Başlamak için, traşlı, anestezi uygulanmış fareyi bir ısıtma pedine yerleştirin. Cildi dördüncü meme ucunun yakınında cımbızla sıkıştırın ve yaklaşık bir santimetrelik orta hat kesisi yapmak için kabarık cildi keskin bir makasla kesin. Bezin etrafında hem kraniyal hem de kaudal yönlerde dairesel kesiler yapın ve cildi karından dikkatlice soyun.
Daha sonra optik çözünürlük kaybını önlemek için herhangi bir eksojen kanı fizyolojik tuzlu su ile derhal çıkarın. Kan kaybını en aza indirmek için, belirgin kan damarlarını el tipi bir koterizatör ile kapatın. Ardından, yüzeysel bağ ve yağ dokusunu çıkarmak için yüzey tabakasını ince forseps ile nazikçe kızdırın.
Açıkta kalan bezi fizyolojik tuzlu su ile nemli tutun. Gerekirse, ameliyat sırasında açıkta kalan bezleri yıkayarak bezi ekzojen ajanlarla, örneğin farmakolojik ajanlarla veya organele özgü boyalarla tedavi edin. Karın duvarını yarı saydam, esnek bir termoplastik film ile koruyun.
Fareyi, karın tarafı aşağı bakacak şekilde, cilt kanadı merkezi kapak camına uzanacak şekilde ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına dikkatlice yerleştirin. Açıkta kalan alanları ince bir jel tabakası ile koruyun. Arka bacağı ve kuyruğu sahneye bantlayın.
Ardından, bezi solunum ve kalp atışının neden olduğu hareket artefaktlarından korumak için deri kanadı ile vücut duvarı arasına bantlanmış üç pamuklu çubuktan hazırlanmış özel yapım çentikli bir ara parça yerleştirin. Görüntüleme sırasında cilt flebinin kaymasını önlemek için sahne açıklığının her iki ucuna plastik bir kapağı güvenli bir şekilde bantlayın. Bir tüpe, şırıngaya ve pompaya bağlı sırt derisinin altına deri altı kalıcı bir kateter yerleştirin.
Konvansiyonel floresan mikroskobu kullanarak, cilt flebinin yeterli kan akışı ile stabil olduğunu doğrulayın. BODIPY ile etiketlenmiş EGFP sito veya EGFP membran faresinin konvansiyonel konfokal mikroskopisini 665676 ve monodansilpentan ile etiketlenmiş EGFP membran faresinin ve monodansilpentan ile etiketlenmiş tdTomato membran farenin iki foton mikroskobunu gerçekleştirin. EGFP sito farelerinde, salgı epitel hücrelerinin sitoplazması EGFP tarafından belirgin bir şekilde etiketlendi.
Aynı zamanda, BODIPY 665676 ile boyanmış lipid damlacıkları, özellikle apikal yüzeye doğru yuvarlak floresan cisimler olarak ortaya çıkmıştır. Hızlandırılmış analiz, BODIPY'nin 665676 lekeli lipid damlacıklarının bazaldan apikal bölgelere değişken hızlarda hareket ettiğini ve geçiş sırasında birbirleriyle kaynaştığını gösterdi. EGFP membran farelerinde, EGFP, kılcal ve salgı epitel hücrelerinin plazma zarlarını vurguladı ve sitoplazma boyunca BODIPY lekeli lipid damlacıkları görüldü.
EGFP membranı veya tdTomato membran farelerinin meme bezlerinin iki foton mikroskobu, bez morfolojisinin daha kapsamlı bir şekilde araştırılmasına izin verdi. Yüzeydeki kollajen lifleri, ikinci harmonik nesil boyunca monodansilpentan kanalında görselleştirilir. Parankimin daha ilerisinde, sekretuar epitel bazal, lateral ve apikal plazma membranları ve monodansilpentan lekeli lipid damlacıkları ile ortaya çıkar.
Merkezi lümen, alveolün içine doğru daha belirgin hale gelir. Kırmızı tdTomato floroforu, EGFP sito farelerindeki EGFP'den farklı olarak, kılcal endotelyumu etiketlemek için özellikle kullanışlıydı.
