Bu çalışma NIH hibe GM45916 ve GM66834 Hi&#39;de ve bu işi Ak Uluslararası Rett Sendromu Vakfı bir burs ile desteklenmiştir da NIH GM088409 ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü KL katkıları hibe tarafından desteklenen

1.. Octamers içine Rekombinant çekirdek histon Meclisi Gerekçe: nucleosomal dizi sulandırma içinde ilk adım Liyofilize rekombinant çekirdek histon adlı doğal çekirdek histon octamers hazırlamaktır. Histon proteinler eşit molar miktarlarda bir araya getirilmiş ve tekrar katlama tampon maddesi içine bir denatüre edici tampon üzerinden örnekleri diyaliz ile histon octamers içine monte edilir. <ol><li> Arındırmak ve 13, tarif edildiği gibi (H2A, H2B, H3, H4) yeniden birleştirici çekirdek histon liyofilize edilir. </li><li> Açılımı tamponu (6 M guanidinyum HCI, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM DTT) içinde, 3 ml, her liyofilize çekirdek histon yaklaşık olarak 5 mg çözülür. Her eş pay, en az bir saat boyunca eritmek için izin verin. Herhangi bir protein, kabın iki kalmasını sağlayın. </li><li> Bir referans olarak açılımı tamponu kullanılarak 276 nm&#39;de her bir histon absorbansı ölçülür. </li><li> Bunların yok olma katsayıları kullanılarak her bir histon molaritesini hesaplayın (bakınız Tablo 1 </stRong&gt; Xenopus histon sönme katsayıları için). Proteininin büyük bir kısmı çözülür ise, liyofilize kuru ağırlığı ve tahmine histonun absorbans belirlenmiştir konsantrasyonu karşılaştır. </li><li> Bu tüm histonlanm mol sınırlayıcı sayısı olacak gibi, sen az mol sahip olan histon belirleyin. </li><li> Eşit molar miktarlarda histonları birleştirin ve 1 mg / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar tampon açılımı ile seyreltin. </li><li> 6-8 kDa MWCO diyaliz tüp içine örneği yerleştir. Boru Seal ve soğuk katlama tamponu, 2 L içine koyun (2 M NaCl, 10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 5 mM β-merkaptoetanol). </li><li> Karıştırılarak 4 ° C&#39;de 18 saat için örnek Dialyze. Emin diyaliz boru serbestçe ve şiddetle dönebilir, ya da başka histon hızlandırabilir. </li><li> Iki kere 18 saatlik bir süre (örneğin, her tamamlanan kadar 6 saat ilgili katlama tampon değiştirme) &#39;de diyaliz tampon değiştirin. Çökelti meydana bile atmak yokverim azaltılabilir rağmen, numune, bir oktamer geri kazanılabilir. </li></ol> Not: Bir sonraki gün için sütun dengeye hazırlamak için adım 2.1-2.2 bakın. 2. Boyut Dışlama Kromatografisi ile Histone Octamers saflaştırılması Gerekçe: Bölüm 1 ile tamamladıktan sonra, numuneler histon octamers yanı sıra, agrega, H3/H4 tetramerleri ve H2A/H2B dimerler gibi histon kompleksleri içerir. Histon octamers uzak boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile bu komplekslerden arıtıldı olacaktır. <ol><li> Bir Hiload bir FPLC sistemi 16/60 Superdex-200 16/60 (S200) kolonu bağlayın. Hava kabarcıkları sisteme girmeyin emin olun. </li><li> 0.2 um filtre edildi, su ile S200 sütunu temizleyin. 0.3 ml / dk &#39;lık bir akış hızı kullanarak, 0.5 MPa bir geri basınç sınırını belirler. Eğer yeterli su sağlanması ve sütun gecede temizlemek için izin. </li><li> F S200 kolon ve örnek döngü dengelePLC yeniden katlama tamponu kullanılarak. 0.2 um filtre edildi tekrar katlama tampon maddesi 1 L kullanın. 1 ml / dk &#39;lik bir oranda ve yaklaşık 2 saat boyunca 0.5 MPa bir azami basınçla kolonundan katlama tampon akış. </li><li> Yeniden katlama tamponu içinde 1 ml bir Vivaspin santrifüj konsantratör (50 kDa MWCO) dengelenmesi. Diyaliz tüpünden alınan numuneyi çıkarın ve çökeltileri uzaklaştırmak üzere, 4 ° C de bir örnek santrifüj. Konsantratör içine örnek süpernatant pipetle. Yaklaşık 500 ul&#39;lik bir hacme kadar konsantre örneği. </li><li> Yeni bir kaba üzere, konsantre oktamer numuneyi çıkarın ve 1 ml tampon ile tekrar katlama konsantratör yıkayın. 