bu fare kafatası inceliği nedeniyle yapılabilir. Z-koordinat sıfır, 1 mm / saniye (Şekil 3B) bir oranda -3.0 mm iğne düşük. Iğnenin mühür beyin için 2-3 dakika bekleyin. </li><li> Saniyede 1 ul&#39;lik bir oranda ASO tam 10 ul sağlar. 2-3 dakika bekleyin. Bu oran farklı ilaçlar arasında farklılık olsa Biz, ventrikül içine Asos için 1 ul infüzyon hızı kullanın. Çalışma sırasında,% 2.5 FastGreen Boya 10-20 ul sunarak iğne doğru yerleştirilmesi için kontrol edin. Boya infüzyon kısa bir süre sonra 1X PBS 0.03% heparin ile fare serpmek ve boya ventriküler sistemi (Şekil 3C) olduğunu doğrulamak için beynin koronal bölümleri yapmak. </li> &lt;li&gt; iğne tabanında kafatası karşı bir pamuklu çubuk tutun. Saniyede 1 mm bir oranda iğne kaldırın. En kısa sürede iğne kafatası dışında olduğu gibi, iğne deliğinin üzerine pamuklu rulo ve dışarı sızmasını herhangi ASO önlemek için 1 dakika tutun. </li><li> , Kapalı deri dikin antibiyotik merhem uygulamak, ve ısıtmalı kurtarma pad üzerinde yer fare. ASO konsantrasyonuna bağlı olarak, tamamen kurtarmak için birkaç saat için 20 dakika sürebilir. </li><li> Sadece pompa implantasyonu gibi, ağrı / rahatsızlık ve enfeksiyon kontrol etmek için ameliyat sonrası günlük fareler izlemek. Gerekli gördüğü gibi Carprofen ve antibiyotik ile tedavi. </li></ol>

<ol>
	<li>Crooke, S. T., Bennett, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+antisense+oligonucleotide+therapeutics.">Progress in antisense oligonucleotide therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 107-129 (1996).</li><li>Sazani, P., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+antisense+oligonucleotides+as+modulators+of+alternative+splicing.">Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease.">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991-1995 (2002).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li><li>Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Targeted+Therapies+for+the+Central+Nervous+System.">Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System.</a> Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).</li><li>Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Reduction+of+Target+RNAs+by+Small+Interfering+RNA+and+RNase+H-dependent+Antisense+Agents.">Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).</li><li>Smith, R. A., Miller, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotide+therapy+for+neurodegenerative+disease.">Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).</li><li>Rosen, D. R., Siddique, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cu/Zn+superoxide+disumutase+gene+are+associated+with+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature. 362, 6415-62 (1993).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+from+familial+and+sporadic+ALS+patients+are+toxic+to+motor+neurons.">Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons.</a> Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).</li><li>Furukawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+roles+of+wild-type+Cu,Zn-superoxide+dismutase+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).</li><li>Hua, Y., Sahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Passini, M. A., Bu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotide+Delivered+to+the+Mouse+CNS+Ameliorate+Symptoms+of+Severe+Spinal+Muscular+Atrophy.">Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy.</a> Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).</li><li>Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Therapeutic+Reversal+of+Huntington's+Disease+by+Transient+Repression+of+Huntingtin+Synthesis.">Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis.</a> Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).</li><li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon.">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).</li><li>Planel, E., Richter, K. E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+Leads+to+Tau+Hyperphosphorylation+through+Inhibition+of+Phosphatase+Activity+by+Hypothermia.">Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).</li><li>Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotide+therapeutics+for+inherited+neurodegenerative+diseases.">Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).</li></ol>

Yazarlar, Isis Pharmaceuticals kendi anti-his oligonükleotidler alır.

Video gösterildiği gibi MSS küresel ilaç teslim yeteneği hem öğrenmek ve kullanımı kolay son derece güçlü bir tekniktir. Uygulama ile, bir tek pompa implantasyonu veya ICV bolus aynı zamanda tedavi edilmesi farelerin büyük kohort için izin, 10 dakika içinde tamamlanabilir. Fare davranış için daha fazla sayıda önemli farklılıklar görmek yardımcı olmak için önemli olduğu gibi bu, bir davranış okuma ile çalışmalar için özellikle yararlıdır. Pompalar ve bolus enjeksiyon yoluyla Asos teslim bizim deneyimlerine dayanarak, biz her yöntem için bazı artıları ve eksileri gözlemledik. Bu laboratuarımızda görüşleri ve tüm fare ve sıçan modelleri için doğru olmayabilir unutulmamalıdır. Bu pompa kullanılmasının bir avantajı, ASO zaman çok daha uzun bir süre boyunca dağıtıldığı için, ASO yüksek bir miktar vermek için yeteneğidir bulabilirsiniz. Bu genellikle aktif sonra uzun süreli demonte veya yapıştırma eşittirASO infüzyon, ama bu her zaman böyle olmayabilir. Pompaları da ASO teslimat kesin bir zaman dilimi (14 gün, 28 gün, 42 gün) için izin verir ve pompalar da uzun süre aktif ASO enfüzyon izin vermek için bir kez değiştirilebilir. Bununla birlikte, birden fazla pompa değişen düzgün bir emici-akışkan pompa önlemek pompasının çevresindeki lifli cepleri oluşumu nedeniyle değişkenlik artırdığını fark ettik. Pompa bir dezavantajı, bir farenin hem de diğerleri pompa tolere kalmamasıdır. Çalıştığınız transgenik hat daha kırılgan ise, bir pompa çok hantal olabilir. Pompalar başka cerrahi ve katma anestezi fareler tabi, son infüzyon sonra kaldırılması gerekir. Davranışı işi, bu pompa kaldırmak ve pompanın varlığı, farelerin bazı davranışlarını etkiler çünkü geri en az 1-2 hafta içinde izin vermek için özellikle önemlidir. ICV bolus enjeksiyonları ile, bir avantajı maliyetidir. Bir varayarlıyoruz yatırım şırınga ve iğneler satın almak, ama satın almak için pompa / boru / kateter hiç olmadığından zaman içinde, bolus enjeksiyonları daha maliyet-etkilidir. Genel olarak, kanül ve pompalar eksikliği nedeniyle ICV bolus enjeksiyonları ile yukarı tutmak daha az bulunmaktadır. Ayrıca ICV bolus genç ve / veya daha kırılgan farelere Asos sunmak için kullanılabileceğini bulmak. ICV bolus bir dezavantajı, tek bir enjeksiyon olmasıdır. Kadar genel ASO bu rota üzerinden teslim edilebilir ve kullanılan ASO etki süresi kısa ise, demonte / yapıştırma etkileri de kısa ömürlü olacak değil. Ozmotik pompalar gibi ICV hem de büyük hap Ásos teslim etmek yeteneğine sahip olduğunu olabilir demonte proteinler ya da bütün kemirgen MSS genlerin yapıştırma, çoklu nörolojik ilgili alanlarda geniş uygulama alanı vardır bir teknik değiştirebilir. En iyi s için uygundur uygulama hangi yol emin değilseniz Biz teslimat her iki yöntem pilot öneririzpecific çalışma.

Bazı ilaçlar doğrudan Merkezi Sinir Sistemi (MSS) teslim gerektiren, kan beyin bariyeri (KBB) çapraz edemiyoruz. BBB aşmak için, ilaç tarif edilen yöntemler kullanılarak, beyin içine doğrudan teslim edilebilir. Laboratuar ve anti-his oligonükleotidler ile ilgili kağıt detaylı tarifnamede odaklanma (Ásos) gibi küçük moleküller, antikorlar, gene terapi vektörleri, vb. Gibi diğer ilaçlar, aynı zamanda aynı yaklaşımla iletilebilirken. Bazı proteinlerin nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde bir rol oynamaktadır. Bu proteinler genellikle nihai nöronal ölüm ve daha sonraki nörolojik hastalık 3-4 yol, agrega zehirli türler oluşturur ve birikir. Bu hastalıkların ilerlemesini yavaşlatmak ya da durdurmak için bir çaba, bir tedavi seçeneği doğrudan hedef ve neden olan protein azaltmak için olabilir. Bununla birlikte, bu proteinler çoğu zaman zor hale e, merkezi sinir sistemi boyunca her yerde her zaman bulunur<html> v erimli küresel ölçekte onları hedef. Tüm MSS boyunca genlerin hedef için, biz BBB atlamak için lateral ventrikül ile fare beyin omurilik sıvısı (BOS) içine Asos yönetmek. Bu özel yöntem Asos yaygın dağıtımı sağlayan, tüm beyin ve omurilik banyoları fare ventriküler sistemi yararlanır. Biz demonte yol açan mRNA aşağılamak veya B) alternatif yapıştırma 1 kaydırmak için ya A) işe RNaz-H, ASO kimyasal değişiklikler bağlı olarak, doğrudan hedef mRNA dizisi bağlamak 18-20 mer RNA benzeri moleküllerdir Asos kullanın ve , 2,16,17. Bu, birden fazla shRNA moleküller de dahil olmak üzere, in vivo olarak belirli bir protein devrilmesi için var olduğunu belirtmek gerekir. Bu moleküllerin bu makalenin odak değildir yana, makaleler yorumlayan okuyucu yönlendiren Daha çok detay demonte etki mekanizmaları ve her 5-6 avantajları / dezavantajları. önceki çalışmada jove_content &quot;&gt;, biz Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) 7 (Şekil 4) bir transgenik fare modelinde protein süperoksit dismutaz 1 (SOD1) hedef Asos kullandık. SOD1 mutasyonlar gerçekleşen tüm ALS yaklaşık% 2 durumlarda 8, son zamanlarda SOD1 başlangıcı belirgin 7 artış sonra ALS transgenik fare, hayatta kalma toplam SOD1 seviyeleri azaltarak de 9-10. sporadik ALS önemli bir rol oynayabilir öne sürülmüştür rağmen. Bu önemli verileri ilk idi MSS bir ASO tedavi nörolojik bir hastalık modeli üzerinde derin olumlu bir etkisi olabileceğini göstermek için. O zamandan beri, insan SOD1 hedeflenmektedir Asos minimal yan etkileri (Clnicaltrails.gov NCT01041222) ile girmiş ve başarılı bir şekilde, insan klinik Faz tamamlamış , gibi Nöroloji 2012 64 inci yıllık Amerikan Akademisi&#39;nde sundu. II çalışmalarda Faz ileri Asos taşımak için Planları şu anda devam etmektedir. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; SOD1 nörolojik bir hastalığı tedavi etmek için Asos kullanarak ilk gösteri oldu hedeflerken, diğer bazı çalışmalarda bu yana farklı hastalıklar ve kendi protein hedeflerine bakarak yapılmıştır. 2010 ve 2011 yılında, o Asos motor nöron 2 (SMN2) protein hayatta kalma kayması ekleme spinal kas atrofi (SMA) transgenik fare modellerinde kullanılan ve hastalık fenotipleri 11,12 önemli bir iyileşme ile sonuçlanmıştır. Bu yapıştırma Asos Faz şimdi SMA çocukların (Clinicaltrails.gov NCT01494701) I klinik çalışmalar vardır. Ayrıca, son zamanlarda huntingtin protein düzeyleri başlangıç ​​13 döndü sonra bile, huntingtin gen karşı hedef Asos geçici yönetimi önemli ölçüde Huntington fare modeli kurtarmak için mümkün olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmaların tümünde, Asos ile toplam gen düzeyleri azaltmak veya gen ekleme değiştirme lateral ventrikül teslim edilditüm merkezi sinir sistemi. Ozmotik pompalar ve tek bir bolus enjeksiyon, her ikisi de CSF Ásos sunmak için de kullanılabilir. Intraserebroventriküler (ICV) bolus hızlı, tek seferlik enjeksiyon ise Pompalar, yavaş, sürekli teslimat için izin verir. Biz tek bir transgenik doğrultusunda pompa ve bolus arasındaki doğrudan bir karşılaştırma rapor değil olsa Biz, başarı ile bu yöntemlerin her ikisi de kullandık. MSS Asos kullanan toplam protein düzeyleri ve / veya birkaç proteinlerin değişimi yapıştırma azaltmak için güçlü bir yoldur. Biz nörolojik hastalıkları için bir tedavi olarak sadece Asos kullanırken, diğer alanlar da bu tekniği yararlanabilir farkındayız. Ilgi protein sürece MSS ifade ve nihai hedefi göstermiştir teknikleri Asos kullanılarak gen ifadesinde MSS çapında değişiklikler, elde etmektir gibi çok yararlı olabilir.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 14 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 28 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 42 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5 mm Catheters</td>
 <td>PlasticsOne</td>
 <td>3280PM/SPC</td>
 <td>Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vinyl Catheter Tubing</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>7760</td>
 <td>ID: 0.027", OD: 0.045"</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>2F7124</td>
 <td>NOT to be used in pumps or tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Injection, USP</td>
 <td>Hospira</td>
 <td>NDC 0409-4888-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p60 Petri Dish (Sterilized)</td>
 <td>TRP</td>
 <td>93060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Surgical Blades (Sterile)</td>
 <td>Butler Schein</td>
 <td>#007319</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Latex Surgical Gloves (Sterile)</td>
 <td>Micro-Touch</td>
 <td></td>
 <td>CatNo will depend on size of the gloves needed</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Towel Drape</td>
 <td>Dynarex</td>
 <td>4410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>.2um Syringe Filters</td>
 <td>PALL</td>
 <td>4192</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe (Sterile)</td>
 <td>BD</td>
 <td>309625</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Conical Tubes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PUMP &amp; BOLUS SURGERY PROTOCOLS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>13009-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Sharp Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14060-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Blunt Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14029-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bone Cutter</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>16104-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Straight Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12002-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l gas-tight with removable needles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needles</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7758-04</td>
 <td>26 gauge, Point Style: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-0 Nylon Suture Thread</td>
 <td>Covidient</td>
 <td>SN-871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Pads</td>
 <td>Select</td>
 <td>#521</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cotton Swabs (sterile)</td>
 <td>Puritan</td>
 <td>REF 806-WC</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Loctite</td>
 <td></td>
 <td>Longneck Bottles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAUTION: FastGreen Dye</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F7252-5G</td>
 <td>Wear Eyeshields and Gloves when handling this product</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic Cream</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eye Ointment</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electric Shaver</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Provadone Iodine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3% Hydogen Peroxide</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warming Pad</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead Sterilizer</td>
 <td>SouthPointe Surgical</td>
 <td>GRM5-1450</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 940</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nose Cone</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 923-B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ear Bars</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 921</td>
 <td>This model is optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cannula Driver</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1966</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe Holder</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1972</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature Control System</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model TCAT-2LV</td>
 <td>Optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oxygen/Isoflurane System</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system

