Biz NIH (Ödül numaraları MKL için R00 NS072192, CAW için AS.L. için HD029178 ve 2 RO1 NS032457) destek için müteşekkiriz. MKL Boston Çocuk Hastanesi&#39;nden Kariyer Geliştirme Bursu / Harvard Tıp Okulu Shore Kardeşlik ve Alfred P. Sloan Vakfı Fellow of sahibidir. CAW Howard Hughes Tıp Enstitüsü Araştırmacısı.

1. Embriyo İzolasyon / Hazırlık Bu teknik, fare ya da sıçan için de kullanılabilir. Bu protokolü biz BOS toplama tekniği ve fare embriyonik beyin kortikal eksplant diseksiyonu göstermektedir. Biz sıçanlarda karşı genel teknikler içinde var fareler için herhangi bir önemli farklar hakkında görüş bildirir. Embriyonik yaş evreleme sistemi için, E1 fareler için fiş günü olarak sınıflandırılır ve E0.5 fareler için fiş günü olarak sınıflandırılır. <ol><li> Sylgard Silikon Elastomer bir mikro-diseksiyon çanak hazırlayın. Sylgard 184 Silikon Elastomer A ve Bölüm B Kısım A ve Kısım B ağırlıkça veya hacimce 10:1 oranında karıştırılmaktadır iki bileşenli sıvı bileşen, Bölüm olarak verilir. Sıvı komponent karıştırıldıktan sonra, yemeğin tüm yüzeyini kapsayacak şekilde bir Petri kabı içine Sylgard elastomer dökün. Bazı hava kabarcıkları kür işlemi sırasında dağılacaktır mevcut olabilir. Üzerine Petri kabı kapağı yerleştirin ve elastom iziner tedavi. Elastomer 24 saat için oda sıcaklığında tedavi ya da daha hızlı sertleşmesi için daha yüksek bir sıcaklıkta (ör. 37 ° C). Edilebilir Bileşenlerin sıvı katılaşmaya sonra, diseksiyon çanak kullanıma hazırdır. Çanak prosedürü izleyerek de temizlenmiş olması koşuluyla, birden çok deneme için tekrar tekrar kullanılabilir. </li><li> Mikro-kapiller pipet (iğne) hazırlanması. Mikro-kapiller pipetler ısı uygulanarak hazırlanmış ve aşağıdaki ayarları ile bir Narishige PC-10 dikey mikropipet çektirmenin kullanarak çekme vardır: Bir adım çekme; Isıtıcı # 2 58 olarak ayarlanır; 100 g çekme ağırlığı. Mikropipet ince ucu titizlikle 55. forseps kullanılarak kapalı tersledi edilmektedir. İğnenin edilen ortalama iç çapı 85 mikron. </li><li> BOS aspirasyon için aspiratör montaj hazırlayın. Mikro-piston kılcal iğne içine mikro-kapiller pipetler ile sağlanan yerleştirin. Alternatif olarak, t bağlı aspiratör boru montaj sonuna kadar bir plastik tek kullanımlık filtre takınmikro-kapiller pipet o. Aspiratör montaj zıt ucunda pozisyon içine conta içerisinden iğne itin. </li><li> Çöp gelen Sylgard hazırlanan mikro diseksiyon çanak izole embriyo transfer. </li><li> Embriyo açıkça maruz böylece ekstra embriyonik membranlar ve dokuların çıkarın. Her doku tabakası-ilk rahim duvarına ve sonra desidua-can ince iridektomi makas (yani Güzel Bilim Araçları # 15000-02) ile disseke edilebilir. Her bir implantasyon yerinde, birinci rahim duvarına, daha sonra desidua rahim uzun eksenine paralel olarak çizilmiş edilebilir ve kesik sonra ince forseps kullanılarak daha fazla açılabilir. Desidua fetal membranlar açığa benzer bir insizyon sonrası kaldırılabilir. Bakım fetal membranlar kazınmış veya delinmiş değil böylece olunmalıdır. </li><li> Steril Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ile yıkayın ve bir pipet gibi bir Kimwipe veya filtre kullanarak çevreleyen embriyo aşırı sıvı kaldırmakkağıt üçgenler halinde doğrayın. </li></ol> 2. Ventriküler BOS Koleksiyonu <ol><li> Diseksiyon mikroskobu altında embriyo görselleştirin: fare, embriyo tek gelişen embriyonun sagittal bir görünümü vardır öyle ki, yan döşeme olmalıdır. Embriyonun sırtında yatıyor gibi sıçan embriyolarında E16 veya yaşlı ile, kaudal yönde bir kranial gelen, onun uzun düzlemsel boyut boyunca, onun dorsal spinal kolonda embriyo yerleştirin. Bu şekilde BOS sağ ve sol lateral ventrikül alınabilir. </li><li> Mütemadiyen pipet takıldıktan sonra nöroepitelyal hücrelerin temas etmeyecek çalışırken, lateral ventrikül, mezensefalik ventrikül veya sisterna magna içine mikro-kapiller pipet takın. Fare embriyo E14.5 veya daha büyük için, CSF sağ ventrikül aspire ve sonra iğne çıkarılır ve sol ventrikül içine eklenebilir. Embriyolarında ventriküller ve nöral tüp açıklığı nedeniyle genç E14.5 daha,Tüm BOS hacmini genellikle tek bir iğne ile lateral ventriküllerin aspire edilebilir. Bağlantı ventriküllerin gelişim süresi ve açıklık değişebilir ve bu nedenle, mikro-kapiler pipet da azami CSF hacim toplamak için sisterna magna içine eklenebilir Ancak, bu her zaman bir durum değildir. </li><li> Mikro-kapiller pipet dikkatle, lateral ventrikül, mezensefalik ventrikül veya sisterna magna içine yerleştirilir ve nazikçe negatif basınç oluşturmak ve BOS aspire ya mikro-piston kullanılarak, pipet içine BOS aspire başlar sonra, ya da bir sağlayarak BOS hafifçe yavaş ve kontrollü bir şekilde mikro-kapiller pipet akmaya başlar böyle ağız tarafından oluşturulan hafif negatif basınç. Biz izleyicinin bu yaklaşımlara kurumsal politikalar konusunda kendi yerel yetkililerle denetler öneririz. </li><li> Negatif basınç uygulamak ve mikro-kapiller pipet içine BOS toplamak için devam edin.E16.5/E17 veya genç fare ve sıçan embriyolarında hem de, bu mikro-kapiller pipet Büyük embriyo içeri olduğu baş tarafında oluşturan bir çimen ve görünümünü biraz ventriküle çöküşü gözlemlemek mümkündür Beynin daha büyük bir boyuta bağlı olarak, başın çöken gözlemlemek mümkün olmayabilir. </li><li> Basınç uygulayarak durdurun ve hafifçe lateral ventrikülden mikro-kapiller pipet çıkarın. </li><li> Yavaşça buz üzerinde soğutulmuş olan bir Eppendorf tüp içine BOS örneği sınırdışı. </li><li> Bütün bir hayvan çöp toplama dan CSF devam eder ve aynı tüp içine örnekleri havuzda. </li><li> Kontamine hücreleri çıkarmak