Name: methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans
Uploaded: 2014-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans at JoVE.com

Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

Aşağıdaki protokoller C. ayrıntılı prosedürü tarif elegans cilt yaralama ve yara yanıtları tahlil için. 1. İğne Yaralama 3,4 <ol><li> Standart NGM (nematod büyüme ortamı) E. ile plakalar üzerinde sağlıklı unstarved solucanlar büyütün bir 20 ° C kuluçka makinesi içinde tutulmuştur gıda E. coli OP50 bakteridir. Not: NGM agar plakaları ve C rutin ekimi için yöntemler elegans www.wormbook.org 6 bulunabilir. </li><li> 20 ° CO / N de yaralama ve kültür önce taze numaralı seribaşı plaka 1 gün 25 L4 aşamada solucanlar seçin. </li><li> Yaralama önce, bir iğne çektirmenin kullanarak kılcal iğneleri çekin. yaralama kullanılan iğneler C mikroenjeksiyon için kullanılan oranlarla aynı olduğu; elegans. </li><li> Tüm solucanlar genç yetişkin aşamasında olduğundan emin olun. Yaklaşık 30 dakika boyunca buz üzerinde solucanların plaka koyun. Soğutma hayvanlar iğne yaralama kolaylaştırılması, halsiz neden olur. <br /&gt; NOT: buz çıkarıldıktan 5 dakika içinde, solucanlar normal hareket başlayacaktır. Bu hareket solucanlar yara mümkün ama zor. Tecrübesi ile, 5 dk 25 solucanlar yara için yeterli zamanı. Hayvanlar kurtarmak için uzun sürer rağmen (aşağıya bakınız lazer yaralama kullanılan) gibi levamizol gibi ilaçlarla hareketsiz. </li><li> Diseksiyon stereomikroskopta için buz agar plakasını sökün. Bir solucan seçim kullanarak, agar plaka merkezi haline 25 solucanlar taşıyın. </li><li> Daha kolay iğne tutmak için 100 ul pipet içine iğne yerleştirin. Gonad kaçınarak, iğne ile solucanın vücudun ön veya arka kısmını delinme. Genel olarak, arka farenks ve anterior gonad arasında, ya da arka gonad ve rektum arasındaki yara çalışmayın. Yeniden kullanım iğneler birçok kez, kırılıncaya kadar. NOT: hayvana ~ 5-10 mikron delici, yaralar manikür ve cilt delinme kısa, nazik azabı olduğundan emin olun. İğne anim girmelidirderiye ark yaklaşık dik bir açı. yaralar, iç organlarda hasara açık, ya da vücudun hemen rüptürü neden olmamalıdır. Sitoplazma yaralanmasından sonra bir kaç saniye için dışarı sızmaya küçük bir miktar gözlemleyin; hücresel içeriği uzun bir zaman içinde sızarsa, ancak hayvanlar hayatta olmaz. Optimum görüntüleme için, yanal epidermal syncytium (hyp7) veya lateral dikiş yara. NOT: Bu işlem, bir cam iğne kullanılmasını içerir. </li><li> Solucanlar 20 ° C&#39;de daha sonra oda sıcaklığında kültüre geri izin verin. Aşağıda tarif edilen deneylerde, bir dizi iğne yaralanma başarısını değerlendirin. Vahşi tip hayvanların% 95&#39;den daha fazla iğne genç yetişkin safhasında yaralama sonrası 24 saat hayatta. larva veya yaşlı yetişkinlerde yaralama etkisi henüz yaygın olarak analiz edilmemiştir. </li></ol> 2. Lazer Yaralama 3 Daha kesin yaralama gerçekleştirmek için femtosaniye lazer ışınlama (800 nm) kullanın. <ol><li> Agar p hazırlayınerimiş% 2 agar 7 ile bir cam slayt reklamlar. Pedleri C. canlı görüntüleme için kullanılan agar pedleri benzer olun elegans. </li><li> Solucan kıracağıyla agaroz ped üzerine 10 genç erişkin solucanlar aktarın ve 12 mM Levamisole solüsyonu 2 ul damla ekleyin. Hayvanlar ve bir kapak kayma ile sıvı örtün. Solucanlar felç için 1-2 dakika bekleyin. </li><li> Dönen bir disk konfokal mikroskop üzerine cam slayt yerleştirin. Solucanlar bulmak ve 100X amacı ile yanal ön veya arka sinsityal epidermis (NA 1,4-1,46) odaklanmak sahne taşıyın. </li><li> 140 mW femtosaniye lazerin gücünü ayarlayın (objektif önce ölçülür). 80 MHz tekrarlama oranı femtosaniye lazer kullanın. NOT: (20 msn ile ayrılmış) 200 msn, her iki bakliyat elimizde yaralama için yeterlidir. </li><li> Epidermal hücre apikal yüzeyinde odaklanın ve epidermisi yara. Sitoplazma (kabarcıklarla) yerel bozulması, veya yerel ağartma o gözlemleyinkullanılan herhangi bir floresan markör, f. NOT: femtosaniye lazer kullanarak, uygun lazer güvenlik prosedürleri uygulayın. Böyle iki foton mikroskoplar gibi femtosaniye lazerler kullanarak Hattı veya nokta taramaları lazer yaralama için yeterli güç vermelidir. NOT: diğer lazerler kullanarak doğrudan deneyimi yok iken, ilke yaralama içinde (C hücre ablasyon elegans kullanıldığı gibi) geleneksel UV lazerler kullanarak mümkün olmalıdır. İsteğe bağlı olarak, epidermis (N. Pujol, kişisel iletişim) yara disk konfokal eğirme (sıkı bağlamak) modülünü Photobleaching sonra Floresan Kurtarma kullanın. </li></ol> Yaralama Epidermal Ca 2+ Cevaplarının 3. Görselleştirme <ol><li> Transgenik C kullanın Yetişkin, epidermal spesifik promotör sütun-19 (Şekil 1A kontrolü altında epidermis (örneğin GCaMP serisi gibi) Ca + 2 sensörleri ifade elegans suşu, transgenler listelenen <strong&gt; Tablo 1). Transgen ekspresyon düzeyi için bir iç kontrol olarak örneğin tdTomato bir kırmızı flöresanlı proteinin eksprese eden bir transgen kullanın. NOT: Epidermal tdTomato floresan nispeten sabit olduğu gibi transgen ifadesi için bir iç kontrol olarak tdTomato kullanmış ve GCaMP görüntüleme ile karışmaz. </li><li> Epidermis tetikleyici Ca 2 + yükseklik yaralama iğne ve lazer Hem. İğne yaralama kolayca dönen bir disk konfokal gerçekleştirilemez Ancak, lazer yaralama Ca 2 + tepki (Şekil 1) kantitatif analiz için tercih edilir. </li><li> Bir 100X amacı ile dönen disk konfokal (NA 1,4-1,46) ve uygun filtre setleri kullanılarak çok boyutlu edinim modu (zaman aralığı 114 msn uyarma lazer maruz 2 sn) zaman atlamalı görüntü elde (GFP filtreler GCaMP3 için çalışacak). NOT: Ca 2+ resp incelemek için yaklaşık 2 saat zaman atlamalı görüntüleri her 30 sn Edinmeuzun bir zaman boyunca yaralama için onse. </li><li> Görüntü analiz yazılımı kullanarak arka planda epidermal hücre sitoplazmada ve beş merkezli beş olan ilgi (ROI) on eşdeğer bölgelerinde, ortalama GCaMP floresan ölçmek. </li><li> Sonra yaralanma öncesi arka planda 5 İB&#39;nin ortalama çıkarılarak epidermis 5 ROI floresan ortalama bazal floresan (F 0) edinin. Başlangıca [(F t -F 0) / F 0] göre değişim oranı olarak floresan mesafe kadar taşınmış değişikliği ifade eder. </li></ol> Yaralama sonra F-aktin Dynamics 4. Görselleştirme <ol><li> NOT: İğne yaralama yanıt olarak, yavaş yavaş yara etrafında kapatır yara yerinde bir aktin halka gözlemlemek. Bu protokol bölüm deneyleri aktin halka çapı ölçerek kapatılması yara. </li><li> Böyle kaynaşmış Drosophila moesin aktin bağlayıcı etki alanı olarak bir F-aktin işaretleyici ifade transgenik solucanlar oluşturunGFP, örneğin (transgen juIs352) sütun-19 (Şekil 2A) ve epidermal özel bir promoterin kontrolü altında ifade edilmiştir. NOT: Biz LifeAct veya F-tractin (yayınlanmamış sonuçlar) gibi etki alanı belirteçler bağlayıcı diğer aktin kullanılarak benzer sonuçlar elde ettik. </li><li> P col-19- GFP-moesin transgenik solucanlar üzerinde yaralama iğne yapın. İğne yaralama sonra, ~ 5 dakika ile yara site çevresinde GFP-moesin bir halka gözlemlemek. aktin halka çapı küçülür ve en sonunda vahşi tip hayvanlara (Şekil 2A) yaralama 2-3 saat sonra kapatır. </li><li> Bir cam slayt üzerinde% 2 agar dolgusunu hazırlayın ve 2 ul 12 mM Levamisole çözeltisi içinde ped üzerine 10 solucanlar aktarmak. Geleneksel konfokal mikroskopi kullanılarak yaralama sonra görüntü GFP-moesin halkaları 1 saat. NOT: konfokal mikroskopi 1 saat yaralama sonra aktin halkaları z-yığınları (13 x 0,5 mm) elde etmek. </li><li> Yaralama sonra aktin halka çapını ölçün. Epidermal G ölçmek içinFP-moesin, ilk z-yığınının maksimum yoğunluk projeksiyonu yapmak ve daha sonra 4 hat taramaları çizmek GFP-moesin halkası üzerinde (birbirine 45 °). Halka çapı dört hat taramaları (Şekil 2B) arasında tepeden tepeye mesafe, ortalama pik olarak tanımlanır. Zaten kapalı olan halkalar için, çapı 0 mikron olarak tanımlanır. NOT: Bu vahşi tip yara kapama sürecinde yaklaşık yarım yoludur F-aktin halkalar rahatlıkla yaralama 1 saat direkte ölçülür. F-aktin halkalar aynı zamanda bir yara kapatma zaman içindeki gelişimini elde etmek için çok sayıda zaman noktasında ölçülebilir. Yara kapanması Zaman atlamalı filmleri Levamizol-immobilize solucanlar kullanarak ve disk konfokal mikroskopi iplik elde edilebilir. </li></ol> Epidermal Antimikrobiyal Peptitler 5. Deney İndüksiyon NOT: Yaralama da C. doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını tetikler elegans cilt. Antimikrobiyal peptidler (amper) kodlayan genlerin transkripsiyonu ind olduğunuEpidermiste uced. NLP-29 (nöropeptid benzeri protein) AMP güçlü 4 yaralama ile indüklenir. Epidermis yaralama sonra AMP ifade nasıl kontrol bireysel AMP transkript seviyelerini tespit etmek için transgenik gazetecilere ya da real-time PCR kullanmak, tahlil için. <ol><li> 4 yaralama doğuştan gelen bağışıklık yanıtı için transgenik muhabiri tahlil. </li><li> Bir iç kontrol olarak P nlp-29- GFP ve P col-12- DsRed içeren transgenik muhabiri frIs7, ifade yetişkin hayvanlar üzerinde (protokol 1 gibi) iğne yaralama gerçekleştirin. GFP uzun geçiş filtresi olarak koyu kırmızı veya turuncu yarasız yetişkin hayvanlar gözlemleyin. NOT: yaralanması vahşi tip solucanlar P nlp-29 GFP ifadesini neden olacaktır ama GFP uzun bir pas aydınlatma altında turuncu, sarı, yeşil veya görünen solucan sonuçlanan, P col-12 -dsRed etkilemez. Böyle PMK-1 veya p38 MAPK yolundaki genlerin fonksiyonlarının kaybı sy-1 engeller NLP-29 GFP4 yaralama sonra indüksiyon. P NLP-29- GFP larva aşamalarında yüksek seviyelerde ifade edilir </li><li> Genç yetişkin hayvanlarda AMP indüksiyon tahlilleri gerçekleştirin. Yarasız kontrol hayvanları GFP düşük seviyelerde olduğundan emin olun. Not: p NLP-29- GFP tanımı da ozmotik stres 8 ile sağlanır ve diğer çevresel strese duyarlı olabilir. </li><li> Yaralama sonra 6 saat, GFP uzun geçiş filtresi ile kapsamını diseksiyon bir floresan kullanılarak P nlp-29 GFP indüksiyon (Şekil 3) 9 sahip solucanlar numaralarını puan. NOT: 1 saat sonrası yaralama P nlp-29- GFP gözle görülür bağlı olduğu anda, daha sonra 6 saat sonrası yaralama hakkında zirveye ulaşan ve 24 saat sonrası yaralama kadar yükselmiş kalan. Görsel puanlama 4,9 ile ifade niceliğini. Alternatif olarak, bir floresan aktive solucan sıralayıcı 4 kullanarak ifade seviyelerini ölçmek. Solucan sıralayıcı için, en az 50 hayvan yaralı gerekir. </li><li> Nereye Real-time PCR deneyiBireysel AMP genlerin transkript seviyelerini ntitating. Birkaç genler için deney transkript düzeyleri: nlp-29, nlp-30, cnc-1, ve cnc-5. </li><li> Yabani tip ya da mutant solucanlar üzerinde yaralama iğne yapın (protokolü 1) </li><li> İstenilen zamanlarda 50 yaralı solucanlar ve 50 yarasız solucanları (örneğin 3, 6, 24 saat) sonrası yaralama toplayın. </li><li> RNA, imalatçının talimatları izlenerek bir ticari kit kullanılarak ekstrakte edin. </li><li> Ticari ters transkriptaz kiti kullanılarak toplam 20 ul cDNA almak için ters transkripsiyon gerçekleştirin. </li><li> RT-PCR için, yeşil flüoresan ile Supermix ve 0.2 uM primerleri ile kombinasyon halinde her bir örnek 0.2 ul cDNA (1/40) kullanılır. RNA kalitesini karşılaştırmak için referans olarak ama,-1 veya SNB-1 RT-PCR kullanın; iç kontrol (ama-1 veya SNB-1) ile normalize tarafından AMP göreceli ifade seviyesini karşılaştırmak, veya norm (yaralı solucanlar / yarasız solucanlar AMP indüksiyon) kat indüksiyon sonrası yaralama karşılaştırmakİç kontrole alizing. NOT: cnc-1 ve cnc-5 olan transkripsiyon 10 yaralama aktive aile antimikrobiyal peptidler caenacin vardır. Tipik olarak, iğne yaralama ekspresyonunu indükler (~ CNC-1 için 500 kat), 4 saat 10 bir zaman boyunca. Yayınlanan çalışmalarında kullanılan primerler Tablo 2&#39;de listelenmiştir. </li></ol> 6. Deney Survival sonra Yaralama <ol><li> Not: Ca2 + bağımlıdır yara onarım yolağı ve doğal bağışıklık tepki yolunu: yaralanması epidermis içinde en azından iki bağımsız sinyal yolaklarını aktive eder. Her iki yollar steril yaralama tam yaşam için gereklidir. Bir mutant veya RNAi tedavi yara iyileşmesini etkileyen olup olmadığını sınamak için, 24-48 saat sonrası yaralama de hayatta ölçün. İsteğe bağlı olarak, uzun ömürlü 4,9 tarihinde yaralama etkisini belirlemek için geleneksel ömrü deneyleri kullanın. </li><li> (Genç yetişkin (L4 + 24 saat) solucanlar üzerinde 50 solucanlar yaralama iğne yapın, tekrar seveYukarıdaki protokol 1 Aşağıdaki ral kez). Kontrol olarak yarasız solucanlar eşdeğer sayıda koruyun. </li><li> Survival (Yeni ağar plaka her 24 saatte transfer yaralı solucanlar) her 24 saat kontrol edin. Böyle GTL-2 veya tir-1, normalize yarasız kontrol hayvanlara olarak yara tamir kusurlu mutantlar yaralama sonra% 50 sağkalım ~ 24 saat gözlemleyin. Ölüm solucan çekme ile dokunmak lokomotor yanıt eksikliği olarak tanımlanır. </li></ol>

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses.">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).</li><li>Xu, S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G&#945;q-Ca2++signaling+pathway+promotes+actin-mediated+epidermal+wound+closure+in+C.+elegans.">A G&#945;q-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans.</a> Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Chisholm, A. D., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+II:+differentiation+and+physiological+roles.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .</li><li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.+Methods+in+cell+biology.">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology.</a> 48, 225-250 .</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides.">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, (2008).</li><li>Tong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+Caenorhabditis+elegans+epidermal+damage+responses+by+death-associated+protein+kinase.">Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).</li><li>Zugasti, O., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+of+antimicrobial+peptide+expression+by+a+noncanonical+TGF-beta+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+epidermis.">Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis.</a> Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chip-based+C.+elegans+microinjection+system+for+investigating+cell-cell+communication+in+vivo.">Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo.</a> Biosensor., &amp; Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).</li><li>Jansson, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Conidia+of+Drechmeria+coniospora+to+Caenorhabditis+elegans+Wild+Type+and+Mutants.">Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants.</a> J Nematol. 26, 430-435 (1994).</li><li>Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bacterial+pathogen,+Microbacterium+nematophilum,+induces+morphological+change+in+the+nematode+C.+elegans.">A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans.</a> Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation.">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures.">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li></ol>

The authors are not aware of any competing interests.

iğne ve lazer yaraladığı Burada sunulan yöntemler hasarı onarmak için epidermal epitel yeteneğini değerlendirmek için tamamlayıcı yaklaşımlar sağlamak. Iğne yaralama epidermis, manikür, ve büyük olasılıkla iç bodrum zarlarını bozan ise Lazer yaralama, epidermise sınırlı olabilir nispeten lokalize ve (lazer konfigürasyonuna bağlı olarak) &#39;dir. İğne yaralama daha doğru patojenlerin veya doğal ortamda mekanik hasar sebebiyle ortaya çıkan yaraların benzeyebilir. Bir kural olarak, iğ...

Cilt yara iyileşmesi mekanizmaları temel biyolojik ilgi ve insan sağlığına uygun. Omurgalılar ve memelilerde yara iyileşmesi düzenli yanıt birçok dokuda ve 1 sinyal karmaşık bir dizi ihtiva eder. Birçok basit bir genetik model organizmalar da cilt yaraları 2 şifa yeteneğine sahiptir. Bu cilt yara onarım genetik uysal modellerini analiz nedenle ilgi olduğunu. Biz ve diğerleri cilt yara için yeni model 3,4 şifa olarak Caenorhabditis elegans kullanmaya başlamışlardır. Bu protokolün amacı C kullanmak için araştırmacıların geniş bir dizi sağlamaktır bir araç olarak elegans epidermal yara iyileşmesinin moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak. C. elegans cilt (ayrıca hipodermiste olarak da bilinir) epidermis ve dışı manikür 5 içermektedir. Yetişkin Epidermis büyük sinsityum k olan çok çekirdekli sinsitiyumların az sayıda oluşturulmaktadırnown olarak hyp7. Epidermis kendi apikal yüzeyinde manikür salgılar basit epitel olduğunu. Cilt aktif cilt-delici patojenlere karşı savunmak ve küçük yaralar 4 onarabilir. C yara onarımı elegans cilt tüm vahşi tip hayvanların iğne veya lazer radyasyonun sebep olduğu lokal deri hasarı nedeniyle küçük delici yaraları hayatta hayatta neredeyse, sağlamdır. C elegans cilt yaralama epidermal doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, yara kapama ve skar oluşumu 4 olmak üzere tepkilerin bir paketi, tetikler. Yetişkin Epidermis post-mitotik ve yara iyileşmesi, epidermal proliferasyonu veya hücre göçü karşı lokal hücresel yanıtları içerir. O cilt yaralanma membran TRPM kanal GTL-2 ve iç Ca 2 + mağaza 3 gerektiren, Ca 2 + epidermal büyük ve devamlı bir artış tetikler göstermiştir. Epidermal Ca 2 + sinyal F-aktin halkalarının oluşumuna ve kapatma wo için gerekli olanund sitesi. Yaralama ayrıca nlp-29 gibi amper transkripsiyonunu aktive doğuştan gelen bağışıklık yanıtları uyarır. amper yaralama kaynaklı transkripsiyon, bir TIR-1 epidermis 4 özerk hareket / PMK-1 p38 MAP kinaz kaskad bağlıdır. Ya Ca 2 + sinyal yolu ya da doğuştan gelen bağışıklık yanıtının kusurlar düşük sağkalım sonrası yaralama yol açacaktır. C nispeten basit bir yapı elegans epidermis, in vivo görüntüleme için genetik tractability ve avantajları yara onarım birden yönlerini incelemek için o mükemmel bir sistem yapmak. Iğne yaralama ve lazer yaralama: Burada yaralama iki ortak yöntemleri için protokolleri sunuyoruz. İğne yaralama (iğne çektirmenin dışında) hiçbir özel ekipman gerektirir ve tecrübesi ile günde solucanlar yüzlerce yapılabilir. İğne yaralanma agar plakaları üzerinde büyüyen hayvanlar üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bunun aksine, lazer yaralama Anes gerçekleştiriliranestezisi sağlanır hayvanlar bir lamel altında ped agar üzerine monte edilmiş ve hasara karşı hücresel yanıtların canlı görüntüleme için uygundur.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri plate</td><td>Tritech Research</td><td>T3308</td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>12 mM</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Worm pick (platinum wire)</td><td>Tritech Research</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>M9 solution</td><td>Home-made</td><td></td><td>3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Use 500 ml for 50 worms</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000/CFX96</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR tubes</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

C. elegans epidermis ve manikür yaralama kaynaklanan lokalize hasarı onarmak basit ama sofistike deri tabakası oluşturur. Bu modelde, yara cevaplarını ve onarım çalışmaları sitoskeletal ve doku hasarına genomik yanıtların anlamamıza ışıklı var. En sık kullanılan iki yöntemler C. yara elegans yetişkin deri mikroenjeksiyon iğneler, ve yerel laserler ile azabı vardır. Yerel yaralama İğne manikür, epidermis ve ilişkili dışı matriks bozan ve aynı zamanda iç dokularına zarar verebilir. Daha lokalize hasara lazer ışınlama ile sonuçlanır. Yaralama yüksek epidermal Ca 2+ (saniye-dakika), oluşumu ve yara yerinde (1-2 saat), antimikrobiyal peptit genlerin yüksek transkripsiyon bir aktin içeren halkanın kapatılması da dahil olmak üzere kolayca tahlil tepkilerin bir arkaya (2-24 tetikler saat), ve skar oluşumu. Esasen bütün vahşi tip yetişkin hayvanlar, nerede yaralama hayattayara onarımı veya diğer cevaplar kusurlu mutantlar olarak hayatta kalma azalma göstermektedir. Detaylı iğne ve lazer yaraladığı protokoller ve kantitatif ve yara tepkiler ve onarım süreçleri (Ca dinamikleri, aktin dinamikleri, antimikrobiyal peptit indüksiyon ve hayatta kalma) görselleştirme için testler sunulmaktadır.

Böyle GCaMPs gibi Ca sensörleri (Şekil 1) ile görüntülendi lazer veya iğne yaralama, epidermal Ca düzeylerinde hızlı ve sürekli yükseklik tetikleyecektir. Ca yükseklik saniye içinde oluşur ve birkaç dakika onlarca yükseltilmiş olarak kalır. Çoğaltılabilir yaralama İğne Yaralı sitelerde (Şekil 2), F-aktin halkaların oluşumu ile sonuçlanır; Bu dakika içinde görünür ve yaralama sonra yavaş yavaş yakın 1-2 saat üzerinde. Aktin halkaları daha az sıklı...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans at JoVE.com