, Kan-beyin bariyerinden geçebilme bir yetersizlik nedeniyle, bazı ilaçların doğrudan merkezi sinir sistemi (MSS) teslim edilmesi gerekir. Burada video gösterilen teknikler de merkezi sinir sistemine diğer ilaçların bir bolluk sunmak için kullanılabilir ama bizim laboratuar, antisens oligonükleotidler (Asos) odaklanır. Antisens oligonükleotidler (Asos) demonte dizisi özel hedefler 1 hem de belirli genlerin 2 vardiya izoformu oranları için yeteneği var. Farenin merkezi sinir sistemi yaygın gen demonte veya yapıştırma elde etmek için, biz Ásos video gösteren her ikisi de yönetim iki ayrı yolları kullanarak beyin içine gönderilmesi mümkün olmaktadır. Birinci kullanır cerrahi lateral ventrikül içine implante bir kateter bağlı ozmotik pompalar, Alzet. Bu Ásos sürekli bir zaman süresi için, CNS nüfuz etmesine izin verir. İkinci bir yüksek tek bir bolus enjeksiyonu içerirsağ lateral ventrikül içine ASO gh konsantrasyonu. Çalışmanın gereksinimlerine bağlı olarak, tek bir yöntem diğer tercih edilebilir olsa da her iki yöntem de, tüm beyin ve omurilik ASO sunmak için, fare serebral ventriküler sistemi kullanır.

Pompa infüzyon veya ICV bolus enjeksiyon sonrası belirli bir süre sonra (biz rutin olarak dört hafta kullanın), bu Asos etkisini test etmek önemlidir. Her iki ya da Western blot veya ELISA ile hem de protein düzeyi olarak kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılarak mRNA düzeyi (yayınlanmış örneğin, Şekil 4 de, hedef geni seviyelerini / izoformları ölçmek için beynin farklı bölgelerinde ve omurilik alarak tavsiye .) Bu farklı MSS bölge genelinde ASO etkinliğini belirlemenize yardımcı olur. Hedeflenen proteinin yarı ömrü uzunsa, biz en fazla protein demonte veya yapıştırma değerlendirmek amacıyla ASO infüzyon sonra uzun bekleme tavsiye ederiz. Bu oligo dağıtım test etmek de önemlidir. Daha yüksek ASO konsantrasyonu genellikle yakın ventriküler sistemi 16 alanları görülür rağmen pompa infüzyon, aynı taraf ve karşı her iki yarımkürede ile dağıtım neden. ICV bolus enjeksiyonları daha Unifo verimMSS 16 ile oligo rm dağılımı, etkileri uzun ömürlü olmayabilir ama. Biz Southwell ve arkadaşları için okuyucu doğrudan. Bolus oligo dağıtım 16 karşı pompa doğrudan bir karşılaştırma görmek. Ayrıca her ASO in vivo olarak biraz farklı davranacaktır çünkü birden fazla doz yanı sıra Asos etki süresi test tavsiye. Asos genellikle birkaç ay sonra ASO teslim süren hedef devirme ya da yapıştırma ile, eylem oldukça uzun bir süre var. Ayrıca, bazı Asos diğerlerinden daha iyi çalışır ve bazı gen hedefleri diğerlerine göre demonte daha kolay olacaktır. Bu nedenle, tarama kurşun aday belirlemek için Asos, biz bir n in vivo olarak en az 3-5 Asos test tavsiye = bir ilk geçiş olarak ASO başına 4-6 yetişkin fareler. Asos dışında bir ilaç kullanıyorsanız, aynı zamanda pilota önemli olacaktır ideal ilaç konsantrasyonu, etki ilaç süresi ve CNS ilaç, belirli bir bileşik için daha önce dağılımı. <img alt="Tablo 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> Tablo 1. Cerrahi Koordinat. Koordine eden intraserebroventriküler (ICV) bolus performans hem de osmotik pompalar implante zaman fareler ve sıçanlar hem de sağ lateral ventrikül vurmak için kullanılır. Her iki koordinatları, pompalar ve ICV bolus için, sağ lateral ventrikül hedef. Bu biz en çok deneyime sahip ve ASO mükemmel dağılımını sağlamak bildiklerini, çünkü iki farklı ayarlar kullanabilirsiniz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> Şekil 1. Stereotaksik Kurulum. Alzet pompa ve Bolus enjeksiyon ameliyatları için (A) gerekli stereotaksik donanım. I) Cam Boncuk sterilizer. ii) Dijital Okuma. iii) hareketli kollar ile Stereotaksik taban. iv) Sıcaklık Kontrollü Isıtma Pedi. v) Oksijen Sistemi / İsofluranın. vi) İsofluranın Odası. (B) burun konisi ve kulak çubukları kadar kapatın. (C) İki ekleri gerekli. Sol: Şırınga / ICV bolus enjeksiyon için iğne tutucu. Sağ: Ozmotik pompa implantasyonu için Kanül Sürücüsü. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> Şekil 2. Ozmotik Pompa İmplantasyonu Alzet. Fareler için (A) Alzet ozmotik pompa seçenekleri. . 14 günlük pompalar (0.25 ul / saat), 28 günlük pompalar (0.25 ul / saat), 42 gün pompalar (0.15 ml / saat) (B), ikinci pompa, bregmaya implantasyon için Koordinat: Arka -0.5 mm, lateral -1.1 mm ( Sağ) ve ventral -2.5 mm (kateterin uzunluğu). (C) yoluyla sürüş sonra kateterkafatası ve yapıştırma kanül, boya lateral ventrikül içinde kateterin doğru yerleştirilmesi değerlendirmek için kateter aracılığıyla temizlendi. boya (C) olarak uygulanan hemen sonra (D) Perfüze beyin. Kateter başarıyla ventrikül yerleştirilirse, boya fare ventriküler sistem boyunca dağıtılacak. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> Şekil 3,. Intraserebroventriküler Bolus Enjeksiyon. (A) bregma gelen bolus enjeksiyon için Koordinat: +0.3 mm Ön, Yanal -1.0 mm (Sağ) ve ventral -3.0 mm (B) ventral kafatası -3.0 mm ile iğne sürüş sonra, boya şırınga ile itilir. kısa bir süre (B) &#39;de uygulanan boya sonra ortamdaki ventrikül. (C) Perfüze beyindeki iğne doğru yerleştirilmesi değerlendirmek. Iğne başarıyla ventrikül, yerleştirilirseboya fare ventriküler sistem boyunca dağıtılacak. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> Şekil 4. Duyarlılık karşıtı oligonükleotidler (Smith ve ark. 7 şirketinden alınmış, Şekil) ve in vivo sıçan SOD1 azaltır. (AD) Antisens SOD1 oligonükleotidler r146192 SOD veya SOD 100 mikrogram / ​​gün normal farelerin sağ lateral ventrikül içine 28 gün boyunca infüze edildi şifreli. Beyin ve omurilikten (A) Endojen SOD1 mRNA düzeyleri Mah-PCR ile ölçülen. ( B) SOD1 ve a-tubulin protein düzeyleri ASO infüzyonu takiben. tübülin ve SOD1 için (C ve D) Protein seviyeleri beyin infüzyonla farklı bölgeler için sayılabilir. presenilin 1 ya da GSK-3 ve beta karşı (E) Ásos, Sağ temporal / frontal korteks değerlendirildi transgenik olmayan fare ve mRNA düzeylerinin sağ lateral ventrikül içine 2 hafta infüze edildi. Klinik Araştırmalar için American Society izniyle yayınlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> Şekil 5,. Yatay Yatak Dikiş Koşu. 5-0 naylon dikiş ipliği cilt içinde dokunan ve dışında olan, ön başlayan ve arka çalışma, kanül üzerinde daha fazla konsantre. Bir kez en arka noktasına ulaşmış, dikiş ipliğinin sonra geri getirdi ve bir kez daha kanül üzerinde dişli. Bu uygun yara kapama sağlar ve deri yoluyla çalışmasını kanül / boru engeller.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System at JoVE.com

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Ya bir kateterin yerleştirilmesi ya da farelerde sağ yan ventrikül içine, bir bolus enjeksiyonu gerçekleştirerek merkezi sinir sistemi ilaçları hedeflemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz antisens oligonükleotidler teslim odaklanmıştır. Bu teknik, diğer ilaçlara ve sıçanlara, kolaylıkla adapte edilebilir.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

direct-intraventricular-delivery-drugs-to-rodent-central-nervous

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of Psychosis and Mania

SCIENTISTS IN ACTION

59.7K Görüntüleme.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Ya bir kateterin yerleştirilmesi ya da farelerde sağ yan ventrikül içine, bir bolus enjeksiyonu gerçekleştirerek merkezi sinir sistemi ilaçları hedeflemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz antisens oligonükleotidler teslim odaklanmıştır. Bu teknik, diğer ilaçlara ve sıçanlara, kolaylıkla adapte edilebilir.

Video: Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Kemirgen Modeller Merkezi Sinir Sistemi Hastalıkları Tedavisinde Sistemik ve Yerel İlaç Taşıyıcı

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Nörobilim

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

Farmakodinamik etkileri erken faz ilaç geliştirme kolinerjik ilaçların merkezi sinir sistemi üzerinde çalışmak için bir bilgisayarlı Test batarya

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...