Bu iş için finansman R. Lim ve AJ Camp bir Garnett Passe ve Rodney Williams Memorial Foundation Projesi hibe tarafından sağlandı.

1. Hayvanlar <ol><li> Fareler Avustralya Kemirgen Merkezi (ARC, Perth, Avustralya) elde edildi ve çevresel zenginleştirme ile normal 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü Sidney Bosch Hayvan Tesisi Üniversitesi&#39;nde düzenledi. Tanımlanan tüm deneyler Sidney Hayvan Etik Kurul Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. </li><li> Erkek ve dişi fareler (C57/BL6) bu gerginlik yaygın genetik manipülasyon için arka planı olarak kullanılır çünkü tüm deneyler için kullanıldı ve 8-9 vahşi-tipe eşdeğer kabul edilebilir. </li></ol> 2. Doku Hazırlanması <ol><li> 26 NaHCO3, 11 glukoz, 250, gliserol, 2,5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 1.2, MgCl2, ve 2.5 CaCI2: oluşan bir gliserol bazlı yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) (mM olarak) 300 ml hazırlayın. CaCl2 ilavesinden önce, karbojen gazı (% 95 O2 ve% 5 CO2) ile çözüm AP kurmak7.4 H ve önlemek kalsiyum yağış (bulutluluk). Bir buz bulamaç oluşmuştur, böylece, 45 dakika boyunca -80 ° C dondurucu içinde çözelti dondurun. </li><li> Derin bir içi-periton enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg / kg) (Parnell, İskenderiye, Avustralya) ile fareler uyuşturan. </li><li> Bir kez arka-bacak tutam refleksleri keskin paslanmaz çelik makas kullanarak yok başını kesmek fareler ve kafatası ortaya çıkarmak için bir jilet (# 22 yuvarlak) kullanarak sagital cilt kesi yapmak. Bu noktada ve adımları 2,3-2,8 boyunca kafatası, beyin, ve temel vestibüler cihaz doku üzerinde buz ACSF düzenli uygulama mümkün olduğunca serin tutulmalıdır. </li><li> Standart desen makas sivri kolu (FST, Kuzey Vancouver, Kanada) kullanılarak Lambda de kafatasında küçük bir kesi yapmak ve sagital sütür boyunca kesilir. Beynin bu adımı sırasında kesme bıçağı ile &quot;sürüklenen&quot; olmadığından emin olun. </li><li> Dikkatlice yanal parietal kemik ve oksipital kemik postero kabuğurly sığ viraj Pearson rongeurs (FST) kullanarak. </li><li> Küçük bir paslanmaz çelik spatula yavaşça orta ve posterior kranial fossa yüzeyinden beyin kaldırmak için kullanılan ve maruz vestibulocochlea sinir (CNVIII) iç kulak ve ince iris bir makas ile beyin sapı arasında yarı yolda kesilir. Bu sinir kesme saç hücreleri ile birincil afferentleri ve bağlantılarının akson üzerinde aşırı gerginlik en aza indirir. </li><li> CN VIII transeksiyonu takiben beyin toto uzaklaştırılmaktadır. </li><li> Vestibüler labirent koklea anteromediale işaret ile, şimdi orta kranial fossada açıkça görülebilir. Hafifçe ön semisirküler kanal kavrama ve yanal çekerek eksize önce vestibüler labirent her iki tarafında RONGEUR. </li><li> Bölüm 2.1 &#39;de açıklanan buz gibi, sürekli gaz verilerek ACSF içeren bir diseksiyon çanak çıkarıldı labirentler (Şekil 1) bırakın. Bir stereomikroskopta altında, labirent tutunkoklea kavrayarak çanak taban. Ön semisirküler kanal ampulla örten kemik uzakta kazımak için ince forseps kullanın. Kemik küçük bir delik elde uzak bir kez Ampulla gelen kemik fiske başlar. Dikkat Bu temel membranöz labirent ve duyusal epitel zarar verebilir gibi kemik ile forseps itmek için değil alınmalıdır. Ön ve komşu yatay yarım daire membran kanalları ve ampullae hem (Şekil 2) maruz kalan kadar bu işleme devam edin. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> Şekil 1. İzole fare vestibüler labirent. A. Sol panel) izole fare vestibüler labirent şematik. Vestibüler duyu epitel erişim için referans önemli noktaları, salyangoz, ön ve yatay semisirküler kanallar laboratuarıeLED. Yıldız vestibüler duyu epitel içeren semisirküler kanal ampulla göstermektedir. B. 1 aylık fareden izole vestibüler labirent sağ panel) photomicrograph. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> Şekil 2. Membranöz vestibüler labirent maruz kalması. Anterior ve yatay semisirküler kanal ampullae örten kemik siyah / kahverengi benekli membranöz ampullae ve ilgili ampuller sinirler (CNVIII) ortaya çıkarmak için çizilmiş. Alt panelinde şematik fotomikrografisine vurgulanan bölgedeki yapıların temsil eder ve ampullae ve CNVIII için semisirküler kanal kanalların ilişkiyi gösterir. <ol start="10"><li> Ince forseps kullanarak, yavaşça sağlanması, kemik labirent uzak ampullae ve ilgili kırbacık kaldırdıklarını ampullae merkez bölgesi (contaduyusal epitel) ining zarar değildir. Bazı durumlarda yarım daire membranöz kanal proksimalinde kemikten ampullae serbest bırakmak için iris makası ile kesmek gerekebilir. </li><li> Leibovitz L-15 kültür ortamı (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ile dolu bir Petri kabı içine iki ampullae ve kırbacık içeren üçlü aktarın. &quot;Arka&quot; dokuya optik bir fiber kullanın. Bu ampullae içinde duyusal epitel içeren kristanın açık görselleştirme sağlar. </li><li> Dikkatlice ince iris makas ile kırbacık en benekli &quot;çatı&quot; bir kesi yapmak. Ön çatısı ve daha sonra yatay ampülleri ile bu kesi devam edin. Bu (Şekil 3A) irtibat kurmadan mümkün olduğunca duyu epitel kenarına yakın kesi yapmak. Duyusal epitel örten zarın hiçbir parça (Şekil 3B) olmadığından emin olun </li><li> Küçük bir cam ile izole yarı sağlam hazırlanması aktarmas dipli kayıt odasına L-15 medya ile dolu. Düzleştirilmiş bir U-şekilli platin tel (Şekil 3B) sabitlenmiş ince naylon liflerden oluşan bir ızgara kullanarak hazırlanması aşağı tartılır. İdeal olarak, kılavuz teller duyusal epitel örter gerekir, ancak daha yüksek stabilite gerekli olduğu bazı durumlarda, belki de tercih duyu epitel kesilmesiyle tek bir fiber. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> Şekil 3,. Yarı sağlam hazırlık ve elektrot yapılandırma vestibüler duyu epitel. A. şematik temsil izole yarı sağlam hazırlık. Crista örten ampulla duyusal epitel (yeşil) yüzeyine ortaya çıkarmak için &quot;de-çatılı&quot; olmuştur. Anterior (AC) ve yatay (hc) crista (kırbacık gösteren yarı sağlam &#39;üçlü&#39; hazırlık B. photomicrograph olmak gizlenmiş) ac arka. Kayıt odasının tabanına hazırlanması sabitlemek için kullanılan naylon elyaf edin. Ölçek çubuğu:. 100 mikron C. bireysel vestibüler saç hücre yerleştirilmiş bir kayıt elektrot. Ölçek çubuğu: 15 mikron. 3. Elektrofizyoloji <ol><li> Sürekli oksijenli L-15 ortamı ile yarı sağlam hazırlanması serpmek. Medya kayıtları boyunca izlenmelidir ortamın pH göstergesi (fenol kırmızı) ve renk içerir. Oksijen ile pH 7.3-7.4 olacak ve kırmızı bir renk uygun olmalıdır. </li><li> Bir elde etmek için bir mikropipet çektirmesi (model PP-830 Narishige, Japonya,) üzerinde:,: iki aşamalı bir protokol (50 ve ısı adım 2 72 ısı adım 1) ile 1.5 mm (1.19 mm ID) borosilikat cam kayıt pipetler hazırlayın MQ 3-4 nihai empedansı. </li><li> MgCl2 (mM olarak) 110 KF, 12 KCI, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 mM EGTA, 1.8 içeren bir potasyum flüorür temelli bir iç çözelti 3-4 mm olan pipet şaft doldurun3. D-glikoz, ve 2 Na-ATP, KOH ile pH 7.4. </li><li> Kadar aşağı elektrot izole ve pipet kapasitans azaltmak için parafilm ince bir şerit ile mümkün olduğunca ucu pipet 2-3 kez sap sarın ve. </li><li> Dik bir mikroskop (Olympus BX51) düşük güç büyütme (5X) altında duyu epitel üzerinde pipet yerleştirin. Yüksek güç (40X) geçin ve bağlı bir CCD kamera ile tek tek vestibüler saç hücrelerinin görselleştirmek. </li><li> Bir micromanipulator (Sutter Instruments, California, ABD) kullanılarak bir görsel saç hücresi (Şekil 3C) ve membran pozisyon pipet. Bir gigaohm sızdırmazlık elde edilir, kopma pipet tutucu bir emiş ağzı yoluyla uygulanan bir negatif basınç küçük bir miktarı ile hücre zarı. </li><li> Standart teknikler kullanılarak 8-9 tam hücre voltaj sıkıştırma kayıtları yapın. </li></ol> 4. İki foton Mikroskopi <ol><li> 5 mM Oregon Yeşil içeren% 0.9 serum fizyolojik hazırlayın488 BAPTA-1 (OGB-1; hexapotassium bir tuzu; Invitrogen, Almanya). </li><li> Duyusal epitel yukarıdan engelsiz sağlamak; hala batık ise, filtre kağıdı küçük bir parça (Millipore, Almanya 4X4 mm, kalın 0.8 mikron) üzerine &quot;de çatılı&quot; yarı-sağlam üçlü hazırlık yerleştirin. </li><li> Sentetik kalsiyum 5 mM&#39;lik bir çözeltisi bir başka 5 ul ile filtre kağıdı ve hazırlık bir puls jeneratörü ve bir geniş-bant amplifikatörünün kombinasyonundan oluşan bir Electroporator arasında tuzlu su kaplı taban platin elektrot (7 ul) üzerine ve kapağın aktarma Gösterge boya Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 (Şekil 4). </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> Şekil 4. Toplu elektroporasyon. A. elektroporasyon yapılandırmasının şematik bir enine kesitini göstermektedir. Yarı sağlam hazırlanması (*) kalsiyum DY batırılır filtre kağıdına yerleştirilirE (Oregon Green 488 BAPTA-1) ve akım 2 platin elektrot arasında uygulanmaktadır. Briggman ve Euler 2011 10 uyarlanmıştır. <ol start="4"><li> Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 çözümü yapılır ile irtibata geçtiğinizde hazırlanması yönünü bozmak için dikkatli olmak, yaklaşık 2 mm bir mesafede taban elektrot ile üst platin elektrot paralel getirin. </li><li> 10-11; hazırlanması (+13 V, 10 msn darbe genişliği, 1 Hz frekans, 10 kare dalga darbe akım için Parametreler) arasında kısa bir akım darbe Min. </li><li> L-15 ortamı ile doldurulmuş bir dipli cam kayıt odasının alt kısmında, yine duyu epitel yukarıda engelsiz olması sağlanmış, bunun üzerine silikon yağı ve pozisyon yarı sağlam hazırlanması küçük bir dab yerleştirin. (Noktası 2.13 bakınız) yukarıda açıklandığı gibi görüntüleme boyunca istikrarı sağlamak için, hazırlanması üzerinde naylon ızgara değiştirin. </li><li> Iki foton mikroskop kullanılarak spontan optik kayıt yapmakstandart görüntüleme protokolleri 10-11 kullanarak duyusal epitel (Şekil 7) neous kalsiyum aktivite. </li></ol>

<ol>
	<li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses.">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li><li>Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+pre-+and+post-synaptic+recording+from+the+peripheral+vestibular+calyx+and+its+included+type+I+hair+cell.">Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell.</a> , (2009).</li><li>Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+dependent+currents+in+type+I+and+II+hair+cell+and+calyx+terminals+of+primary+afferents+in+an+intact+in+vitro+mouse+vestibular+crista+preparation.">Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation.</a> , (2009).</li><li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista.">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> , (2010).</li><li>Songer, J. E., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+the+mammalian+saccule.">Transduction in the mammalian saccule.</a> , (2010).</li><li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear.">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li><li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista.">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li><li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro.">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li><li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons.">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li><li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina.">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li><li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals.">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li><li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris.">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Denge duygumuzu altında yatan mekanizmaları diğer duyu sistemleri ile karşılaştırıldığında sınırlı dikkat aldık, görsel ve işitsel sistemleri gibi. Vestibüler veya denge fonksiyonu değişiklikleri araştırdık çalışmaların, en denge-vestibüler saç hücrelerinin kendilerini temel yapı taşlarından eksik bilgi ile, vestibülookuler refleks dahil olmak üzere davranışsal tedbirler odaklanmıştır. Kendi ana ortamdan kaldırılır akut izole saç hücreleri kullanarak bunu saç hücre...

Günlük hayatımıza vestibüler sistemin önemli bir katkı rağmen, yaşla birlikte vestibüler fonksiyonunda gözlenen düşüş sorumlu süreçlerin net bir anlayış zor kalır. Bu bilgi eksikliği bir nedeni vestibüler fonksiyonu bu düşüş neredeyse sadece vestibülookuler refleks (VOR), dışsal vestibüler fonksiyonun kesin bir gösterge dahil davranış testleri kullanılarak incelenmiştir, ancak içsel bileşenlerinin değişiklikleri içine sınırlı bilgiler sağlar . Bu sağlık, hastalık, ya da yaşlanma vestibüler saç hücre fonksiyonlarını daha iyi anlayabilmemiz için önemli bir engeldir. Bireysel vestibüler saç hücrelerinin birçok çalışma varken, büyük bir eksiklik saç hücreleri ve hatta çanak afferent terminaller mekanik ve / veya enzimatik tedavi ile normal ortamdan kaldırılır akut saç hücresi hazırlıkları, üzerinde güven olmuştur. Bu tür yaklaşımlar kaçınılmazkızak kesici saç hücresi ve çanak ve saç hücre ve destekleyici hücre arasındaki hassas mikromimarisini bozabilir. Yarı sağlam hazırlıkları 1-5, ve izole bir fare labirent hazırlık 6 gelişmesiyle birlikte, daha yakından in vivo benzeyen bu koşullar altında sinaptik iletişim çeşitli şekillerde incelemek için bir fırsat şimdi var. Gerçekten de, Lim ve ark. (2011) I vestibüler saç hücreleri neuroepithelium içinde gömülü kaldığını kıyasla akut izole türünden kaydedilen tüm hücre akımları belirgin farklılıklar gösterdi. Özellikle, potasyum saç hücresi ve afferent çanak arasında, hücreler arası boşlukta birikir düşünülmektedir, ve önemli ölçüde saç hücresi yanıtı 7 değiştirebilir. Bu tür bilgiler burada açıklanan vestibüler duyusal epitelin yarı sağlam hazırlık olmadan elde etmek mümkün olacaktır. Biz fare krista 3 yarı sağlam hazırlık göstermekVe tam hücreli yama elektrofizyoloji elde edilen temsilcisi sonuçları ve iki foton kalsiyum görüntüleme göstermektedir.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz medium L-15</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L4386-10X1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAPTA-1-oregon green</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>O6806 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereo microscope</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>A60S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>BX51WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two-photon microscope</td>
 <td>Olympus/La Vision</td>
 <td>BX51WI/ TriMScope II</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 SF Forceps</td>
 <td>FST</td>
 <td>11252-00</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
 <td>FST</td>
 <td>16221-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard Pattern Scissors</td>
 <td>FST</td>
 <td>14001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>InstraTECH A-D converter</td>
 <td>HEKA</td>
 <td>ITC-18</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sutter Micromanipulator</td>
 <td>Sutter</td>
 <td>MP-225/M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>multiclamp amplifier</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 <td>700B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data acquisition software (electrophysiology)</td>
 <td>Axograph</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imspector Data acquisition software (two-photon)</td>
 <td>Max Planck innovation</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

an isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy

Anlamak vestibüler saç hücreleri normal koşullar altında işlev, ya da ne kadar travma, hastalık, ve bu fonksiyon bozabilir yaşlanma önleyici yaklaşımlar ve / veya yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi hayati bir adımdır. Ancak, anormal vestibüler fonksiyon bakarak çalışmaların çoğunluğu hücresel düzeyde olmuştur ama esas olarak yürüyüş analizleri ve vestibülookuler refleks performans olarak vestibüler fonksiyon bozukluğu davranış testleri odaklı değil. Bu iş terslik ne olur hakkında değerli bilgiler vermiştir olsa da, çok az bilgi disfonksiyon nedenleri ile ilgili toplanan edilir. Vestibüler fonksiyonu altında yatan hücresel ve hücre içi süreçleri odaklanmak çalışmaların, çoğu sinaptik bağlantıları ve destekleyici hücre çevre yoksun akut izole saç hücreleri, yararlanmıştır. Bu nedenle, büyük bir teknik meydan okuma bir hazırlık içinde zarif duyarlı vestibüler saç hücrelerinin erişimi olmuşturaration en fizyolojik, bozulur bu. Burada saç hücre / primer afferent kompleksleri dahil olmak üzere yerel mikro-çevre korur fare vestibüler duyu epitel bir yarı-sağlam hazırlık göstermektedir.

Vestibüler saç hücrelerinin elektrofizyolojik özellikleri onlar 7 gömülü olduğu dahilinde kompleksin mikromimarisine bağlıdır. Yarı sağlam vestibüler epitel hazırlanması türü arasında ayırt etmek için kullanılabilir, Şekil 5&#39;te de görüldüğü gibi bir saç hücreleri (Şekil 5A), tip II saç hücreleri (Şekil 5B) ve çanak birincil aferent (Şekil 5C) karakteristik tam hücre iletkenlikleri dayanmaktadır. Bu ö...

Watch this Scientific Journal Video about An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy at JoVE.com

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Vestibüler saç hücre fonksiyonu analizi kafatası, petröz temporal kemiğin en zor kısmı içinde derin konumlarına göre karmaşıktır. En işlevsel saç hücre çalışmaları akut izole saç hücrelerinin kullandık. Burada elektrofizyolojik ve iki-fotonlu mikroskop çalışmaları için fare vestibüler epitelyum bir yarı sağlam hazırlanması açıklanmaktadır.

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

an-isolated-semi-intact-preparation-mouse-vestibular-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K Görüntüleme.  University of Sydney. Vestibüler saç hücre fonksiyonu analizi kafatası, petröz temporal kemiğin en zor kısmı içinde derin konumlarına göre karmaşıktır. En işlevsel saç hücre çalışmaları akut izole saç hücrelerinin kullandık. Burada elektrofizyolojik ve iki-fotonlu mikroskop çalışmaları için fare vestibüler epitelyum bir yarı sağlam hazırlanması açıklanmaktadır.

Video: An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Nörobilim

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.