Teknik yardım ve University of Maryland Greenebaum Kanser Merkezi Translational Core Tesisleri&#39;nde, özellikle Dr enstrümantasyon. Rena Lapidus ve Mariola SADOWSKA, müteĢekkiriz. Bu testin geliştirilmesi için sorumlu çalışma NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, AP bir VA Merit Ödülü, tarafından ve Maryland Sigara İade Fonlarının Üniversitesi (CRF) Marlene &amp; Stewart sağlanan tarafından kısmen finanse edildi Greenebaum Kanser Merkezi.

Birkaç adım vaktinden önce yapılmaktadır ve çok sayıda reaktif önce prosedüre benzer bir şekilde depolanmıştır: (1) bir hücre kültürü ve protein izolasyon, (2) oligonükleotid hazırlanması, (3) 96-yuvalı plakaların hazırlanması, (4) çekirdek özütü inkübasyon gece boyunca karıştırılmıştır. Prosedür, çünkü DNA oligonükleotidler ile nükleer protein gece boyunca inkübasyon 2 gün gerektirir. 1.. Tamponlar hazırlanması 1,1 Nükleer protein izolasyon <ol><li> Hipotonik Tamponu: hipotonik tampon 100 ml hazırlamak için, 98.3 ml H2O için 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 150 ul (1 M MgCI2), 333 ul (3 M KCl) ekleyin Nihai konsantrasyonlar: 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI. Hipotonik tamponu + NP40 (adım 2.11 kullanım için) için: son% 0.5 NP40 için 9.5 ml hipotonik tampon maddesi ile 0.5 ml (10% NP-40) eklenir. </li><li> Düşük tuz tamponu: (adım 2.15 kullanım için) düşük tuz tamponu 100 ml hazırlamak için, 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 25 m eklemekl gliserol, 150 ul (1 M MgCI2), 666 ul (3 M KCl), 40 ul (0.5 M EDTA) 73 ml H2O için Nihai konsantrasyonu: 10 mM HEPES,% 25 gliserol, 1.5 mM MgCI2, 20 mM KCI, 0.2 mM EDTA. </li><li> Yüksek tuzlu tampon (adım 2.15 kullanım için) yüksek tuz tamponu 100 ml hazırlamak için, 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 25 ml gliserol, 150 ul (1 M MgCI2), 26.7 ml eklemek (3 M KCl), 40 ul (0.5 M EDTA) 47 ml H2O için Nihai konsantrasyonu: 10 mM HEPES,% 25 gliserol, 1.5 mM MgCI2, 800 mM KCI, 0.2 mM EDTA. </li><li> 10% NP-40 deterjan: 10 ml NP40 90 mi H 2&#39;ye O </li><li> Proteaz ve fosfataz inhibitörleri [hipotonik tampon ilave + NP40 (aşama 2.11), düşük tuzlu tampon (aşama 2.15) için ve yüksek tuzlu tampon (basamak 2.15) kullanımdan hemen önce]: 2.5 ul (1 M DTT) ilave edin ve 50 0.5 mM DTT ve 1 x proteaz inhibitörlerinin son konsantrasyon için, her 5 ml tampon ile proteaz inhibitörlerinin (100x) arasında ul. Proteaz inhibitörü 100x kanşımı içerir:Sodyum flüorür (Ser / Thr, asit fosfatazlar), sodyum ortovanadat (Tyr, alkalin fosfatazlar), β-gliserofosfat (Ser / Thr fosfatazlar), sodyum pirofosfat (Ser / Thr fosfatazlar), Aprotinin (Ser proteazlar), bestatin (amino-peptidazlar ), E64 (Sistein proteazlar), Löpeptin (Ser / Cys proteazlar), EDTA (metaloproteazlar). </li></ol> Deney plakası 1.2 hazırlanması <ol><li> Levha sabitleme çözeltisi: çözeltisi 500 ml hazırlanması 500 ml H2O için 5.25 g sodyum karbonat eklenir, iyice karıştırılır ve 0.1 M sodyum karbonat, son konsantrasyon için 9,7 pH&#39;ı ayarlamak için. </li><li> Levha bloke etme çözeltisi: stok hazırlamak için poli dI / akım oligonükleotid, tekrar süspansiyon 1 Birim (~ 50 mg), poli dI / akım 1 ila 10 mM Tris / HCl, 50 ug &#39;lik bir stok konsantrasyonu için 1 mM EDTA içeren pH 7.9 ml / ul. Hazır 1 ug / ul kullanımı önce seyreltilir. </li></ol> 1.3 Yıkama tampon ve antikor seyreltileri NOT: Streptavidin yıkama tamponu,<html> eklemeler arasında plakalar yıkama ve birincil ve ikincil antikorlar sulandırmak için kullanılır. <ol><li> Streptavidin yıkama tamponu 1 L hazırlamak için, 2.4 g Tris / HCl, 37.5 ml (4 M NaCl), 10 ml (% 10 BSA), 5 ml (% 10 Tween-20), 1 L Millipore Steril süzüldü, su ekle , pH 7.18. 4 ° C&#39;de saklayın Nihai konsantrasyon: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl,% 0.1 BSA,% 0.05 Tween-20. </li></ol> 1.4 DNA-bağlama tamponu NOT: Bu tampon -20 ° C&#39;de saklanır <ol><li> DNA bağlama tamponu 15 ml hazırlamak için, 180 ul (1 M HEPES, pH 7.9), 300 ul (3 M KCl), 12 ul (0.5 M EDTA, pH 8.0), 7.5 ul (1 M DTT), 3.0 ml eklemek (% 60 gliserol), 300 ul (50 ug / ml poli dI / dC) / distile deiyonize H2O (12 mi) ile seyreltildi. Nihai konsantrasyon 12 mM HEPES / pH 7.9, 60 mM KCI, 0.4 mM EDTA, 0.5 mM DTT,% 12 gliserol, 1 mg / ml poli dI / akım. </li></ol> 2. Hücre Kültürü ve Nükleer Protein İzolasyonu t &quot;&gt; Not:.. Preparat her deney için kullanılan hücre sayısı değişir hücrelerin uyarılması deney bağlıdır yaklaşık 3 saat gerektirir ve tüm miktarlar 3 x 10 7 hücre / noktasını kullanan tipik bir deney yansıtmak karşılamak için miktarlar ayarlayın. aslında deneyde 6 da kullanılan hücre sayısı. <ol><li> DNA bağlama deneylerinde, uygun ortam 6 Runx2 (endotel, osteosarkom, meme kanseri hücreleri) eksprese kültür insan hücrelerinde nükleer protein hazırlamak. </li><li> G2 / M hücre siklüs sınır 6 hücrelere tutuklama nokodazol (16 saat süre ile 0.2 ug / ml) ile birlikte akan hücreler tedavi. Bu koşullar altında, Runx2 protein stabilize edilir ve bağlayıcı maksimal DNA elde edilir. Birden çok deneyler ve inhibitörler aynı preparattan karşılaştırılabilir Bu şekilde, yeterli nükleer protein kullanılabilir. </li><li> Her bir aşama için, 4 ° C&#39;ye kadar santrifüj öncesi serin ve tampon hazırlanması ve hücre hasattan önce 4 ° C&#39;de 20 dakika soğuk.</li><li> Chill hücreleri (4 ° C) ve buz üzerinde davranış prosedürleri. </li><li> Bir 15 ml polipropilen yuvarlak dipli bir tüp içinde 5 dakika boyunca 1000 rpm&#39;de santrifüj hücreleri. </li><li> Buz soğukluğunda PBS ile yıkayın 1x (Ca 2 + ve Mg2 + içermez). </li><li> Tekrar santrifüj ve PBS süpernatant atın. </li><li> Tamamen hücre pelletini için dikkatli olmak, proteaz inhibitörleri olmadan hipotonik tampon 500 ul ekleyin. </li><li> Bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarın. </li><li> Hemen 5.5 dakika boyunca 5,500 rpm&#39;de santrifüj, süpernatant atmak ve hücre pelet TUTUN. </li><li> % 0.5 NP40 içeren hipotonik tampon maddesinin 500 ul hücre pelletini. Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ve 0.5 mM DTT (aşama 1.1.5 tarif edildiği gibi) ilave edin. </li><li> Numune, 30 dakika boyunca buz üzerinde dinlenmeye bırakın. </li><li> 10 dakika boyunca 13,000 rpm&#39;de santrifüje. </li><li> Süpernatant (sitosolik proteinler içerir) atın. </li><li> 60 ul düşük sal her nükleer pelletinit tamponu (ki proteaz inhibitörleri ve 0.5 mM DTT 1.1.5 ikinci aşama eklenmiştir) ve 120 ul bir toplam yüksek tuz tamponu (ki proteaz inhibitörleri ve 0.5 mM DTT 1.1.5 ikinci aşama eklenmiştir). Birinci ve pelet tekrar süspansiyon düşük tuz tamponu 60 ul, daha sonra yüksek tuz tamponu 60 ul ekle. Yeniden süspansiyon yardımcı olmak için pelet vorteksleyin. </li></ol> Not: Bu adım nükleer membran proteinlerinin bazı kurtulmak yardımcı olur ve parçalama adım için yukarı ayarlayın: Düşük tuz Önce (tekrar süspansiyon pelet, vorteks), sonra yüksek tuz (vorteks) bu adımı optimize eder. İlk 10 dakika sonra vorteks ile, 30 dakika boyunca buz üzerinde özü tutun. <ol start="16"><li> 15 dakika için 12,000 rpm&#39;de santrifüj, nükleer protein içeren süpernatant tutun. </li><li> -80 ° C&#39;de protein konsantrasyonu (2-5 mg / ml &#39;de örnekleri tutmaya çalışın), uygun miktarlarda (10 ul / tüp) içinde alikosunu ve mağaza ölçün </li></ol> NOT: Tahmini verim: 30 x 10 6 cells 120 ul içinde 5 ug / ml bir protein elde edecektir. 5 x 10 6 hücre 40 ul 2.2 ug / ml bir protein elde edecektir. 3. Çift kollu bir oligonükleotit, hazırlanması <ol><li> Uçlarında uyumlu yarım siteleri ile tamamlayan oligonükleotidler tasarlayın. Runx2 için bunlar: 5&#39;-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3 &#39;-Biotin (duyu) ve 5&#39;CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3&#39;-Biotin (antisens). </li></ol> NOT: Üç Runx2 bağlanma siteleri ve tek uç etiketli biyotin en tekrarlanabilir sonuçlar vermiştir tespit Pilot deneyler. <ol start="2"><li> 5x tavlama tamponu hazırlayın: 260 ul H2O (son 600 ul) 300 ul (1 M Tris-HCl, pH 7.6), 30 ul (1 M MgCI2), 10 ul (1 M DTT) ilave edin. </li><li> Her bir tek şeritli oligo 200 pmol içinonucleotide (3 ul), 5x bağlanma tampon maddesi 12 ul ve 60 ul (200 pmol/60 ul), toplam 45 ul H2O ekleyin. </li><li> Bir ısıtma bloğu içinde 5-10 dakika boyunca 95 ° C&#39;de ısıtın. </li><li> 65 ° &#39;ye soğutulup yavaşça ısıtma bloğu (ya da 65 ° C 50 ml su içinde yerleştirilmesi ile gücünü kapatarak yavaş yavaş oda sıcaklığına kadar soğutulur, daha sonra (65 ° C sıcaklığının ayarlanması ile, bu 15 dk) C buz üzerinde bir çanak içinde, bu), 15-20 dakika sürer. </li></ol> 4. 96 oyuklu plakaların hazırlanması NOT: yıkama tamponlar süt proteinleri kullanmayın. <ol><li> Sabitleme çözeltisi (0.1 M sodyum karbonat) ile plaka saptamak: 300 ul / yuva ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında (RT), sallanan ya da 4 ° C (O / N) ile sallanan ile 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Streptavidin yıkama tamponu (WB) ile plaka 3x yıkayın: 300 ul / kuyu her zaman eklemek. </li><li> W 2 saat için biotin-etiketli çift şeritli oligonükleotid (nükleotid başına 3 konsensüs bağlanma yerleri) eklemeith (1.25 nmol / çukur, 100 ul / oyuk) sallanan. </li><li> Soğuk WB ile yıkayın 3x: 300 ul / yuva ekleyin ve hemen ardından bir lavabo içine plaka ters çevirin ve her eklemeden sonra bir kağıt havlu üzerinde kenarları leke. </li></ol> NOT: Bu avidini kazımak olabilir plakalardan sıvıyı çıkarmak için pipet uçları kullanmayın: biotin: kuyulardan DNA kompleksleri. Sonraki tüm yıkama adımlar için bunu yapın. 5. Nükleer Extract ile inkübasyon NOT: poli dl / akım engelleme tampon için somon veya ringa sperm DNA yerine koymayın. Süt proteinleri ile plakaları engelleme kaçının. Bu bloke edici maddelerin her ikisi de, yüksek bir zemin değerlerine neden olur. <ol><li> Nükleer ekstrakt (90 ul / kuyucuk) hazırlanabilir transkripsiyon faktörü ile inkübe edin. Nükleer ekstre içeren bir ana karışım hazırlayın (DNA bağlama proteini, 3-9 ug / çukur) + poli dI / akım 1x DNA (50 ug / ul stok 1 mg / ml) bağlama tamponu. Hacim olarak toplam sayısı için gereklidirGerekli kuyular (90 ul / kuyucuk). </li><li> Vitamin D3 (Şekil 2) veya CADD bileşik 5221975 (Şekil 3), ya da etanol gibi bir çözücü kontrolü, uygun seyreltme gibi herhangi bir potansiyel önleyicisi, bu aşamada eklenir. </li><li> 4 ° C&#39;de O / N, bir platform üzerinde sallanan plaka </li><li> WB ile 3x yıkayın: 300 ul / kuyu eklemek </li></ol> 6. Primer antikor ilavesi NOT: Primer antikor sulandırmalar taze olarak hazırlanması gerekir - depolama tavsiye edilmez. <ol><li> Runx2-spesifik monoklonal antikor (1 ug / ul), 1/5, 000 Streptavidin yıkama tamponu ile seyreltilir. 96 oyuklu plaka (90 ul / kuyucuk), üç kopya halinde her bir oyuğuna ilave edilmesi için yeterli hazırlayın. </li><li> Bir sallanan platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> WB ile 3x yıkayın; 300 ul / kuyu ekleyin. </li></ol> 7. İkincil antikor ilavesi NOT: İkincil antikor sulandırmalar sto olabilirertesi gün gerektiğinde gece boyunca 4 ° C&#39;de kırmızı. <ol><li> Streptavidin içinde 1:1,400 F ab özgü afinite ile saflaştırılmış-HRP konjuge antikor (7.1 mg / ml stok) seyreltin yıkama tamponu: 3.5 ul antibody/5.0 ml yıkama tamponu. 96 oyuklu plaka (90 ul / kuyucuk), üç kopya halinde her bir oyuğuna ilave edilmesi için yeterli hazırlayın. </li><li> Bir sallanan platform üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Lavabonun (300 ul / kuyucuk) içine plakayı baş aşağı çevirerek WB ile yıkayın 6x. </li></ol> 8. HRP Yüzey ve Ürün Geliştirme <ol><li> Stok şişeden de doğrudan başına TMB substratı 50 ul ekleyin. </li><li> Karanlıkta oda sıcaklığında 10-20 dakika inkübe (reaksiyonu yöntemi durdurmak) veya doğrudan (sürekli kinetik izleme) absorbans ölçmek. </li></ol> 9. Reaksiyon Ölçümü <ol><li> Reaksiyonu yöntemi Dur: Görsel durdurma reaksiyonu için mavi, açık renk değişimi kontrol ve 50 ul sülfürik asit ile reaksiyonu durdurun. </li><li> 450 nm&#39;de emilimi ölçünBiotrak II görünen plaka okuyucu spektrofotometre (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway, NJ, USA) ya da benzer bir alet. </li><li> Sürekli kinetik izleme yöntemi: son yıkamadan sonra tabakayı ekleyin ve hemen önce spektrofotometre yerleştirme için (tepki bitmiyor). </li><li> Bio-Tek Synergy HT Çoklu Reaksiyon mikroplaka okuyucu spektrofotometre ile 635 nm&#39;de absorbansı ölçülür (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, VT, ABD) ya da benzer bir alet. </li></ol>

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li><li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays.">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497 (2009).</li><li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TransLISA,+a+novel+quantitative,+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses.">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li><li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway.">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li><li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+(cholecalciferol)+prohormone+activity.">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+ß-galactosidase+activity+using+the+PowerWave+HT+and+Gen5+data+analysis+software:+basic+enzyme+kinetic+determinations.">Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations.</a> Biotek Instruments Application Note. , (2007).</li><li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).</li><li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topoisomerase+I+inhibitors:+chemistry,+biology,+and+interfacial+inhibition.">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA.">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

DNA-bağlama deneyleri, DNA ile etkileşime transkripsiyon faktörlerinin yeteneğini ölçmek için kullanılır. DNA bağlanması için tahliller, elektroforetik mobilite kaydırma (EMSA) 1 ve kromatin immuneprecipitation (çip) dayalı tahliller, 3 ve 96 oyuklu formatları bu chemiluminescent 2 ile 4 kullanan tahliller bulunmaktadır. EMSA olmayan nicel ve radyo-etiketli (32 P) oligonükleotitler kullanılır. Bu, nükleer protein ile inkübe edilir ve bağlayıcı kompleks...

DNA-bağlama deneyleri, DNA ile etkileşime transkripsiyon faktörlerinin yeteneğini ölçmek kullanılabilmektedir. DNA bağlanması için tahliller, radyo-etiketli oligonükleotidler 1 ya da kemiluminesan tahliller 2 bağlıdır elektroforetik mobilite kayma analizleri (EMSA) içerir. 96 oyuklu biçimleri kullanılarak 4 Kromatin immuneprecipitation (çip) dayalı tahliller 3 hem de deneyler de tarif edilmiştir. Bununla birlikte, radyo-etiketli EMSA oligonükleotitlerin kullanımını gerektirir olmayan bir kantitatif deneyidir. Nükleer proteinler, spesifik nükleotid promotör sekansları ile ortak olduğunda, bağlanma kompleksleri poliakrilamid jelleri üzerinde geciktirilir ve spesifik transkripsiyon faktörü, bir antikor &quot;süperkayma&quot; ile doğrulanabilir. Bu tanımlanan promotör elemanlara tekabül eden DNA-bağlayıcı dizileri ile Runx2 etkileşimini ölçmek mümkün olan bir enzim-bağlı immünosorbent biçimi (D-ELISA) kullanılarak kantitatif bir DNA-bağlama deneyi geliştirdik in Runx2 hedef genler. Bir anti-Runx2 antikorun kullanımı tahlile özgüllük sağlar ve radyo-etiketin yokluğu geleneksel jel kayma deneyi 5 Bu tahlil ayırt eder. Bağlayıcı komplekslerinin tespiti spektrofotometrik analiz için bir renkli ürüne bir HRP alt-tabaka, tetrametil benzimidin (TMB) dönüştürür turp peroksidaz (HRP) bağlı ikinci bir antikorun kullanılması ile mümkündür. Burada bildirilen deney, kontroller olarak mutasyona uğramış DNA oligonükleotitlerin kullanımı dahil olabilir ve bağlayıcı DNA rekabetçi veya rekabetçi olmayan inhibitörleri tespiti için de kullanılabilir. Yeni anti-tümör bileşiklerinin bu deneyde tarama ile de mümkündür.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly dI/dC</td>
			<td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td>
			<td>US20539-5UN</td>
			<td>1 U ~50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2 antibody</td>
			<td>MBL International Corp., Woburn, MA</td>
			<td>D130-3</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9917</td>
			<td>7.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td>
			<td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td>
			<td>X1189S</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>57995</td>
			<td>Plate-fixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>VWR, West Chester, PA</td>
			<td>BDH-39922-1</td>
			<td>Stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td>
			<td>655996</td>
			<td>Avidin-coated, black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td>
			<td>78440</td>
			<td>Protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td>Various manufacturers</td>
			<td>Laboratory grade</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with stop reaction method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with continuous kinetic monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents

Örneğin elektroforetik hareketlilik kayma deneyleri (EMSA), kemilüminesan deneyleri, kromatin immünopresipitasyon (çip) dayalı tahliller ve çukurlu bazlı tahliller gibi birçok DNA-bağlama deneyleri, transkripsiyon faktörü aktivitesinin ölçülmesi için kullanılır. Bununla birlikte, bu deneyler, nonquantitative olan özgüllük eksikliği, radyo-etiketli oligonükleotit kullanılmasını içerebilir ve bağlayıcı bir DNA inhibitörlerinin taranması için adapte olmayabilir. Öte yandan, bir sayısal DNA bağlayıcı enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA D-) analizi kullanarak, biyotin-üzerinde mevcut olan konsensüs DNA-bağlayıcı dizileri ile özel bir birlikte bağlıdır Runx2 transkripsiyon faktörü kullanılarak DNA ile nükleer protein etkileşimlerini göstermek etiketli oligonükleotidler. Hücrelerin hazırlanması, nükleer protein ve çift sicimli oligonükleotidlerin tasarım çıkarma açıklanmıştır. Avidin kaplı 96 oyuklu plakalar, alkalin tampon maddesi ile tespit edilmiş ve nükleotid bloke edici tamponu içinde nükleer protein ile inkübe edilir. FollPlakaların geniş yıkama, spesifik birincil antikor ve ikincil antikor inkübasyonlar bağlı kolorimetrik reaksiyonun yaban turpu peroksidaz substrat ve gelişme eklenmesi ile takip edilmektedir. Reaksiyon durdurma modu veya sürekli kinetik izleme kantitatif protein DNA ile etkileşimi ölçmek için kullanıldı. Bu non-spesifik IgG ile ya da protein ya da primer antikor olmadan tedavisi dahil olmak üzere, uygun özgüllük kontroller, tartışır. Analizin Uygulamaları onun uyuşturucu taraması programı ve temsilci olumlu ve olumsuz sonuçlar tartışılmıştır dahil açıklanmıştır.

D-ELISA yöntemi sürece Runx2 konsensüs bağlanma sitesi (ACACCA) üç kopyasını içeren bir diziye özgü, çift sarmal kollu oligonükleotit kullanılan olarak belirlenmiş DNA-bağlama proteini için son derece özeldir. Protein faktörü tanıma birincil antikor özgünlüğünü ayrıca artırır. İkincil antikor, saptama kolaylığı (Şekil 1) için bir renkli ürüne açık bir alt-tabaka (tetrametil benzidin) dönüştürür kovalent olarak-bağlanmış yaban turpu peroksidazı (HRP) içer...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents at JoVE.c

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Bu DNA ile transkripsiyon faktörü etkileşimi ölçmek için nicel bir DNA-bağlayıcı ELISA bazlı bir deney geliştirilmiştir. Runx2 protein için yüksek spesifikliği, bir konsensüs DNA tanıma oligonükleotid ve özel bir monoklonal antikor ile elde edilmiştir. Bir enzim-bağlı antikor alt tabaka reaksiyonu ile kolorimetrik tespit gerçek zamanlı olarak izlenmiştir.

Gen İfadesi DNA etkileşimleri, Discover Transkripsiyonlu Regülatörleri ve Roman Anti-tümör Ajanlar tanımlayın: Protein Eğitim için Kantitatif Testi

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

a-quantitative-assay-to-study-proteindna-interactions-discover

Research

JoVE Journal

Biology

18.5K Görüntüleme.  University of Maryland School of Medicine.  Bu DNA ile transkripsiyon faktörü etkileşimi ölçmek için nicel bir DNA-bağlayıcı ELISA bazlı bir deney geliştirilmiştir. Runx2 protein için yüksek spesifikliği, bir konsensüs DNA tanıma oligonükleotid ve özel bir monoklonal antikor ile elde edilmiştir. Bir enzim-bağlı antikor alt tabaka reaksiyonu ile kolorimetrik tespit gerçek zamanlı olarak izlenmiştir. 

Video: A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biyoloji

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.