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler<em&gt; ° C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

methods-for-skin-wounding-and-assays-for-wound-responses-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.3K Görüntüleme.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

Video: Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Nörobilim

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve<em&gt; In vivo</em&gt; Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Biyomühendislik

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Nematod Popülasyona Dayalı Kemoterapi Tercihi Testinin Otomatik Analizi

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Davranış

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96 oyuklu bir plaka içerisinde hücre gücü / yara iyileşme gerçekleştirmek için bir cihaz

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Gelişim Biyolojisi

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

Yara kaynaklı Poliploidizasyonu Incelemek için Bir Drosophila Modeli

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlük görüntüleme C. elegans bir havacilik aygıtı kullanma

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine models provide valuable mechanistic insight into these processes; however, no single model fully addresses all aspects of the wound healing response. Instead, it is ideal to use multiple models to address the different aspects of wound healing. Here, two different methods that address diverse aspects of the wound healing response are described. In the first model, polyvinyl alcohol sponges are subcutaneously implanted along the mouse dorsum. Following sponge retrieval, cells can be isolated by mechanical disruption, and fluids can be extracted by centrifugation, thus allowing for a detailed characterization of cellular and cytokine responses in the acute wound environment. A limitation of this model is the inability to assess the rate of wound closure. For this, a tail skin excision model is utilized. In this model, a 10 mm x 3 mm rectangular piece of tail skin is excised along the dorsal surface, near the base of the tail. This model can be easily photographed for planimetric analysis to determine healing rates and can be excised for histological analysis. Both described methods can be utilized in genetically altered mouse strains, or in conjunction with models of comorbid conditions, such as diabetes, aging, or secondary infection, in order to elucidate wound healing mechanisms.

Here, two murine wound healing models are described, one designed to assess cellular and cytokine wound healing responses and the other to quantify the rate of wound closure. These methods can be used with complex disease models such as diabetes to determine mechanisms of various aspects of poor wound healing.

Dorsal Subkutan Polivinil Alkol Sünger İmplantasyonu ve Eksizyonal Kuyruk Deri Yara Modelleri kullanılarak Akut Yara İyileşmesinin Değerlendirilmesi.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Tıp

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Biyoloji

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while protecting them from infection. Therefore, it is not surprising that the ability to repair epithelial wounds is critical to all metazoans. Epithelial wound healing in vertebrates involves overlapping processes, including inflammatory responses, vascularization, and re-epithelialization. Regulation of these processes involves complex interactions between epithelial cells, neighboring cells, and the extracellular matrix (ECM); the ECM contains structural proteins, regulatory proteins, and active small molecules. This complexity, together with the fact that most animals have opaque tissues and inaccessible ECMs, makes wound healing difficult to study in live animals. Much work on epithelial wound healing is therefore performed in tissue culture systems, with a single epithelial cell-type plated as a monolayer on an artificial matrix. Clytia hemisphaerica (Clytia) provides a unique and exciting complement to these studies, allowing epithelial wound healing to be studied in an intact animal with an authentic ECM. The ectodermal epithelium of Clytia is a single layer of large squamous epithelial cells, allowing high-resolution imaging using differential interfering contrast (DIC) microscopy in living animals. The absence of migratory fibroblasts, vasculature, or inflammatory responses makes it possible to dissect the critical events in re-epithelialization in vivo. The healing of various types of wounds can be analyzed, including single-cell microwounds, small and large epithelial wounds, and wounds that damage the basement membrane. Lamellipodia formation, purse string contraction, cell stretching, and collective cell migration can all be observed in this system. Furthermore, pharmacological agents can be introduced via the ECM to modify cell:ECM interactions and cellular processes in vivo. This work shows methods for creating wounds in live Clytia, capturing movies of healing, and probing healing mechanisms by microinjecting reagents into the ECM.

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

This paper describes a method to create wounds in the epithelium of a live Clytia hemisphaerica medusa and image wound healing at a high resolution in vivo. Additionally, a technique to introduce dyes and drugs to perturb signaling processes in the epithelial cells and extracellular matrix during wound healing is presented.

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler