이 작품은 NIH 보조금 GM45916 및 GM66834 JCH 및이 작품을 AK하는 국제 레트 증후군 재단의 화목에 의해 지원되었다는 NIH가 GM088409와 하워드 휴즈 의학 연구소에게 KL 공헌을 부여에 의해 지원되었다

1. Octamers 재조합 핵심 히스톤의 조립 이유 : 뉴 클레오 어레이 재구성의 첫 번째 단계는 동결 건조 된 재조합 코어 히스톤으로부터 네이티브 코어 히스톤 octamers을 제조하는 공정이다. 히스톤 단백질은 동일한 몰 양의 결합 버퍼를 재 접힘에 변성 버퍼 중 샘플을 투석에 의해 히스톤 octamers로 조립된다. <ol><li> 정화 (13)을 설명 된대로 (H2A, H2B, H3, H4) 재조합 핵심 히스톤을 냉동 건조. </li><li> 전개 버퍼 (6 M 구 아니 염산, 20 MM 트리스 산도 7.5, 5 mM의 DTT)의 3 ㎖에 각 동결 건조의 핵심 히스톤의 약 5 밀리그램을 녹입니다. 각 나누어지는 적어도 한 시간 동안 분해 할 수 있습니다. 어떤 단백질이 용기의 측면에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 참고로 전개 버퍼를 사용하여 276 nm에서 각 히스톤의 흡광도를 측정한다. </li><li> 그들의 흡광 계수를 사용하여 각 히스톤의 몰 농도를 계산한다 (표 1 참조 </st룽&gt; Xenopus의 히스톤 흡광 계수의 경우). 단백질의 대부분이 용해되면 동결 건조 중량 및 추정에 히스톤의 흡광도 결정된 농도를 비교한다. </li><li> 이 모든 히스톤에 대한 몰수의 제한 수있을 것입니다, 당신이 가장 적은 몰수이있는 히스톤 결정합니다. </li><li> 동일한 몰 양으로 히스톤을 결합하고 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 버퍼를 전개로 희석. </li><li> 6-8 kDa의 MWCO 투석 튜브에 샘플을 놓습니다. 튜브를 밀봉하고 차가운 폴딩 버퍼의 2 L에 배치 (2 M의 NaCl, 10 MM 트리스 산도 7.5, 1 ㎜ EDTA, 5 MM의 β-머 캅토 에탄올). </li><li> 교반하면서 4 ° C에서 18 시간 동안 샘플을 Dialyze. 확인 투석 튜브 자유롭게 적극적으로 회전 할 수있다, 또는 다른 히스톤이 침전하는 경우가 있습니다. </li><li> 두 번 18 시간 동안 (완료 될 때까지 즉, 매 6 시간에 대해 폴딩 버퍼를 변경)의 투석 버퍼를 변경합니다. 침전물이 형성된 경우에도 폐기하지수율이 감소 하겠지만 샘플 일부 옥타 머를 복구 할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 다음 일에 대한 열 평형을 준비하는 단계 2.1-2.2를 참조하십시오. 2. 크기 배제 크로마토 그래피로 정제하여 히스톤 Octamers 이유 : 섹션 1과 체결 한 후, 샘플 히스톤 octamers뿐만 아니라 집계, H3/H4의 테트라, 그리고 H2A/H2B 이량 체와 같은 다른 히스톤 복합체를 포함합니다. 히스톤 octamers 멀리 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)를 사용하여 다른 착물로부터 정제한다. <ol><li> HiLoad FPLC 시스템에 60분의 16 Superdex200 60분의 16 (S200) 열을 연결합니다. 기포가 시스템에 입력하지 않았는지 확인합니다. </li><li> 0.2 μm의 여과 물 S200 열을 청소합니다. 0.3 ㎖ / 분의 유속을 사용하여 0.5 ㎫의 배압 한도를 설정. 당신은 충분한 물이 있는지 확인하고, 열이 밤새 청소 할 수 있습니다. </li><li> F의 S200의 열 및 샘플 루프를 평형PLC는 버퍼를 사용하여 리 폴딩. 0.2 μm의 여과 폴딩 버퍼의 1 L를 사용합니다. / 분으로 1 ㎖의 비율로 약 2 시간 동안 0.5 MPa의 최대 압력에서 칼럼을 통해 완충액을 폴딩 흐름. </li><li> 리 폴딩 완충액을 1 ㎖로 원심 Vivaspin 농축기 (50 kDa의 MWCO)를 평형. 투석 튜브에서 샘플을 제거하고 침전물을 제거하기 위해 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기. 집중에 샘플 상층 액을 피펫. 약 500 μL의 부피로 샘플을 집중한다. </li><li> 새 컨테이너에 집중 옥타 머 샘플을 제거하고 1 ㎖는 버퍼를 재 접힘과 집중을 씻어. 500 μL에 린스를 집중하고, 옥타 머 샘플에 추가합니다. 이것은 집중에 남아있는 옥타 머를 구제하는 데 도움이됩니다. </li><li> 4 ℃에서 10,000 rpm에서 5 분 동안 1.5 ML의 미세 원심 분리 튜브에 샘플을 스핀 상층 액을 수집하고 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다. 이 FPL의 샘플을로드하기 전에 침전물을 제거하는 데 도움이C. </li><li> S200 칼럼 상에 샘플을로드합니다. 하나의 정제에 1.5 ㎖의 전체 볼륨 또는 15 밀리그램의 옥타 머의 최대로드합니다. </li><li> 갓 만든 리 폴딩 완충액을 사용하여 샘​​플을 용출. 1 ㎖ / 분의 유속 및 0.5 MPa의 배압 제한을 사용한다. 버퍼를 폴딩 두 열 볼륨 (400 ㎖)에 사용하고 2 ㎖ 분수를 수집합니다. 용출 동안 280 nm에서 흡광도를 모니터링합니다. 다른 종의 크기가 감소하는 순서로 용출됩니다. 히스톤 집계는 보통 약 84 ㎖ (그림 1)에서 약 45 ㎖, 옥타 약 65 ml로하고, 이량 체를 용출. </li><li> 18~20% SDS-PAGE에서 샘플을 실행하여 그 봉우리에서 용출 분수를 분석합니다. 정제 octamers을 포함하는 분획을 네 가지 핵심 히스톤 단백질의 동일 몰 양의 (그림 1)이 있어야합니다. </li><li> 정제 octamers를 포함하는 분수 수영장, Vivaspin 원심 필터를 15 ㎎ / ㎖를 ≤에 집중한다. 희석을두면, octamers는 끊을 수 있습니다 In을 H2A/H2B 이합체와 H3/H4의 사량. </li><li> 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 옥타 머의 농도를 측정하고 표 1에서 흡광 계수를 사용하여 계산한다. </li><li> 히스톤 octamers 4 ℃에서 접힘 버퍼에 짧은 기간 유지 될 수있다 장기적으로 저장되는 경우, octamers는 -20 ° C에서와 50 % 글리세롤 용액에 더 안정 될 것입니다. 글리세롤에 저장 Octamers 흡광도 측정 전에 신선한 폴딩 버퍼에 투석과 뉴 클레오 배열 reconstitutions에 사용되어야한다. </li></ol> 3. DNA에서 뉴 클레오 배열 및 정화 Octamers의 재구성 이유 : 뉴 클레오 배열에서 재구성 히스톤 octamers 및 템플릿 DNA가 특정의 몰 비율로 결​​합해야합니다. 2 M 염화나트륨의 DNA와 히스톤 octamers의 혼합물은 이온 강도가 감소하는 버퍼에 투석 단계입니다. 낮은 소금에 점차적 인 변화는 적절한 뉴 클레오 솜 형성을 보장합니다. N 얻기템플릿 DNA의 히스톤 옥타 머 포화 원하는 수준 ucleosomal 배열은 대규모 예비 재구성 다음에 작은 규모의 시험 reconstitutions가 필요합니다. 작은 규모의 reconstitutions에 의해 정의 된 적절한 조건은 예비 재구성을 안내하는 데 사용됩니다. <ol><li> 4,12 바와 같이 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치 DNA를 정제 하였다. 간단히, Qiagen 사 GigaPrep 키트 또는 유사한 제품을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리. 셋업 제한 효소 템플릿 DNA를 분리하고 작은 크기 (≤의 약 700 bp)의 플라스미드 DNA를 소화하기 위해 소화를. 템플릿 DNA는 멀리 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)를 사용하여 작은 플라스미드 DNA 잔재로부터 정제 할 수있다. 중력이 세파 크릴 S-1000의 구슬로 포장 약 115 cm의 높이, 열 공급은 601 207bp X 12mer의 DNA의 정화에 충분하다. </li></ol> 참고 : 플라스미드 DNA의 감소 비용으로 정화하지만, 증가 EFF를 위해ORT, 하나는 E.부터 플라스미드 DNA를 분리하기 위해, 페놀 / 클로로포름 DNA 정제하여 알칼리 용해를 사용 대장균 (23, 24). 플라스미드 DNA의 주형 DNA를 분리하기위한 전략 템플릿 DNA의 크기의 변화에​​ 따라 달라질 수 있습니다. 삼성 전자의 경우는 제한 효소 템플릿 및 플라스미드 DNA 사이의 크기의 차이를 최대화하는 방식으로 소화를 설정하는 것이 중요합니다. <ol start="2"><li> 몰비 (R)은 reconstitutions에 사용할 판별. r은 반복의 DNA 몰에 옥타 머의 몰 비율이 동일하다. 의도가 포화 뉴 클레오 배열을 취득하는 경우 초기 작은 규모의 실험을 위해, 0.9, 1, 1.1의 R 값이 적합합니다. </li><li> 테스트 할 각각의 몰비 약 18 μg의 DNA에 추가 옥타 머의 양을 계산함으로써 소규모의 샘플을 준비한다. DNA와 히스톤 octamers을 섞는다. 샘플의 NaCl의 최종 농도는 2 ≥ M을, 그리고 D의 최종 농도되어야NA는 약 0.3 ㎍ / ㎕를해야한다. 최종 샘플 버퍼 조건은 10​​ MM 트리스 산도 7.8, 1 mM의 EDTA를 포함해야합니다. </li><li> 샘플은 현재 투석을위한 준비가되어 있습니다. 12K-14K MWCO 투석 튜브에 샘플을로드합니다. 다음과 같이 이온 강도가 감소하는 버퍼의 2L에 대해 샘플을 Dialyze. </li></ol> 10 MM 트리스 산도 7.8, 1 ㎜ EDTA : 모든 버퍼의 구성 요소. 버퍼 1 ~ 6 시​​간 동안 (1 M의 NaCl, 1 mM의 DTT 추가). 버퍼 2 하룻밤 (825 M의 NaCl, 1 mM의 DTT 추가). 버퍼 3 ~ 6 시​​간 동안 (2.5 밀리미터의 NaCl, 1 mM의 DTT 추가). 버퍼 4 하룻밤 (2.5 mM의 염화나트륨, 0.1 ㎜ PMSF 추가). <ol start="5"><li> 투석 튜브에서 샘플을 제거하고 섹션 4-6를 진행합니다. 소량의 샘플은 원하는 결과를 산출하는 경우, 대규모 섹션 3-6의 단계를 반복한다. </li></ol> 주 : 자원을 보존하기 위해, 소규모 샘플 하류 스크리닝 분석법을 위해 충분하기 위해 필요한 최소 체적을 가져야한다. E가하기 위해서는계속하지 0.3 ㎎ / ㎖ DNA에 여기에 나열된 침강 속도와 AFM 실험, 50 ㎕의 샘플에 대한 샘플이 적합합니다. 큰 규모의 크기는, 분취 샘플들은 의도 된 사용에 의존한다. 대규모 샘플은 작은 규모의 샘플과 동일한 방식으로 제조한다. 4. 재구성 된 뉴 클레오 배열의 침강 속도 분석 이유 : 용액에서 분자의 크기와 모양에 베크 XL-A / I 분석 초원 심 분리기 수익률 정보에 침강 속도 실험. 저염 조건에서 수행 침강 속도 실험을 재구성 배열이 뉴 클레오으로 포화되는 범위를 결정하는 데 사용됩니다. <ol><li> TEN 버퍼 (10 MM 트리스 산도 7.8, 1 ㎜ EDTA, 2.5 mM의 염화나트륨)를 사용하여 260 nm에서 0.5 정도 흡수에 샘플을 희석. 한쪽 샘플과 referen으로, 두 부문 중심으로 셀에 시료 400 μl를로드다른 25 CE (TEN 버퍼). (즉, 420 ㎕를 참조 솔루션을 추가) 샘플 메 니스 커스 (meniscus)보다 더 높은 기준 메 니스 커스 (meniscus)를 유지합니다. </li><li> 로터에 세포를 넣고 적절히 세포와 로터 (25)의 하단에 해시 마크를 이용하여 셀을 정렬. 부드럽게 압축 공기를 이용하여 세포의 렌즈 먼지. </li><li> , XL-A/XL-I 원심 분리기에 돌려 로터를 삽입하고, 연결하고 사용 설명서에 설명 된 바와 같이, 광학 장치를 고정합니다. 새로운 : 프로테옴 연구소 소프트웨어 선택 파일을 엽니 다. </li><li> 3,000 rpm으로 25 ℃의 온도에서 단일 스캔 실행을 설정 옵션에서 선택 마지막 스캔 후 중지 및 실행 반경 보정 (로터가 AUC에 사용 된 마지막 회 인 경우 반경 보정이 필요하지 않습니다). </li><li> 각 셀의 경우, 샘플의 이름을 파장 (260 나노 미터)을 선택, 흡광도를 선택하고 컴퓨터에서 파일을 저장할 위치를 선택합니다. 단일 스캔 실행을 시작합니다. </li><li> 적절한 RA를 결정하는 하나의 스캔을 사용하여스캔 길이 (그림 2A)를 다이얼. 스캔 할 셀의 길이를 줄이면 실행 시간을 감소시킵니다. 그러나, 샘플 메 니스 커스 (meniscus)를 포함하고 매우 가깝거나 셀의 하단에 끝을 확장해야합니다. </li></ol> 참고 : 싱글 스캔이 측정 영역은 단지 샘플 메 니스 커스 (도 2A) 전에 시작하여 측정 줄어드는 것을 허용한다. AUC를 실행하는 동안 생성 된 검사의 대부분은 메 니스 커스 (meniscus)뿐만 아니라 안정적인 고원 (그림 2B) 지난 경계 분수가 있어야합니다. AUC 세포에 더러운 렌즈가 큰 스파이크 스캔을 생성 할 수있는 데이터의 분석에 영향을 미칠 수있다. 기능 UltraScan 소프트웨어는 분석 초 원심 데이터 (26)의 분석에 관한 정보를위한 좋은 자원이다 설명서가 포함되어 있습니다. <ol start="7"><li> XL-A/XL-I 제어 패널을 사용하여, 0의 속도와 키를 눌러 시동을 입력합니다. 이 진공을 모두 끌어 원심 분리기 챔버를 묻는 메시지가 표시됩니다아야 챔버의 온도는 평형. 실행을 시작하기 전에 온도 평형 수 있도록 1 시간을 기다립니다. </li><li> 원하는 속도 및 스캔의 수에 대한 실행까지를 설정하는 소프트웨어를 사용합니다. 높은 속도는 해상도를 증가하지만, 샘플 셀의 바닥에 침전되기 전에 하나는 적어도 20 스캔 (바람직하게는 그 이상)를 수집한다. 그것은 실행의 진행 상황을 모니터링하고 누출 세포와 같은 잠재적 인 문제를 확인하기 위해 (옵션 메뉴에서 수행) 지난 몇 검사를 오버레이하는 것이 편리하다. 올바른 작동을 보장하기 위해 검사의 첫 번째 커플을 모니터링합니다. </li></ol> 5. 침강 속도 데이터를 편집 및 분석 이유 : 원시 침강 속도 데이터는 확산 보정 침강 계수 분포를 산출 프로그램에 의해 분석한다. 차례로이 정보는 관련 포화 레벨을 포함하는 재구성 된 샘플의 일부를 나타내고, 예를 들면 </EM&gt; 12 메르 DNA 템플릿을 사용하는 경우는 10, 11, 12 뉴 클레오 / DNA를 가지고 재구성 된 배열의 분획을 결정할 수있을 것이다. <ol><li> 데이터 26 편집 등의 UltraScan로 AUC 데이터 분석 소프트웨어를 사용합니다. 스캔 데이터의 편집은 각각의 셀에 대해 수행 및 후속 분석을위한 데이터 세트를 생성해야합니다. 스캔의 적절한 편집, 샘플 메 니스 커스를 정의하는 관심 영역에 데이터를 감소시키고 기준뿐만 아니라 고원 영역 (도 2)를 정의하는 것을 포함한다. 원하지 않는 스캔의이 시점에서 데이터 세트로부터 제거 될 수있다. 이 분석에서 불필요한 검사를 제거하는 것이 가능하기 때문에, 그것은 모든 스캔이이 시점에서 유지하는 것을 추천합니다. </li><li> 우리는 강력하게 강화 된 반 Holde-Weischet 방법은 데이터 27를 분석하는 데 사용하는 것이 좋습니다. 이 분석 방법은 런의 과정을 통해 확산의 효과를 보정하고, 침강 계수의 적분 분포를 산출한다. 특히, 강화 된 반 Holde-Weischet 방법 (의 UltraScan에서 구현) 안정 고원 부족, 또는 분석 (28)에 메 니스 커스 (meniscus)을 삭제하지 않은 경계 분수를 포함하는 검사의 포함을 허용합니다. </li><li> 조립 배열의 침강 계수의 분포를 결정합니다. 601-12 (207bp, 12 메르) 뉴 클레오 배열의 대표 결과는 그림 3에 나와 있습니다. </li><li> 작은 규모의 샘플 중 하나가 침강 계수의 원하는 범위의 배열이 포함되는 경우, 제 3 항부터 증가 규모 과정을 반복합니다. 작은 규모의 샘플 중에 침강 계수의 적절한 분배가없는 경우 다음 섹션 3에서 시작하는 새로운 연구 범위와 작은 규모의 테스트를 반복합니다. </li></ol> 6. 원자 힘 현미경을 사용하여 뉴 클레오 배열을 시각화 (AFM) 이유 : AFM은 수 nucleosoma의 포화 수준의 시각화L 배열. 이 기술은 품질 관리 분석으로 AUC 및 제한 효소 소화에 의한 침강 속도를 보완한다. <ol><li> 전술 한 방법을 사용하여, 잘 포화 뉴 클레오 어레이 (도 5a)을 얻었다. </li><li> 준비 APTES가 배치하여 운모 슬라이드를 처리 ~ 30 ㎕를 30 분 동안 0.22 μm의 여과 nanopure 물에 상용 (시그마 - 알드리치 (3 - 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란의 A3648-100ML)의 1:1,000 희석. </li><li> 30 분 후 여과 물 APTES를 씻어 부드럽게 질소 흐름을 건조. </li><li> 슬라이드에 적절히 희석 뉴 클레오 배열 샘플 (~ 1.5 NG / μL)를 놓고 15 분 동안 실온에서 해당 품어. </li><li> 필터링 된 샘플 버퍼와 오프 샘플링 이전 건조하고, AFM (이 경우 정신 병원 연구 MFP - 3D 원자 힘 현미경)의 무대에 장소 슬라이드 씻어. </li><li> 512 스캔 라인을 2 × 2 μm의 스캔 이미징에 의해 시작합니다. SA의 수준을 확인하는 뉴 클레오 솜의 수를 계산turation (그림 5B). </li><li> 이상적으로해야 잘 분리 된 뉴 클레오 배열과 슬라이드 이미지 영역. </li><li> 높은 해상도 이미지의 경우 500 × 500 nm의 스캔 (그림 5C)를 얻을 수있다. </li><li> 이미지는 평탄화 및 정신 병원에서 제공 MFP-3D 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수있다. </li><li> 각각의 이미지는 네 개의 사분면으로 나누어 뉴 클레오 (그림 5C, 오른쪽 패널 높이 추적에 대해받은 배열과 높이 프로파일을 그릴 수있는 잘 분리 배열과 여러 무료 손으로 라인을 명확하게보기를 얻기 위해 디지털 방식으로 확대 할 수 있습니다 및 (d)). </li><li> 몇몇 그러한 이미지는 뉴 클레오 수백 포괄 어레이의 각 유형에 대해 분석한다. 높이 프로파일은, 기록 분류 및 MS Excel에서 그려집니다. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+peptide+ligation+strategy+for+deciphering+nucleosomal+histone+modifications.">A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).</li><li>Lu, X., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+H3K79+dimethylation+and+H4K20+trimethylation+on+nucleosome+and+chromatin+structure.">The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).</li><li>Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation+for+the+Analysis+of+Chromatin+Structure.">Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure.</a> Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).</li><li>Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+and+agarose+gel+electrophoresis+as+tools+for+studying+chromatin+folding+in+solution.">Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution.</a> Methods. 12 (1), 62-72 (1997).</li><li>Montel, F., Menoni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+individual+nucleosomes+controls+the+chromatin+condensation+pathway:+direct+atomic+force+microscopy+visualization+of+variant+chromatin.">The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin.</a> Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).</li><li>Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+region+of+macroH2A+promotes+self-association+of+nucleosomal+arrays.">The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).</li><li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+nucleosomes+revealed+by+time-lapse+atomic+force+microscopy.">Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).</li><li>Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+atomic+force+microscopy+to+study+chromatin+structure+and+nucleosome+remodeling.">Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling.</a> Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).</li><li>Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).</li><li>Demeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UltraScan:+a+comprehensive+data+analysis+software+package+for+analytical+ultracentrifugation+experiments.">UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments.</a> Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).</li><li>Holde, K. V., Weischet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+analysis+of+sedimentation+velocity+experiments+with+monodisperse+and+paucidisperse+solutes.">Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes.</a> Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).</li><li>Demeler, B., van Holde, K. 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Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosome+surface+regulates+chromatin+compaction+and+couples+it+with+transcriptional+repression.">The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+arrays+reveal+the+two-start+organization+of+the+chromatin+fiber.">Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber.</a> Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).</li><li>Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Short+nucleosome+repeats+impose+rotational+modulations+on+chromatin+fibre+folding.">a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding.</a> The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).</li><li>Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Silent+Information+Regulator+3+Protein+,+SIR3p+,+Binds+to+Chromatin+Fibers+and+Assembles+a+Hypercondensed+Chromatin+Architecture+in+the+Presence+of+Salt.">The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).</li><li>Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+tetranucleosome+and+its+implications+for+the+chromatin+fibre.">X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre.</a> Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).</li><li>Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+histone+variant+H2A.Z+regulates+the+equilibrium+between+different+chromatin+conformational+states.">The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states.</a> Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).</li><li>Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linker+histones+stabilize+the+intrinsic+salt-dependent+folding+of+nucleosomal+arrays:+mechanistic+ramifications+for+higher-order+chromatin+folding.">Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding.</a> Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).</li><li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+&amp;#34;30+nm&amp;#34;+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone.">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &amp;#34;30 nm&amp;#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+fiber+folding:+requirement+for+the+histone+H4+N-terminal+tail.">Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail.</a> J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).</li><li>Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+chromatin+folding+patterns+in+chicken+erythrocytes+by+atomic+force+microscopy+(AFM.">Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM.</a> Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).</li></ol>

저자는 이익의 충돌이 없습니다.

모델 뉴 클레오 어레이는 염색질 구조와 기능의 시험 관내 연구에 매우 유용한 도구이다. 예를 들어, 널리 용액 30-34에서 염색질 섬유 축합 메카니즘을 연구하는 데 사용하고, 그것이 가능 tetranucleosome (35)의 x-선 구조를 구하는되었습니다. 최근에 그들은 특정 핵심 히스톤 변형, 돌연변이 전사 후 수정 14-16,36의 구조적 효과를 해독에 유용 입증했다. 여기에서 우리는 ...

진핵 생물의 게놈은 벌거 벗은 DNA가 존재하지 않고, 압축 및 결합 단백질에 의해 구성됩니다. DNA와 단백질의이 단지는 염색질로 알려져 있습니다. 염색질의 기본 반복 단위는 뉴 클레오입니다. 뉴 클레오 히스톤 옥타 약 1.6 배 1 옥타 머 히스톤 주위에 감싸 인 DNA의 146 개의 염기쌍으로 구성되어 있습니다. 히스톤 옥타는 두 개의 복사본 핵심 히스톤의 H2A, H2B, H3, H4와 각각 구성되어있다. 반복적 DNA 분자를 따라 간격이 핵심 히스톤 octamers는 뉴 클레오 배열이라고합니다. 뉴 클레오 배열의 확장 구조는 구조 &quot;문자열에 구슬&quot;10 나노 섬유 또는로하고, 저 염분의 조건 2에서 체외에 존재하고있다. 10 ㎚ 섬유는 배열 내부 압축 및 / 또는 인터 - 배열 올리고머 (2)를 통해 고차 구조로 집광 할 수있다. 이러한 고차 구조, 염의 존재하에 유발 될 수있다또는 뉴 클레오 배열 3,4에 염색질 건축 단백질의 결합을 통해 영향을받을 수있다. 염색질 압축의 수준은 반비례 생체 5,6의 전사 율과 상관된다. 최근의 연구는 분화, 암 발생 및 기타 7,8 같은 공정에서 게놈의 조직 구조의 중요성을 강조한다. 염색질의 구조와 기능을 연구하는 뉴 클레오 배열의 사용은 널리되고있다. 여기에서 우리는 재조합 핵심 히스톤과 뉴 클레오 솜 위치의 DNA에서 뉴 클레오 배열의 조립하는 방법을 설명합니다. 뉴 클레오 솜 위치 시퀀스의 탠덤 반복으로 재조합 DNA를 사용하여 정기적으로 간격 뉴 클레오를 포함하는 배열을 재구성 할 수 있습니다. 더 인기있는 위치 시퀀스의 두 5S rRNA 유전자 서열과 &quot;601&quot;시퀀스 9,10입니다. (601) 순서는 SELEX 실험 및 MOR에서 파생 된전자 강하게 5S 순서 11 이상의 뉴 클레오을 배치합니다. 따라서, (601) 어레이의 링커 DNA 길이는 더 균일하다. Tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치 DNA는 겔 여과 4,12함으로써 얻어진다. 재조합 히스톤은 E.에서 정제된다 변성 조건 13 세 미만 대장균. 재조합 히스톤의 사용은 하나의 정중 뉴 클레오 배열 히스톤 조성물을 제어 할 수있다. 예를 들어, 코어 (15, 16)은 야생형 코어 히스톤 대체 할 수있는 특정 변이 (14) 또는 번역 후 변형을 담지 히스톤. 침강 속도 실험인가 원심력 17 세 미만 용액에 고분자의 침전 속도를 모니터링 할 수 있습니다. 이것은 샘플에서 거대 분자의 크기와 형태에 대한 정보를 산출한다. 침강 속도 실험 따라서 염색질 섬유 용액 상태의 변경 사항을 공부에 적합한 도구입니다크로 마틴 응축 18에 의한 구조. 중요한 것은 뉴 클레오 배열 재구성의 품질 관리 단계로서 침강 속도 실험을 사용하는 것이 우선 필요하다. DNA와 뉴 클레오는 적절한 몰비 결합하지 않는 경우, 배열 또는 과다 포화 핵심 히스톤있을 수 있습니다. 따라서, 침강 속도 실험으로부터 얻은 정보는 DNA가 적절히 뉴 클레오로 포화되는 것을 보장하기 위해 사용된다. 그것은 이전에 uncharacterized DNA 템플릿 작업 특히, 뉴 클레오와 DNA의 채도를 추정하는 다른 방법을 사용하는 것이 중요합니다. 그러므로, 우리는 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 뉴 클레오 어레이 분석 방법을 설명한다. AFM은 수있는 강력한 기술이다 같은 포화 레벨, 히스톤 변형의 존재의 효과 또는 MgCl2를 19, 20의 효과와 같은 매개 변수의 개수의 효과를 가시화. AFM은 응용하고있다ED는 시간 경과 영상 (21)를 사용하여 뉴 클레오 역학을 연구한다. 시험관들이 AFM 이미징 22 적당한 크기의 범위에 속하기 때문에 뉴 클레오 12 메르 배열 AFM 연구에 특히 의무가 있습니다 조립. 본 연구에서 우리는 품질 관리뿐만 아니라 ( &quot;보는 것이 믿는 것&quot;) AUC의 데이터를 긍정하는 수단으로 뉴 클레오 배열의 AFM을 사용했습니다. 간단한 시각화 외에도, AFM은 추가적인 메트릭과 같은 샘플의 높이 프로파일의 측정을 허용한다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>A3648-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>21-152-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiLoad Superdex 200 16/60 Column</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-1069-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>VS2031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-667A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-0476-01 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XL-A/I Analytical Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning dna

반복적 DNA 분자를 따라 간격이 핵심 히스톤 octamers는 뉴 클레오 배열이라고합니다. 뉴 클레오 배열은 두 가지 방법 중 하나를 얻을 수있다 : 생체 소스의 정제, 또는 재조합 핵심 히스톤에서 체외에서 재구성 및 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치의 DNA. 후자의 방법은보다 구조적으로 균일 한 조립 및 정밀 위치 뉴 클레오 배열을 허용하는 이점을 갖고있다. 그들이 원심력 하에서 용액을 통해 이주하는 비율을 분석함으로써 고분자의 크기 및 형상에 대한 분석 초 원심 수율 정보에 침강 속도 실험. 이 기술은, 원자력 현미경과 함께 DNA 템플릿의 대다수는 재구성 후 뉴 클레오로 포화되는 것을 보장하는, 품질 관리에 사용될 수있다. 여기에서 우리는 길이 밀리그램 수량을 재구성 할 필요가 조성이 D 프로토콜을 설명염색질의 구조와 기능의 생화학 및 생물 물리학 연구에 적합한 efined 뉴 클레오 배열.

프로토콜을 설명하기 위해 우리는 12 직렬의 601 위치 시퀀스 (601 207 × 12)의 207 bp의 반복으로 이루어진 재조합 Xenopus의 핵심 히스톤과 DNA에서 뉴 클레오 배열을 재구성. 우리는 먼저 동결 건조의 핵심 히스톤에서 네이티브 octamers을 조립 한 후 S200 열 (그림 1A)를 사용하여 FPLC에 의해 octamers을 정제. 큰 단지는 S200 열에서 이전 용출. 히스톤은 일반적으로 다음 순서로 용출 :...

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Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

방법은 재조합 핵심 히스톤에서 모델 뉴 클레오 어레이의 재구성 및 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치의 DNA에 표시됩니다. 또한 분석에서 초 원심 침강 속도 실험, 및 원자 힘 현미경 (AFM)을 재구성 후의 뉴 클레오 배열 포화 정도를 모니터링하는 데 사용되는 방법을 설명한다.

재조합 핵심 히스톤에서 뉴 클레오 배열과 뉴 클레오 솜 위치 DNA의 조립

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

assembly-nucleosomal-arrays-from-recombinant-core-histones-nucleosome

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Cells and their Components

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22.4K 조회수.  Colorado State University.  방법은 재조합 핵심 히스톤에서 모델 뉴 클레오 어레이의 재구성 및 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치의 DNA에 표시됩니다. 또한 분석에서 초 원심 침강 속도 실험, 및 원자 힘 현미경 (AFM)을 재구성 후의 뉴 클레오 배열 포화 정도를 모니터링하는 데 사용되는 방법을 설명한다. 

비디오: Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

마우스 뒷면에서 게놈 DNA의 분리

연구

생물학

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

조립, 로딩 및 분석 초원 심 분리기 샘플 셀 정렬

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

다중 Chemostat 배열의 설계 및 사용

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

에서 펩타이드 및 단백질과 재조합 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 및 그 융해의 비 크로마토 그래피 정제<em&gt; 대장균</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...