500 ul durulama aşağı Konsantre ve oktamer örnek ekleyin. Bu durum, bir deriştirme aygıtı içinde kalan oktameri kurtarmak için yardımcı olur. </li><li> 4 ° C&#39;de 10,000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca bir 1.5 ml mikrofüj tüpüne örnek Spin Süpernatan toplamak ve yeni bir tüpe aktarılır. Bu, FPL ile ilgili örnek yüklemeden önce herhangi bir çökeltiyi uzaklaştırmak için yardımcı olurC. </li><li> S200 kolonuna örnek yükleyin. Tek bir saflaştırma 1.5 ml toplam hacmi veya 15 mg oktamer maksimum yükleyin. </li><li> Taze yapılmış yeniden katlama tamponu kullanılarak örnek Zehir. 1 ml / dk &#39;lık bir akış hızı ve 0.5 MPa arasında bir geri basınç sınırı kullanın. Yeniden katlama tamponu, iki kolon hacmi (400 mi) kullanarak ve 2 ml fraksiyonlar toplar. Elüsyon süresince, 280 nm&#39;de absorbansı izleyin. Farklı türlerin boyutunu azalan Zehir olacaktır. Histon agrega genellikle yaklaşık 84 ml (Şekil 1) en az yaklaşık 45 ml, yaklaşık 65 ml oktamer de ve dimer elute. </li><li> Bir 18-20% SDS-PAGE üzerinde örnekleri çalıştırarak ilgi tepelerinden elüsyon fraksiyonları analiz edin. Saflaştırılmış octamers ihtiva eden fraksiyonlar dört çekirdek histon proteinleri eşit molar miktarda (Şekil 1) sahip olmalıdır. </li><li> Saflaştırılmış octamers içeren kesirler havuzu ve bir Vivaspin santrifüj filtre ile 15 mg / ml ≤ için konsantre. Sulandırmak bırakılırsa, octamers kesmek olabilir iNto H2A/H2B dimerleri ve H3/H4 tetramerler. </li><li> 280 nm&#39;de absorbansı ölçerek oktamer konsantrasyonunu belirleyin ve Tablo 1 sönüm katsayısı kullanarak hesaplar. </li><li> Histon octamers 4 ° C&#39;de tekrar katlama tampon maddesi içinde kısa süreli tutulabilir Uzun süreli depolamada halinde, octamers -20 ° C&#39;de ve bir% 50 gliserol çözeltisi içinde daha kararlı olacaktır. Gliserol içinde depolanmıştır Octamers absorbans ölçümleri yapılmadan önce taze yeniden katlama tamponuna karşı dializ edilmiş ve nükleozomal dizi reconstitutions olarak kullanmak gerekir. </li></ol> 3. DNA dizileri ve nükleozomal Saflaştırılmış Octamers Sulandırılması Gerekçe: nükleozomal dizilerin Sulandırma histon octamers ve şablon DNA spesifik mol oranlarında bir araya gerektirir. 2 M NaCI içinde DNA ve histon octamers karışımları iyonik mukavemeti azalan tampon içine dialize adımdır. Düşük tuz kademeli değişim Uygun nucleosome oluşumunu sağlar. N eldeşablon DNA histon oktamer doygunluk istenen düzeyde ucleosomal diziler büyük ölçekli bir hazırlayıcı yeniden oluşturulması, ardından küçük ölçekli bir test reconstitutions gerektirir. Küçük ölçekli reconstitutions tarafından tanımlanan uygun koşullar hazırlayıcı yeniden oluşturma yönlendirmek için kullanılır. <ol><li> 4,12 anlatıldığı gibi tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA arındırın. Kısaca, bir Qiagen GigaPrep kiti ya da benzeri bir ürün kullanılarak plazmid DNA izole eder. Set-up bir kısıtlama enzim şablon DNA&#39;yı serbest bırakmak ve daha küçük boyutlarda (≤ 700 bp) için plazmid DNA sindirmek için sindirmek. Şablon DNA daha sonra uzak boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanılarak küçük bir plazmid DNA kalıntılarından saflaştırılabilir. A ağırlık Sephacryl S-1000 boncuklarla doludur yaklaşık 115 cm&#39;lik bir yüksekliğe sahip bir sütun beslenen 207bp 601 x 12 mer DNA saflaştırılması için yeterlidir. </li></ol> Notlar: plazmid DNA azalma pahasına arınma ancak artan eff içinort, bir E. plasmid DNA izole etmek için fenol / kloroform DNA saflaştırma ile alkalin liziz kullanabilir coli 23,24. Plazmid DNA şablon DNA&#39;nın ayrılması için Stratejiler şablon DNA boyut değişiklikleri ile farklılık gösterebilir. SEC için bu kısıtlama enzimi şablonu ve plasmid DNA arasındaki büyüklüğü farkı maksimuma bir şekilde, sindirimi kurmak için önemlidir. <ol start="2"><li> Molar oranları (r) reconstitutions için hangi belirler. R DNA tekrarının mol oktamer mol oranına eşittir. Niyet doymuş nucleosomal diziler elde etmek ise ilk küçük ölçekli araştırmalar için, 0.9, 1, 1.1 ve r değerleri uygundur. </li><li> Test edilecek her bir mol oranı için yaklaşık olarak 18 ug DNA eklemek için oktamer miktarının hesaplanması ile küçük çaplı numune hazırlayın. DNA ve histon octamers karıştırın. Örnekteki NaCI nihai konsantrasyon 2 M ≥ ve D nihai konsantrasyonu olmalıdırNA yaklaşık 0,3 mg / ml olmalıdır. Son numune tamponu koşulları da 10 mM Tris, pH 7.8 ve 1 mM EDTA içermelidir. </li><li> Numuneler artık diyaliz için hazırız. 12k-14k MWCO diyaliz tüp içine örnekleri yükleyin. Aşağıdaki gibi iyonik mukavemetini azaltır tampon 2L karşı örnekleri Dialyze. </li></ol> 10 mM Tris pH 7.8, 1 mM EDTA: Bütün tamponlar içerisinde Bileşenleri. Tampon 1 5-6 saat boyunca (1 M NaCl, 1 mM DTT ekleyin). Tampon 2, gece boyunca (0.75 M NaCl, 1 mM DTT ekleyin). Tampon 3 saat boyunca, 5-6 (2.5 mM NaCI, 1 mM DTT ekleyin). Tampon 4 gece boyunca (2.5 mM NaCI, 0.1 mM PMSF ekleniyor). <ol start="5"><li> Diyaliz borudan örnekleri çıkarın ve bölümlere 4-6 geçin. Küçük ölçekli örnekler istenen sonuçları ise, büyük ölçekte bölümler 3-6 adımları tekrarlayın. </li></ol> Not: bilgi muhafaza etmek için, küçük ölçekli örnekler alt tarama deneyleri için yeterli için gerekli olan minimum hacme sahip olmalıdır. E sahip amacıylanough 0.3 mg / ml DNA da burada listelenen çökelme hızı ve AFM deneyler, 50 ul örnekler için örnek uygundur. Büyük ölçekli büyüklüğü, hazırlayıcı örnekler amaçlanan kullanıma bağlıdır. Büyük ölçekli bir numunesi, küçük ölçekli örneklerle aynı şekilde hazırlanmalıdır. 4. Sulandırılmış nucleosomal Dizilerin sedimantasyon hızı analizi Gerekçe: çözelti içinde moleküllerin büyüklüğü ve şekli ile ilgili en Beckman XL-A / I Analitik ultrasantrifüj verim bilgilerde sedimantasyon hızının deneyleri. Düşük tuz koşulları altında, sedimantasyon hızının deneyler yeniden dizileri nükleozom doymuş hangi ölçüde belirlemek için kullanılır. <ol><li> TEN tamponu (10 mM Tris pH 7.8, 1 mM EDTA, 2.5 mM NaCl) kullanılarak, 260 nm&#39;de 0.5 bir soğurma için örnek seyreltin. Bir tarafta ve numune referen ile, iki sektör merkez ile bir hücreye örnek 400 ul yükDiğer 25 ce (TEN tampon). (Yani 420 ul referans çözümü eklemek) numune menisküsün daha yüksek referans menisküs tutun. </li><li> Rotor içine hücreleri yükleyin ve düzgün hücre ve rotorun 25 alt kısmında karma işaretleri kullanarak hücreleri hizalayın. Yavaşça basınçlı hava ile hücrelerin lensler toz. </li><li> , XL-A/XL-I santrifüj açmak rotor takın ve eklemek ve kılavuzunda anlatıldığı gibi optik sabitleyin. Yeni: Proteom Lab yazılımı seçin ve dosyayı açın. </li><li> 3,000 rpm ve 25 ° C sıcaklıkta, tek bir tarama çalıştırmak kurmak Seçenekleri altında seçin son taramadan sonra durma ve çalışma radyal kalibrasyon (rotor EAA kullanılan son rotor ise radyal kalibrasyon gerekli değildir). </li><li> Her bir hücre için, numune adı bir dalga boyu (260 nm) seçin, absorbans seçin ve bilgisayarınıza bir dosyayı kaydetmek konumu seçin. Tek bir tarama çalıştırmak başlayın. </li><li> Uygun ra belirlemek için tek tarama kullanınTarama uzunluğu (Şekil 2A) çevirin. Taranır hücrenin uzunluğunun azaltılması kullanım süresini azaltır. Ancak örnek menisküs içerir ve çok yakın ya da hücrenin altındaki doğru uzanır ve emin olun. </li></ol> Not: Tek taramalar ölçüm alanı sadece örnek menisküs (Şekil 2A) önce başlayarak ölçümler kısaltılmış izin verir. AUC çalışması sırasında üretilen taramasından en menisküs gibi istikrarlı platolar (Şekil 2B) geçen sınır fraksiyonlar olmalıdır. EAA hücreleri üzerinde kirli lensler büyük sivri taramalar üretebilir, bu verilerin analizini etkileyebilir. UltraScan yazılım analitik ultrasantrifügasyon verilerin 26 analizi ile ilgili bilgi için büyük bir kaynaktır bir kılavuzu içerir. <ol start="7"><li> XL-A/XL-I kontrol panelini kullanarak, bir 0 hız ve basın başlangıç ​​girin. Bu, bir vakum ve çekmek için santrifüj haznesi isteyecektirow odasının sıcaklığı dengelenmeye. Bir çalışma başlamadan önce sıcaklık dengesini sağlamak için 1 saat bekleyin. </li><li> İstenilen hız ve tarama sayısı için çalışma yukarı ayarlamak için yazılımını kullanın. Daha yüksek hızlar çözünürlüğünü artırabilir, ancak numune hücresinin alt tortulaşmış önce bir adet en azından 20 taramalar (tercihen daha fazlası) toplamalıdır. Bu çalıştırmak ilerlemeyi izlemek ve bu sızıntı hücreleri gibi olası sorunları kontrol etmek için (seçenekler menüsünden gerçekleştirilir) son birkaç taramaları kaplanması uygundur. Düzgün çalışmasını sağlamak için taramalar ilk çift izleyin. </li></ol> 5. Sedimentasyon Hızı Veri düzenleme ve Analizi Gerekçe: Ham sedimantasyon hızı verileri, difüzyon-düzeltilmiş sedimantasyon katsayısı dağılımını veren bir program tarafından analiz edilmelidir. Sırayla Bu bilgi, belirli bir doygunluk düzeyini içeren bir yeniden numunenin kısmını gösterir, örn </em&gt; 12-mer DNA şablonu kullanarak eğer 10, 11, 12 ve nükleozom / DNA yeniden sahip dizilerin fraksiyonunu belirlemek mümkün olacaktır. <ol><li> Verileri 26 düzenlemek için bu tür UltraScan gibi AUC veri analiz yazılımı kullanın. Tarama verilerinin düzenleme her bir hücre için yapılır ve sonraki analiz için bir veri kümesi oluşturur gerekir. Taramaları doğru düzenleme, örnek menisküs tanımlayan ilgi bölgeye verileri azaltarak ve taban çizgisini yanı sıra yayla bölgeleri (Şekil 2) tanımlamayı kapsar. İstenmeyen taramaları da bu noktada belirlenen verilerden çıkarılabilir. Bu analiz sırasında istenmeyen taramalar kaldırmak mümkündür Bununla birlikte, bu tarama, tüm bu noktada tutulması önerilir. </li><li> Önemle gelişmiş van Holde-Weischet yöntemi veriler 27 analiz etmek için kullanılır öneririz. Bu analiz yöntemi çalıştırmak boyunca difüzyon etkileri için düzeltir ve sedimentasyon katsayıları tamamlayıcı dağılımı elde edilir. Özellikle, Gelişmiş van Holde-Weischet yöntemi (UltraScan uygulandığı gibi) kararlı yaylaları eksikliği, ya da analiz 28 menisküs temizlenmiş değil sınır kesirler içerdiğini taramalarının dahil edilmesine izin verir. </li><li> Monte diziler için sedimantasyon katsayılarının dağılımını belirlemek. 601-12 (207bp, 12-mer) nükleozomal diziler için Örnek sonuçlar Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. </li><li> Küçük ölçekli örneklerinden biri sedimantasyon katsayıları arzu edilen dizi dizileri içeriyorsa, o zaman bölümü 3 başlayarak artan bir ölçekte işlemini tekrarlayın. Küçük ölçekli örneklerin hiçbiri sedimantasyon katsayılarının uygun dağılımına sahip ise 3. bölümde başlayan yeni bir r dizi küçük ölçekli testleri tekrarlayın. </li></ol> 6. Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak nucleosomal Dizileri görselleştirme (AFM) Gerekçe: AFM sağlar: nucleosoma doyma seviyesinin görselleştirmel diziler. Bu teknik, bir kalite kontrol deneyi olarak AUC ve sınır enzimi sindirimi ile sedimantasyon hızını tamamlar. <ol><li> Yukarıda tarif edilen yöntemler kullanılarak, ve doygun nükleozom dizisi (Şekil 5A) elde edilmiştir. </li><li> Hazırlama APTES yerleştirerek mika slaytlar ~ 30 ul muamele edilmiş, 30 dakika için 0.22 um filtre nanopure su içinde ticari (Sigma-Aldrich (3-Aminopropil)-trietoksisilan A3648 100 mi) içinde 1:1000 seyreltme. </li><li> 30 dakika sonra filtre edildi, su ile APTES durulayın ve yavaşça azot gazı akışı içinde kurutun. </li><li> Slayt üzerinde uygun şekilde seyreltilmiş nükleozom dizisi örneği (~ 1.5 ng / ml) yerleştirin ve 15 dakika için oda sıcaklığında kapalı inkübe edin. </li><li> Süzüldü, numune tamponu ile kapalı gibi örnek önce kurumasını ve AFM (bu durumda bir Sığınma Araştırma MFP-3D Atomik Kuvvet Mikroskobu) ve sahnede yer slayt durulayın. </li><li> 512 tarama hattı ile 2 x 2 mikron taramaları görüntüleme başlayın. Sa seviyesini tespit etmek nükleozomlann sayısınıturation (Şekil 5B). </li><li> İdeal gerektiği de ayrı nucleosome dizilerle slaytta görüntü alanları. </li><li> Daha yüksek çözünürlüklü görüntüler, 500 x 500 nm tarama (Şekil 5C) elde edilebilir. </li><li> Görüntüler basık ve İltica tarafından sağlanan MFP-3D yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. </li><li> Her görüntü dört parçaya bölünür ve nükleozomlann (Şekil 5C, sağ panel-yükseklik izleme için elde edilen diziler ve yükseklik profilleri üzerinden çizilebilir iyi ayrılmış diziler ve çoklu serbest el çizgileri net bir görünüm elde etmek için dijital zoomlanabilir ve 5D). </li><li> Birkaç tür görüntüler nükleozomlann yüzlerce kapsayan dizinin her bir türü için analiz edilmelidir. Yükseklik profilleri, kaydedilmiş kategorize ve MS Excel çizilmiştir. </li></ol>

<ol>
	<li>Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 7, (1997).</li><li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+the+chromatin+fiber+in+solution:+determinants,+mechanisms,+and+functions.">Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).</li><li>McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+architectural+proteins.">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li><li>Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+reconstituted+oligonucleosomes,+evidence+for+salt-dependent+folding+in+the+absence+of+histone+H1.">Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1.</a> Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).</li><li>Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activator-dependent+p300+acetylation+of+chromatin+in+vitro:+enhancement+of+transcription+by+disruption+of+repressive+nucleosome-nucleosome+interactions.">Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).</li><li>Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+of+compacted+chromatin+by+early+developmental+transcription+factors+HNF3+(FoxA)+and+GATA-4.">Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4.</a> Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).</li><li>Nguyen, C., Gonzales, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=chromatin+structure+associated+with+methylation-induced+gene+silencing+in+cancer+cells:+correlation+of+accessibility,+methylation,+MeCP2+binding+and+acetylation.">chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation.</a> Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).</li><li>Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forkhead+factor+FoxE1+binds+to+the+thyroperoxidase+promoter+during+thyroid+cell+differentiation+and+modifies+compacted+chromatin+structure.">The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).</li><li>Simpson, R. T., Stafford, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+a+phased+nucleosome+core+particle.">Structural features of a phased nucleosome core particle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+and+free+energies+of+selected+natural+and+non-natural+nucleosome+positioning+DNA+sequences.">Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences.</a> Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).</li><li>Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Core+Histone+N-terminal+Tail+Domains+Function+Independently+and+Additively+during+Salt-dependent+Oligomerization+of+Nucleosomal+Arrays+*.">The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).</li><li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution.">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).</li><li>McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+histone+H4+N-terminal+domain+function+during+nucleosomal+array+oligomerization:+roles+of+amino+acid+sequence,+domain+length,+and+charge+density.">Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).</li><li>Ma Shogren-Knaak, ., Fry, C. J., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+peptide+ligation+strategy+for+deciphering+nucleosomal+histone+modifications.">A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).</li><li>Lu, X., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+H3K79+dimethylation+and+H4K20+trimethylation+on+nucleosome+and+chromatin+structure.">The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).</li><li>Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation+for+the+Analysis+of+Chromatin+Structure.">Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure.</a> Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).</li><li>Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+and+agarose+gel+electrophoresis+as+tools+for+studying+chromatin+folding+in+solution.">Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution.</a> Methods. 12 (1), 62-72 (1997).</li><li>Montel, F., Menoni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+individual+nucleosomes+controls+the+chromatin+condensation+pathway:+direct+atomic+force+microscopy+visualization+of+variant+chromatin.">The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin.</a> Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).</li><li>Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+region+of+macroH2A+promotes+self-association+of+nucleosomal+arrays.">The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).</li><li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+nucleosomes+revealed+by+time-lapse+atomic+force+microscopy.">Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).</li><li>Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+atomic+force+microscopy+to+study+chromatin+structure+and+nucleosome+remodeling.">Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling.</a> Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).</li><li>Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).</li><li>Demeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UltraScan:+a+comprehensive+data+analysis+software+package+for+analytical+ultracentrifugation+experiments.">UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments.</a> Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).</li><li>Holde, K. V., Weischet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+analysis+of+sedimentation+velocity+experiments+with+monodisperse+and+paucidisperse+solutes.">Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes.</a> Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).</li><li>Demeler, B., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+velocity+analysis+of+highly+heterogeneous+systems.">Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems.</a> Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).</li><li>Hansen, J., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+structural+properties+of+subsaturated+chromatin+arrays.">Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays.</a> Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).</li><li>Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+repeat+length+and+linker+histone+stoichiometry+determine+chromatin+fiber+structure.">Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).</li><li>Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosome+surface+regulates+chromatin+compaction+and+couples+it+with+transcriptional+repression.">The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+arrays+reveal+the+two-start+organization+of+the+chromatin+fiber.">Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber.</a> Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).</li><li>Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Short+nucleosome+repeats+impose+rotational+modulations+on+chromatin+fibre+folding.">a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding.</a> The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).</li><li>Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Silent+Information+Regulator+3+Protein+,+SIR3p+,+Binds+to+Chromatin+Fibers+and+Assembles+a+Hypercondensed+Chromatin+Architecture+in+the+Presence+of+Salt.">The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).</li><li>Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+tetranucleosome+and+its+implications+for+the+chromatin+fibre.">X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre.</a> Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).</li><li>Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+histone+variant+H2A.Z+regulates+the+equilibrium+between+different+chromatin+conformational+states.">The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states.</a> Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).</li><li>Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linker+histones+stabilize+the+intrinsic+salt-dependent+folding+of+nucleosomal+arrays:+mechanistic+ramifications+for+higher-order+chromatin+folding.">Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding.</a> Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).</li><li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+&amp;#34;30+nm&amp;#34;+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone.">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &amp;#34;30 nm&amp;#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+fiber+folding:+requirement+for+the+histone+H4+N-terminal+tail.">Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail.</a> J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).</li><li>Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+chromatin+folding+patterns+in+chicken+erythrocytes+by+atomic+force+microscopy+(AFM.">Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM.</a> Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışmaları var.

Model nucleosomal diziler kromatin yapısı ve fonksiyonu in vitro çalışma için çok yararlı bir araçtır. Örneğin, yaygın olarak çözelti 30-34 kromatin fiber yoğuşma mekanizmasını incelemek için kullanılan ve mümkün bir tetranucleosome 35 bir x-ışını yapı elde etmek için yapılmıştır. Daha yakın zamanlarda bu, belirli çekirdek histon varyantları, mutantlan ve posttranslasyonel modifikasyonlar 14-16,36 yapısal etkileri çözmekte yararlı olduğu ...

Ökaryotik genomları gibi çıplak DNA yoktur, ama yerine sıkıştırılmış ve bağlı proteinler tarafından organize edilir. DNA ve protein Bu kompleksler, kromatin olarak bilinir. Kromatinlerin temel tekrarlanan ünite nucleosome olduğunu. Bir nucleosome histon oktamer ve yaklaşık 1,6 kat 1 oktamer histona sarılı DNA 146 baz çiftinden oluşmuştur. Histon oktamer iki kopya çekirdek histon H2A, H2B, H3 ve H4 her oluşmaktadır. Burada tekrar tekrar bir DNA molekülü boyunca aralıklı olan Çekirdek histon octamers nükleozomal dizileri olarak adlandırılır. Nükleozomal dizilerinin yapısı, uzatılmış bir yapı &quot;ipe dizili boncuklar&quot; 10 nm ya da lif olarak adlandırılır ve düşük tuz koşulları altında 2, in vitro olarak mevcut olmuştur. 10 nm fiber içi dizi sıkıştırma ve / veya arası dizi oligomerizasyonu 2 vasıtasıyla daha yüksek düzeyde yapılar içine yoğunlaştırma yeteneğine sahip olduğunu. Bu yüksek sıralanmaları, tuzların mevcudiyetinde indüklenebilirveya nükleozomal dizi 3,4 kromatin mimari proteinlerin bağlanma yoluyla etkilenebilir. Kromatin sıkıştırma düzeyleri ters vivo 5,6 transkripsiyon oranı ile ilişkilidir. Son araştırmalar, farklılaşma, kanser gelişimi ve diğerleri 7,8 gibi süreçlerde Genomların yapısal kuruluşun önemini vurgulamaktadır. Kromatin yapısını ve işlevini incelemek için nucleosomal dizilerin kullanımı yaygın hale gelmiştir. Burada rekombinant çekirdek histon ve nucleosome konumlandırma DNA&#39;dan nucleosomal dizilerin montajı için bir yöntem açıklanmaktadır. Nükleozom konumlandırma dizilerin tandem tekrarı ile rekombinant DNA kullanarak düzenli olarak aralıklı nükleozom içeren dizilerin yeniden oluşturulması için izin verir. Daha popüler konumlandırma dizilerin iki 5S rRNA gen sekansı ve &quot;601&quot; sekans 9,10 bulunmaktadır. 601 dizisi SELEX deneyler ve mor elde edildie güçlü 5S dizisi 11 daha nükleozom konumlandırır. Sonuç olarak, 601 dizilerinin, bağlayıcı DNA uzunluğu daha homojendir. Tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA jel filtrasyonu 4,12 ile elde edilir. Rekombinant E. histonlar saflaştınlır denatüre edici koşullar altında 13 coli. Rekombinant histonların kullanımı bir dikkatle nucleosomal dizilerin histon kompozisyonunu kontrol etmenizi sağlar. Örneğin, çekirdek 15,16 yabani tip çekirdek histon ikame edilebilir spesifik mutasyonlar 14 ya da post-translasyonel modifikasyonlar taşıyan histonlar. Çökeltme hız deneyleri uygulanan santrifüj kuvveti altında 17 çözeltisi içinde makromoleküllerin sedimantasyon hızını izler. Bu, bir numunede makromoleküllerin büyüklüğü ve şekli hakkında bilgi verir. Sedimantasyon hızı deneyleri böylece kromatin lif çözüm durum değişiklikleri incelemek için uygun bir araçtırkromatin yoğunlaşması 18 yapısı nedeniyle. Önemlisi, nucleosomal dizi sulandırma bir kalite kontrol adım olarak sedimantasyon hızı deneyleri kullanmak için ilk gerekli olan. DNA ve nükleozom uygun mol oranında birleştirilir değilseniz, diziler altında veya aşırı doymuş bir çekirdek histon sahip olabilir. Böylece, sedimantasyon hızının deneylerden elde edilen bilgiler, DNA uygun bir şekilde nükleozom ile doymuş olduğunu sağlamak için kullanılır. Bu, daha önce karakterize edilmemiş DNA şablonu ile çalışan, özellikle nükleozom ile DNA&#39;nın doygunluk tahmin etmek için alternatif yöntemler kullanmak önemlidir. Bu nedenle, daha da atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile nükleozomal dizilerin analizi için bir yöntem tarif eder. AFM sağlayan güçlü bir tekniktir bu doyma seviyesi, histon varyantlarının varlığı etkisi ya da MgCI2 19,20 etkileri gibi parametreler, bir dizi etkilerinin görselleştirilmesi. AFM da başvurunun olmuştured zaman atlamalı görüntüleme 21 kullanılarak nucleosome dinamiklerini incelemek için. In vitro onlar AFM görüntüleme 22 için doğru boyut aralığındaki ait çünkü nucleosomal 12-mer diziler AFM çalışmalara özellikle yatkındır toplandı. Bu çalışmada, bir kalite kontrol gibi (&quot;Görmek inanmaktır&quot;) AUC verileri onaylayan bir aracı olarak nucleosomal dizilerin AFM kullandık. Basit bir görselleştirme ek olarak, AFM ek bir ölçüt olarak numune yüksekliği profilleri ölçülmesini sağlar.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>A3648-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>21-152-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiLoad Superdex 200 16/60 Column</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-1069-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>VS2031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-667A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-0476-01 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XL-A/I Analytical Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning dna

Burada tekrar tekrar bir DNA molekülü boyunca aralıklı olan Çekirdek histon octamers nükleozomal dizileri olarak adlandırılır. Nükleozomal diziler iki yoldan birinde elde edilmiştir: in vivo kaynaklardan saflaştırılması, yeniden birleştirici ya da çekirdek histon in vitro olarak yeniden oluşum ve tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA. Bu ikinci yöntem daha bileşim bakımından düzenli montajı ve kesin bir konuma sahip nükleozomal dizisi için izin verme avantajına sahiptir. Bu santrifüj kuvveti altında çözelti içinden geçiş hızını analiz ederek makro moleküllerin büyüklüğü ve şekli ile ilgili analitik ultrasantrifüj verim bilgilerde sedimantasyon hızının deneyleri. Bu teknik, atomik kuvvet mikroskopisi ile birlikte, DNA şablonları çoğunluğu sulandırıldıktan sonra nükleozom doymuş olmasının sağlanması, kalite kontrol için kullanılabilir. Burada uzunluğu miligram miktarları yeniden yapılandırmak için gerekli ve bileşim açısından tarif d protokollerikromatin yapısı ve fonksiyonu biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için uygun efined nucleosomal diziler.

Protokolünü göstermek için biz 12 tandem 601 konumlandırma dizisine (601 207 x 12) 207 bp tekrarlarını kapsayan yeniden birleştirici Xenopus çekirdek histon ve DNA dizileri, nükleozomal yeniden. İlk liyofilize çekirdek histon ikinci yerel octamers monte edilmiş ve daha sonra bir S200 sütunu (Şekil 1A) kullanılarak FPLC ile octamers arıtıldı. Daha büyük kompleksler S200 kolonundan önce elüte. Histonlar genellikle bu sırayla Zehir: non-spesifik histon agrega, hi...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA at JoVE.com

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Bir yöntem olup, yeniden birleştirici çekirdek histon ikinci modeli nükleozomal dizilerin sulandırma ve tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA için sunulmuştur. Biz de analitik ultrasantrifüjdeki sedimantasyon hızı deneyleri, ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) hazırlandıktan sonra nucleosomal dizi doygunluk düzeyini izlemek için nasıl kullanıldığını açıklar.

Rekombinant çekirdek histon nükleozomal Diziler ve Nükleozom Konumlandırma DNA Meclisi

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

assembly-nucleosomal-arrays-from-recombinant-core-histones-nucleosome

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Cells and their Components

SCIENTISTS IN ACTION

22.4K Görüntüleme.  Colorado State University.  Bir yöntem olup, yeniden birleştirici çekirdek histon ikinci modeli nükleozomal dizilerin sulandırma ve tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA için sunulmuştur. Biz de analitik ultrasantrifüjdeki sedimantasyon hızı deneyleri, ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) hazırlandıktan sonra nucleosomal dizi doygunluk düzeyini izlemek için nasıl kullanıldığını açıklar. 

Video: Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Biyoloji

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Kurul, Yükleme ve Analitik ultrasantrifüjdeki Örnek Hücre Hizalama

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Multiplexed kemostat Diziler Tasarımı ve Kullanımı

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Prototip Minyatür Akış Sitometresi ve Companion mikroakışkan Karıştırma Teknoloji İndirimli-gravite Çevre Donanım Gösterileri

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...