için 10 dakika süreyle 4 ° C&#39;de 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Nöroepitelyal hücrelerin veya kırmızı kan hücreleri kirletici herhangi bir işaret için numuneler analiz. Kirlenme belirtileri genellikle bulanık ya da pembe / kırmızı görünen sıvı veya kan hafif boyanmış nokta ile bir pelet varlığı ile gösterilir. Santrifüjlemeden sonra, CSF hücreleri veya hücresel enkaz herhangi bir kanıt için mikroskopik analiz edilebilir. Kirlenme bulguları varsa akışkan atılmalıdır. İlave bir kontrol olarak, pelet içerik ayrıca hücreleri için kirlenmiş olabilir. Temiz bir CSF numune hücre kültürü, kortikal kültürü, spektrometresi, Western blot, ELISA, ve diğer deneyleri için de kullanılabilir. Açık CSF, yeni bir steril Eppendorf tüpüne aktarılmış olması gerekmektedir. Örnek hemen sıvı nitrojen ile dondurulmuş diğer örnekleri, veya ek ile toplanmış ve -80 ° C&#39;de saklanır, analiz için kullanılabilir Sıvı küçük numunelerin dondurma ve çözme küçük bir hacim azalması ve protein konsantrasyonu değişikliklere neden olabilir. Bu örneklerin dondurarak kurutma ile önlenebilir. </li></ol> 3. Kortikal Eksplantasyon Diseksiyon <ol><li> Sylgard hazırlanan mikro diseksiyon çanak üzerine çöp izole E14.5 embriyo transfer. </li><li> Adım 1.5 açıklandığı gibi ekstra embriyonik membranlar ve dokulardan embriyo çıkarın. </li> &lt;Steril Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ve bir pipet kullanarak çevreleyen embriyo aşırı sıvı kaldırmak li&gt; Yıkama. </li><li> Embriyo geri kalanı (Şekil 1A) itibaren baş ayıran servikal bölgeye teşrih. </li><li> Ince bir neşter (oftalmik bıçak) kullanarak, kafa derisi midline kısmak. Ince forseps ile bu kesi her iki tarafında tutun ve cilt kaldırmak. Sonraki, gelişmekte olan kafatası orta hat uzunluğu çalışan bir kesi yapmak için iridektomi makas kullanın. Daha sonra, gelişmekte olan kafatasının ön ve arka uçlarındaki iki ek kesiler, mesafe yaklaşık 1/3 yapmak. Kafatası &quot;flap&quot; kavramak için ince forseps kullanın diseksiyon bu bölümü sonucu ve korteks (Şekil 1B) açığa gelişmekte kafatası doku kaldırmak. </li><li> Sağ ve sol kortikal hemisferlerin (Şekil ayıran, orta sagital düzlemde orta hat boyunca neşter kenarortay beyin kullanma1B, C). Pia ve araknoid korteks bağlı kalır ve dura gelişen kafatası ile birlikte uzaklaştırılır. </li><li> Ayrı ayrı kortikal yarımkürede hazırlayın. Kadar böylece ganglionik eminens ve gelişmekte olan korteks (Şekil 1C, D) görebilirsiniz yarımkürede medial tarafı yerleştirin. </li><li> Neşter kullanarak, gelişmekte olan koku ampul için kaudal kortikal nöroepitelyumda aracılığıyla bir koronal kesi yapmak. Bu kesi lateral ve medial ganglionik Efendiler ön sınırında başlar ve gelişmekte olan kortikal yitiren organ (Şekil 1E) ve anterior singulat bölge boyunca uzanmalıdır. </li><li> Lateral ganglionik eminens (Şekil 1F) ve posterior sınırına sadece kaudal bir koronal kesi olun. Bu kesi aynı zamanda gelişmekte olan kortikal yitiren organ medial duvarına ganglionik eminens lateral sınır kadar uzanmalıdır. </li><li> Kortikal &quot;flap&quot; Crea geri çekinkortekse mekanik hasar görmesini önlemek için 200 ul pipet ile teslim HBSS bir akışından bir neşter veya hafif basınç kullanarak, adımları 3.7 ve 3.8 &#39;de yapılan iki kesiler ile ted. Daha sonra gelişen korteks (Şekil 1G, H) dan yanal ganglionik eminensinden ayıran sınır boyunca bir enine kesik yapmak. Daha sonra, yan yüzeyin kortikal duvar kürelerinin uygun neokorteks tepesinde, gelişmekte olan hipokampus ve medial telencephalon kortikal uzak kenar teşrih. </li><li> Gelişmekte olan korteks (Şekil 1H) gelen yanal ganglionik eminens ayıran sınır boyunca bir transvers kesi olun. </li><li> Disseke kortikal eksplant gelen Sylgard plaka üzerinde herhangi bir ekstra disseke doku çıkarın. Bir herhangi bir ekstra disseke doku uzakta Pipeti taze HBSS tamponu ile yumuşak pipetleme kullanabilirsiniz. Disseke korteks aşağı bakacak meningeal tarafında (Şekil 1I) ile şimdi. </li></ol><ol><li> Bir cam pipet bağlı bir platin tel döngü hazırlayın. Cam pipet sonuna yerleştirilmiş, katlanmış bir platin tel ile cam pipet ısıtın. Platin tel döngü sonuna bükerek, döngünün boyutu artmış ya da azalmış ve döngü istenilen eksplant sığacak şekilde şekillendirilebilir edilebilir. (Bu önceden hazırlanmış ve yeniden kullanılabilir.) </li><li> Döngü sterilize platin tel ucunu ısıtın. </li><li> Disseke kortikal eksplant yalıtmak ve tel döngü ile kullanmak için küçük bir miktar bırakarak, yumuşak pipetleme tarafından ekstra HBSS ortamı çıkarın. </li><li> 4 cm çapa görüntüleme tabak içinde bir 1 cm polikarbonat membran yerleştirin. </li><li> Meningeal tarafı yukarı bakacak şekilde platin tel döngü tarafı kullanarak, yavaşça korteks çevirin. </li><li> Döngünün ortasında eksplant yerleştirerek ve içsel hidrostatik kuvvetler kullanarak, diseksiyon çanak kapalı kortikal eksplant kaldırındüz bir düzlem üzerinde eksplant kaldırın. </li><li> Yavaşça polikarbonat membran üzerindeki eksplant yerleştirin ve uzak eksplant ventriküler yüzeyi membran ile temas halindeyken düz bir düzlem üzerinde membran kalır böyle platin tel döngü kaldırın. </li><li> Yavaşça membran kaldırın ve membran altında CSF veya diğer medya 50 ul Pipeti. </li><li> Görüntüleme çanak Kapak, sürekli hücre çoğalması ve eksplant büyümeyi desteklemek için 24 saat süreyle% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir ikincil bir kaba koyun ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. Şekil 2 final kortikal eksplant yemeğin hazırlanması şematik resmediyor. </li></ol>

<ol>
	<li>Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+in+cerebrospinal+fluid+and+plasma+of+fetal+rats+during+development.">Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development.</a> Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).</li><li>Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cerebro-spinal+fluid+protein+composition+in+early+developmental+stages+in+chick+embryos.">Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).</li><li>Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival,+proliferation,+and+neurogenesis+in+chick+embryos.">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).</li><li>Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+chick+embryonic+cerebrospinal+fluid.">Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).</li><li>Parada, C., Gato, A., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+embryonic+cerebrospinal+fluid+proteome+has+greater+apolipoprotein+and+enzyme+pattern+complexity+than+the+avian+proteome.">Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome.</a> Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).</li><li>Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+proteomic+analysis+of+human+and+rat+embryonic+cerebrospinal+fluid.">A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid.</a> Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).</li><li>Desmond, M. E., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+brain+enlargement+requires+cerebrospinal+fluid+pressure.">Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure.</a> Developmental Biology. 57 (1), 188-198 (1977).</li><li>Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+at+the+brain-cerebrospinal+fluid+interface.">Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).</li><li>Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells.">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).</li><li>Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid.">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).</li><li>Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells.">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).</li><li>Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid:+regulator+of+neurogenesis,+behavior,+and+beyond.">The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Ventriküler CSF toplama için açıklanan yönteme hücresel analizler 9 Bir dizi protein kararlı kompozisyon ve etkinlik ile tutarlı embriyonik CSF nispeten saf örnekleri vermiştir. İyi bir toplama tekniği ve on E14.5 fare DKBKS ile, bir BOS 10-15 ul toplamak için bekleyebilirsiniz ve E16 sıçan bir çöp gelen bir BOS 50-90 ul hakkında toplamak için bekleyebilirsiniz. Bu toplama tekniği dikkatli gözlem, santrifüj, ve hücresel enkaz veya kan renklendirmek herhangi bir kanıt ile numunelerin at...

BOS gelişmekte nöroepitelyumda 1-6 banyoları ve gelişmekte olan beyinde 8-12 için ipuçları teşvik gerekli basıncı 7 ve büyüme sağlayan karmaşık bir sıvıdır. Beyin gelişimi boyunca BOS incelenmesi, biz geliştirme 6,9 çeşitli aşamalarında sıçan veya fare embriyoları gelişmekte ventriküler BOS yalıtmak için teknikler geliştirildi. Izolasyon Önceki yöntemler cam mikro-iğne kullanarak ve bir mikro-enjektör 1,2 kullanarak BOS izole dahil. Bizim yöntem, ucu gelişmiş doku penetrasyonu için ultra ince noktası oluşturmak için çekilmiş olan bir cam mikro-kapiller pipet kullanır. Ventriküler CSF toplama basınç hafif değişiklikleri ile kontrol edilebilir, böylece cam mikro-kapiler pipet bir aspiratör ile bağlanır. BOS sinyal kök hücre etkilerini araştırmak için, biz, serebral kortikal eksplantlar teşrih polikarbonat membran üzerine koyun ve uygun cu bunları yüzenLTURE orta CSF numuneleri 9 ile desteklenmiş. Bu teknik sayesinde, medya hacimlerinde BOS 9 etkin kullanımı için izin, kültür dokusu için yeterlidir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Wiretrop II kılcal iğneler </td><td> Drummond Bilimsel </td><td> # 5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Ellsworth Yapıştırıcılar </td><td> # 184 SIL ELAST kiti </td><td></td></tr><tr><td> Aspiratör tüp montajı </td><td> Sigma </td><td> # A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td> Tek filtresi </td><td> Venturi veya yerel eczane </td><td> mevcut değil </td><td> Standart sigara filtresi </td></tr><tr><td> Roundstock oftalmik bıçağı (15 derece bıçak bıçak) </td><td> Dünya Precision Instruments, Inc </td><td> # 500250 </td><td></td></tr><tr><td> 35mm cam dipli kültür çanak </td><td> Mattek Corp </td><td> # P35G-1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Platin-iridyum tel </td><td> TriTech Araştırma </td><td> # PT-9010-010-3ft </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Parça-Etch Membran </td><td> Whatman </td><td> # 09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi </td><td> Fisher Scientific </td><td> # SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td> İridektomi Makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> # 15000-02 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants

BOS gelişimi boyunca ve yetişkinlikte dinamik değişen proteom karmaşık bir sıvıdır. Embriyonik gelişim sırasında, doğmakta olan BOS anterior nöral tüpün kapanması üzerine amniyotik sıvıdan ayırır. BOS hacmini sonra ventriküller ve koroid pleksus oluşturmak BOS astar nöroepitelyal progenitör hücreler olarak izleyen gün boyunca artar. Gelişmekte olan beyin ve omurilik nöral kök hücrelerin embriyonik BOS kişileri apikal, ventriküler yüzeyi. BOS gelişmekte olan beynin genişlemesi için hayati sıvı basıncı sağlar ve zamansal özgü şekilde nöral progenitör hücrelere faktörleri teşvik önemli bir büyüme dağıtır. BOS fonksiyonunu incelemek için, kan veya gelişmekte telencephalic dokudan kirlenme olmadan embriyonik BOS saf örnekleri izole etmek için önemlidir. Burada kullanılabilecek ventriküler embriyonik CSF nispeten saf örnekleri izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadırkütle spektrometrisi, protein elektroforezi, ve birincil hücre ve eksplant kültürünü içeren deneysel testler geniş bir yelpazede. Biz medya veya BOS azaltılmış hacimli gelişen kortikal dokusunun büyümesi için gözenekli polikarbonat membran kortikal eksplantlar teşrih ve kültür nasıl gösterilmektedir. Bu yöntem ile, deneyler, hedef hücreler üzerindeki CSF proteom biyolojik aktivitesini incelemek için çeşitli yaşlardan itibaren CSF ya da koşullar kullanılarak gerçekleştirilebilir.

BOS koleksiyonu açık, şeffaf sıvı boyun eğmek zorundadır. Aspirasyon ve Eppendorf tüp bir kırmızı veya sarı renklendirilmiş akışkan tarafından gösterildiği gibi, kandan kirlenme hiçbir kanıt olmamalıdır. Ayrıca aspirat ve Eppendorf tüp dokusunun hiçbir kanıt olmamalıdır. BOS santrifüj edildiğinde, bir de herhangi bir kirlenme olduğunu sağlamak için mikroskobik BOS değerlendirir. Kontaminasyon belirtileri varsa, BOS atılmalıdır. Biri E14.5 fare çöp bakıldığında biri 10-15 ul BOS...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants at JoVE.com

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Ventrikül beyin omurilik sıvısı (BOS) embriyo erken beyin gelişimi sırasında nöroepitelyal ve serebral kortikal progenitör hücreler banyoları. Burada biyolojik işlevini araştırmak amacıyla farklı yaşlardaki kemirgen embriyolardan ventriküler BOS yalıtmak için geliştirilen yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bizim serebral kortikal eksplant diseksiyonu ve kültür ortamı veya BOS minimum hacimlerde eksplant büyüme sağlar kültürü tekniği göstermek.

Dissected Serebral Kortikal Eksplantlarından ile kullanım için Kemirgen Embriyolar arasından Beyin Omurilik Sıvısı İzolasyonu

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

isolation-cerebrospinal-fluid-from-rodent-embryos-for-use-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.8K Görüntüleme.  VA Greater Los Angeles Healthcare System. Ventrikül beyin omurilik sıvısı (BOS) embriyo erken beyin gelişimi sırasında nöroepitelyal ve serebral kortikal progenitör hücreler banyoları. Burada biyolojik işlevini araştırmak amacıyla farklı yaşlardaki kemirgen embriyolardan ventriküler BOS yalıtmak için geliştirilen yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bizim serebral kortikal eksplant diseksiyonu ve kültür ortamı veya BOS minimum hacimlerde eksplant büyüme sağlar kültürü tekniği göste...

Video: Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed method based on molecular weight cut-off (MWCO) filtration and mass spectrometric analysis was combined with an offline high-pH reverse phase HPLC pre-fractionation step.
Secretion into CSF is the main pathway for removal of molecules shed by cells of the central nervous system. Thus, many processes in the central nervous system are reflected in the CSF, rendering it a valuable diagnostic fluid. CSF has a complex composition, containing proteins that span a concentration range of 8 - 9 orders of magnitude. Besides proteins, previous studies have also demonstrated the presence of a large number of endogenous peptides. While less extensively studied than proteins, these may also hold potential interest as biomarkers.
Endogenous peptides were separated from the CSF protein content through MWCO filtration. By removing a majority of the protein content from the sample, it is possible to increase the sample volume studied and thereby also the total amount of the endogenous peptides. The complexity of the filtrated peptide mixture was addressed by including a reverse phase (RP) HPLC pre-fractionation step at alkaline pH prior to LC-MS analysis. The fractionation was combined with a simple concatenation scheme where 60 fractions were pooled into 12, analysis time consumption could thereby be reduced while still largely avoiding co-elution.
Automated peptide identification was performed by using three different peptide/protein identification software programs and subsequently combining the results. The different programs were complementary rather than comparable with less than 15% of the identifications overlapped between the three.

A method for mass spectrometric analysis of endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF) is presented. By employing molecular weight cut-off filtration, chromatographic pre-fractionation, mass spectrometric analysis and a subsequent combination of peptide identification strategies, it was possible to expand the known CSF peptidome nearly ten-fold compared to previous studies.

İnsan serebrospinal sıvı Endopeptidomic analiz için numune hazırlama

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

Beyin omurilik sıvısı imzalat fareler gelen topluluğu için geliştirilmiş bir yöntem

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

Pro-enflamatuar Sitokinlerin İntraserebral Enjeksiyonu ile İndüklenen Yaygın Serebral Kortikal Demiyelinasyonun Sıçan Modeli

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Serebral arterler patlama kaynaklı Neurotrauma etkilerini basınçlı kemirgen orta

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Çin Masaj Teknikleri: Serebral Palsili Sıçanlarda Motor Fonksiyonun Arttırılması

Abdominal Massage to Improve Motor Dysfunction in Rats with Cerebral Palsy

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal posture development, often accompanied by cognitive impairment. Massage, a traditional Chinese Medicine therapy, can coordinate Zang and Fu, regulate Qi and blood, make the viscera work more smoothly, and calm Yin and Yang. Furthermore, it has been an effective method for CP in clinical. This paper summarizes a set of simple and standardized manipulations of massage for young rats with CP, which is easy to follow. The procedure follows: first, massage of four limb acupoints, including Quchi (LI11) and Zusanli (ST36); second, massage of the abdomen acupoints Zhongwan (RN12), Tianshu (ST25), Guanyuan (CV4), and Qihai (CV6); and finally, massage of the abdomen of the rats. This set of massage methods considerably improved the motor function of young rats with CP and is simple, standardized, and easy to follow. We adapted this set of manipulation methods in animal models to promote the internationalization and standardization of massage.

Yazar Spotlight: Hayvan Modellerini Kullanarak Serebral Palside Masaj Terapisinin Potansiyelini Keşfetmek 

Here, we present a set of massage manipulations in the rat model of cerebral palsy that can considerably improve the motor function of cerebral palsy rats.

Serebral Palsili Sıçanlarda Motor Disfonksiyonunu İyileştirmek için Karın Masajı

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal ...