Bu çalışma Sağlık Araştırma Faz 1 Klinisyen-Bilim İnsanı Ödülü (AG) bir Kanadalı Enstitüleri ve Kanser Araştırma Derneği (AG) Bir İşletim Grant tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu projenin onun desteği için Dr John Dick minnettarız.

Protokolünün şematik bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. 1.. İnsan HCC Numune işleme Yazılı hasta onayı ile ve kurumsal araştırma etik kurulunun onayı ile primer insan HCC örnekleri elde. Bu protokoller, insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallar ile uyumlu Üniversitesi Sağlık Ağı Araştırma Etik Kurulu onayı ile bizim kurumda yapılmıştır. Bir zamanlar uygun numuneler klinik amaçlar için alınmış cerrahi prosedürü izleyerek kısa sürede taze HCC örnekleri toplayın. İdeal olarak bu hastadan alınan doku çıkarıldıktan sonra 30 dakika içinde yer almalıdır. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, tümör merkezi bölümü nekrotik olabileceğinden, tümörün çevresinden elde edilen en az 1 cm 3 bir örnek, en uygunudur.Önce, radyasyon, kemoterapi ya da ablasyon gibi rezeksiyon herhangi bir tedavi almamış Tümörler tümör hücreleri, uygun olduğu şansını en üst düzeye çıkarmak için tercih edilmektedir. Biyolojik tehlikeli madde için standart kişisel koruyucu protokoller doğrultusunda temel insan dokuları işlemek. Aseptik teknikler kullanılarak bir sınıf II biyogüvenlik kabini içinde tümör dokuları ve hücre hazırlıkları tüm laboratuvar işlemlerini gerçekleştirmek. <ol><li> 4 ° C de 10-25 ml serum içermeyen Dulbecco Modified Eagle Medium / Ham &#39;s F12 içinde taze HCC örnek yerleştirin ve hemen işleme ve farelere yabancı-doku naklinde doku parçaları ve / veya hücrelerin hazırlanması için, laboratuvara buz üzerinde aktarın. </li><li> Steril forseps kullanılarak, 100 mm x 20 mm Petri kabı veya başka bir uygun steril bir çalışma sathında tümör numunesi yerleştirin. Bir No.10 cerrahi neşter bıçak kullanılarak yaklaşık olarak 2-3 mm 3 parça halinde tümör örnek bölün. Bu noktada, snap-donma ya da formalin-sabitleme s düşününgerektiği gibi ome tümör diğer deneyler için parçaları ya da analiz eder. </li><li> Tümör parçalarının Xenografting için, fragmanlar batık kalmasına izin vermek için yeterince Matrigel ihtiva eden bir ya da daha mikrosantrifüj tüpleri içine HCC parçalarının bir yerleştirin. Bu tüpler buz üzerinde tutun. </li><li> Bir tümör hücresi süspansiyonunun hazırlanması için, geri kalan HCC dokuya mümkün olduğunca kıyma ve kıyılmış doku hacmine bağlı olarak, 50 ml konik bir tüp içinde DMEM-F12, 5-10 ml ile karıştırmak için cerrahi bıçak neşter kullanmak. </li><li> Ml 200 birim / nihai konsantrasyonlarda kollajenaz tip IV ve dispaz II ekleyin ve 0.8 ünite / ml. 25 ml&#39;lik bir pipet kullanarak iyi yukarı ve aşağı karışımı pipetle. </li><li> Tüpü Seal ve tümör dokusunun yumuşaklık bağlı olarak, 30-60 dakika boyunca bir% 5 karbon dioksit kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de aşama 1.6&#39; dan karışımın inkübe edin. Enzimatik sindirim ilerlemeyi değerlendirmek kadar ve bir kaç kez, her 10 dk aşağı karışımı pipetle. </li><li> Di sonragestion 100 mikron hücre süzgecinden tümör çözüm geçmek tamamlandı. Yavaşça geçmesine tümör hücrelerinin sayısını sağlamak için bir 25 ml bir pipet kullanılarak hücre süzgecinden kalan doku püre. Bir 15 ml konik bir tüp içinde gergin hücre süspansiyonu toplayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1200 rpm&#39;de tümör hücre süspansiyonu santrifüj </li><li> Yavaşça süpernatant süzün. Pelet boyutuna bağlı olarak, buz gibi soğuk 1 x kırmızı kan hücresi (RBC) ml tampon lizis ve hafifçe yukarı aşağı pipet ve pelet tekrar süspansiyon 2-5 arası ekleyin. 5 dakika boyunca buz üzerinde tutun. </li><li> RBC liziz tamponu yıkamak için, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1000 rpm&#39;de 15 ml santrifüj bir toplam hacme DMEM-F12 ekleyin. </li><li> Yavaşça süpernatant süzün ve DMEM-F12, RBC-serbest tümör hücresi pelletini. </li><li> El ile veya otomatik bir hücre sayacı ile tripan mavi eksklüzyonu kullanılarak canlı hücreler sayılır. </li><li> İstenen numbe ihtiva eden santrifüj tümörü hücre tümbölenleriyukarıda tarif edildiği gibi enjeksiyon için hücrelerin r, elde edilen hücre buz soğukluğunda Matrigel 30 ul pelet, buz üzerinde mağaza yeniden süspanse edin. </li></ol> İsteğe bağlı: Aşama 1.11 sonra, rutin olarak kütle tümör hücresi süspansiyonu, insan CD45 + hücrelerinin (lökositler) tüketmek ve / veya akış sitometrisi veya immünomanyetik boncuklar kullanılarak tümör hücrelerinin alt kümelerini arındırmak. Bu tekniklerin ayrıntılı protokolleri de, ilgili antikorlar, taneler, ve akış sitometre üreticileri tarafından tarif edilmiştir. Not: Bu protokol, aynı zamanda, yukarıda tarif edilen aşama 1.1 &#39;de, primer insan HCC doku için ksenograft doku ikame seri nakli gerçekleştirmek amacıyla farelerden toplanan insan tümör ksenograftlarının işlemek için kullanılabilir. Bu durumda, aşama 1.11 sonra rutin fare histo-uyumluluk antijen H2k karşı bir antikor kullanılarak, hücre süspansiyonundan, murin hücreleri infiltre tüketir. 2.Xenografting Kurumsal hayvan bakımı komitesi tarafından onaylanan protokoller uyarınca tüm hayvan işlemleri yürütmek. Burada açıklanan prosedürler ilgili tüm düzenleyici ve kurumsal kurumları, yönetmelik ve yönergelere uygun ve uyumlu Üniversitesi Sağlık Ağı Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmış bir Hayvan Kullanımı Protokolü kapsamında tamamlanmıştır. Küçük hayvanlar için inhalasyon volatil anestezik ajanların teslimi için donatım hayvan tesis ve araştırma enstitüsü, standart operasyon prosedürlerine göre değerlendirilmelidir. Bir sınıf II biyogüvenlik kabini içinde aseptik teknik ve steril aletler kullanarak tüm cerrahi işlemleri yürütmek. Obez olmayan diyabetik şiddetli kombine immün yetmezliği kullanmaktadır (NOD / SCID) veya 6-8 haftada iki cinsiyetten farelerin NOD / SCID / IL-2 reseptör gama zinciri boş (NTG) suşları (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Bunlarfarenin bağışıklık yetersizliği olan hayvanlara uygun patojensiz şartlar sağlayabilen bir tesis içinde yer alır ve muhafaza edilmelidir. 1 L / oksijen dak% 5 (v / v) inhale Isoflurane temin odası içinde bir cerrahi için fareler hazırlayın. Kornea ve ayak refleks kaybı hayvan (lar) var kadar anestezi koruyun. Derialtı Xenografting için, hayvan (lar) sırtı üzerinde bir veya daha fazla küçük alanları tıraş ve% 70 etanol ile cildi temizlemek. Intrahepatik Xenografting için aşağı inguinal bölgeye aksillanın gelen hayvan (lar) ventral göğüs ve karın tıraş ve% 70 etanol ile cildi temizlemek. Tümör Fragments 2.1 deri altından implantasyonu <ol><li> Bir ağız parçası ile, teneffüs İzofluran anestezi (% 2 (v / v), 1 L / dak O 2) muhafaza eğilimli anestezi uygulanmış fare yerleştirin. Travmatik yaralanma hayvanın gözleri korumak için Tear-Jel uygulayın. </li><li> Betadine ile dorsal traş alan (lar) sterilizeCerrahi fırçalama,% 70 etanol, ardından ve son olarak povidon-iyot çözeltisi ile yıkanır. </li><li> Steril keskin bir makas kullanarak 5 mm deri kesi olun. </li><li> Yavaşça deri altı alanı içine kapalı bir kör makas yerleştirin ve bir tümör fragmanı içine alacak kadar geniş bir cep geliştirmek için hafifçe yayılır. </li><li> Steril ince pensler kullanılarak bir deri altı cep haline aşama 1.3 &#39;de hazırlanan tümör fragmanını yerleştirin. </li><li> Sütürler veya klips kullanarak cilt kesisi kapatın. </li><li> Aşağıda açıklandığı gibi fare postoperatif bakım sağlayın. </li></ol> Tümör hücrelerinin 2,2 Deri altına enjeksiyon <ol><li> Adımları 2.1.1 ve 2.1.2 &#39;de tarif edildiği gibi hayvan hazırlayın. </li><li> Iğne, bir 29 G 1/2 ile bir ensülin şırıngaya aşamasında hazırlanan 1.13 Matrigel tümör hücrelerinin süspansiyon yerleştirin. </li><li> Deri altı boşluk içine yerleştirin ve iğne şırınganın içeriğini boşaltmak. Uzakta derialtı düzlemi boyunca iğne birkaç milimetre fr ilerlemekom cilt delme yer iğnenin geri çekilmesi üzerine ponksiyon dışında tümör hücre süspansiyonu sızmasını önler. </li><li> Aşağıda açıklandığı gibi fare postoperatif bakım sağlayın. </li></ol> Tümör Fragments 2.3 Intrahepatik İmplantasyonu <ol><li> 1 ml şırınga iğne bir 27 G 1/2 kullanarak, intraoperatif sıvı kayıpları telafi etmek için anestezi hayvanın boyun sırtında steril normal tuz çözeltisi subkutan 350 ul yönetmek. Analjezi için, 1 ml şırınga üzerinde 27 G 1/2-in iğne kullanılarak, deri altına hayvanın kanadında steril serum fizyolojik içeren buprenorfin (0.1 mg / kg) 350 ul yönetmek. </li><li> Bakıma teneffüs Isoflurane anestezi (% 2 (v / v), 1 L / dak O 2) sunmak için ağız içine yerleştirilen, burun ve ağız ile önceden ısıtılmış bir ped üzerindeki fare sırtüstü yerleştirin. </li><li> Bacaklarda uzatmak ve pozlama ve optimize etmek için çalışma yüzeyine bant ile sabitleyinventral karın ve göğüs. </li><li> Görselleştirme optimize etmek için bir büyüteç lamba altında prosedürü uygulayın. </li><li> Ve son olarak povidon-iyot çözeltisi ile% 70 etanol ile takip Betadinede cerrahi fırçalama ile ventral karın ve göğüs üzerinde traş cildi sterilize edin. </li><li> Steril keskin bir makas kullanarak, çapraz bir ikili subcostal cilt kesi yapmak ve tüm karaciğer yeterli maruz izin periton boşluğuna girmek için kas tabakaları bölün. </li><li> Kılıç şeklinde işlem yukarıda deride bir dikiş yerleştirin ve karaciğer ve çevresindeki yapıların iyi poz olanak sağlamak amacıyla bant ile ağızlık sabitleyin. </li><li> Bunu dengelemek için karaciğere iki pamuk uçlu aplikatörler bitişik ve posterior kullanın. </li><li> Steril bir bisturi 10&#39;den bıçağı kullanılarak karaciğer yüzeyinde uzunluğu ve derinlemesine bir kesik 3 mm olun. </li><li> Hemen Surgicel ve Hemostaz sağlamak için kesi hafif bir basınç uygulamak; 60-90 sn sonra kaldırmakve tam hemostaz elde edilmiştir sadece devam. </li><li> Steril ince forseps veya 18 G iğne ile karaciğer kesi içine bir tümör fragmanı adım 1.3 yerleştirin. </li><li> Tümör fragmanının yer değiştirmesini önlemek ve devamı hemostaz sağlamak için karaciğer kesi üzerinde Surgicel küçük bir parça uygulanır. </li><li> Dikişlerle veya klipler ile kesi kapatın. </li><li> Aşağıda açıklandığı gibi postoperatif bakım sağlayın </li></ol> Karaciğer içine direkt enjeksiyon yoluyla Tümör Hücreleri 2.4 Intrahepatik İmplantasyonu <ol><li> Yukarıda 2.3.7 adımları 2.3.1 &#39;de tarif edildiği gibi fare hazırlayın. </li><li> Iğne, bir 29 G 1/2 kullanarak, bir ensülin şırıngaya tümör hücre süspansiyonu (adım 1.13 hazırlandı) yerleştirin. </li><li> Karaciğer bir pamuk uçlu aplikatör kullanılarak stabilize ile, karaciğer içine insülin şırınga iğne takın ve Öneri bir subkapsüler düzlem boyunca ponksiyon ötesinde birkaç milimetre ilerlemek. </li><li> Yavaşça şırınga ve t içeriğini boşaltmaktavuk karaciğer iğne kaldırmak. </li><li> Yeri ponksiyon üzerinde Surgicel ve tümör hücre süspansiyonu sızmasını önlemek için ve tam Hemostaz sağlamak için bir pamuk uçlu bir aplikatör ile hafif basınç uygulayın. </li><li> Dikişlerle veya klipler ile kesi kapatın ve aşağıda açıklandığı gibi ameliyat sonrası bakım sağlamak. </li></ol> Dalak içine enjeksiyon yoluyla Tümör Hücreleri 2.5 Intrahepatik Xenografting <ol><li> Yukarıdaki adımlar 2.3.5 2.3.1 &#39;de tarif edildiği gibi fare hazırlayın. </li><li> Steril keskin bir makas kullanarak, bir 1 cm periton boşluğuna girmek için subkostal kesi bıraktı olun. </li><li> Dalak açığa amacıyla cranially ve hayvanın sağ tarafına mide yansıtmak için bir pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. </li><li> Steril ince atravmatik forseps ile çevredeki yağ dokuları ele alarak, kesi içine dalak sağlamak ve bunu dengelemek için dalak arkasında bir pamuk uçlu bir aplikatör yerleştirin. </li><li> 5-0 ipek sütür, yer kullanarakalt kutup üzerinde dalak etrafında gevşek ön bağlı düğüm. </li><li> Iğne, bir 29 G 1/2 kullanarak, bir ensülin şırıngaya tümör hücre süspansiyonu (adım 1.13 hazırlandı) yerleştirin. </li><li> Dalak alt direğe insülin şırınga iğnesi yerleştirin ve gevşek ön bağlı düğüm seviyesine yanından ileri. </li><li> Yavaşça, şırınga içeriğini boşaltmak dalak iğne kaldırmak ve tümör enjekte edilen hücre süspansiyonu, herhangi bir sızıntıyı önlemek için düğüm sıkın. </li><li> Periton boşluğu içine dalak değiştirin. </li><li> Dikişlerle veya klipler ile kesi kapatın ve aşağıda açıklandığı gibi ameliyat sonrası bakım sağlamak. </li></ol> İnsan Tümör Doku Intrahepatik Aşı kolaylaştırılması için 2.6 Kısmi Hepatektomi <ol><li> 2.3.7 adımlar 2.3.1 &#39;de tarif edildiği gibi fare hazırlayın. </li><li> Steril keskin bir makas ile, karaciğer medyan lob bağlı falciform ligament bölün. </li><li> Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, seferbersol lob etrafında 5-0 ipek sütür karaciğer ve pozisyon gevşek bir ön bağlı düğüm sol lob. Sol lob bilio-vasküler pedikül doğru mümkün olduğunca yakın gevşek düğüm ilerlemek ve düğüm sıkın. </li><li> Düğüm ve sonraki kanama kaymasını önlemek için küçük bir güdük bırakarak, steril makas kullanılarak dikilen sol lob distalinden tüketim. </li><li> Benzer bir teknik kullanılarak, bağlanır ve safra kesesi kaçınarak, karaciğer medyan lob çoğunluğu rezeke. </li><li> Kullanım Surgicel ve tam Hemostaz sağlamak için karaciğer parankimi kesik yüzeyleri boyunca pamuk uçlu bir aplikatör ile hafif basınç. </li><li> , Bir tümör fragmanı ya da tümör hücrelerinin intrahepatik Xenografting için, yukarıda tarif edildiği gibi 2.4.5 adımlar 2.3.11 ya da 2.4.2 için 2.3.8 devam edin. </li><li> Dalak enjeksiyon yoluyla tümör hücrelerinin intrahepatik Xenografting için fuarlarında, yavaşça cranially ve hayvanın sağ tarafına mide yansıtmak için pamuk uçlu aplikatörler kullanmakdalak ng. Yukarıda tarif edildiği gibi 2.5.9 adımlar 2.5.4 devam edin. </li><li> Dikişlerle veya klipler ile kesi kapatın ve aşağıda açıklandığı gibi ameliyat sonrası bakım sağlamak. </li></ol> 2.7 Ameliyat Sonrası Bakım <ol><li> Inhalasyon anestezi ağızlık fareyi çıkarın. </li><li> Anestezi kurtarıldı ve tam harekete kadar yaklaşık 20 dakika boyunca bir ısı lambası altında bir kafeste fare yerleştirin. </li><li> Ilk 2-3 ameliyat sonrası gün boyunca buprenorfin dozunun her 8-12 saat tekrarlayın. </li></ol>

<ol>
	<li>El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 365, 1118-1127 (2011).</li><li>Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma:+insight+from+animal+models.">Hepatocellular carcinoma: insight from animal models.</a> Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).</li><li>Tateishi, R., Omata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+in+2011:+Genomics+in+hepatocellular+carcinoma--a+big+step+forward.">Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward.</a> Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).</li><li>Hoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+classification+and+novel+targets+in+hepatocellular+carcinoma:+recent+advancements.">Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements.</a> Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).</li><li>Ji, J., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+cancer+stem+cell+biology+in+hepatocellular+carcinoma.">Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma.</a> Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).</li><li>Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+therapies+for+hepatocellular+carcinoma:+a+critical+view+of+the+evidence.">Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+human+tumour+tissue+xenografts+in+immunodeficient+mice:+a+systematic+review.">Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review.</a> Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).</li><li>Sausville, E. A., Burger, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+human+tumor+xenografts+to+anticancer+drug+development.">Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development.</a> Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).</li><li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD/LtSz-scid+mice.">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> J. Immunol. 154, 180-191 (1995).</li><li>Ohbo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+hematopoiesis+in+mice+with+a+truncated+mutant+of+the+interleukin-2+receptor+gamma+chain.">Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain.</a> Blood. 87, 956-967 (1996).</li><li>Fiebig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vivo+imaging+of+the+murine+liver:+a+micro-computed+tomography-based+anatomical+study.">Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study.</a> PLoS One. 7, e31179 (2012).</li><li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cancer+cell+lines:+fact+and+fantasy.">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).</li><li>Yamashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem/progenitor+cell+features.">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-130b+Promotes+CD133(+)+liver+tumor-initiating+cell+growth+and+self-renewal+via+tumor+protein+53-induced+nuclear+protein+1.">miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1.</a> Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).</li><li>Park, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoangiogenesis+and+sinusoidal+"capillarization"+in+dysplastic+nodules+of+the+liver.">Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver.</a> Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).</li><li>Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+liver+drug+uptake+following+hepatic+artery+and+portal+vein+infusion.">Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion.</a> J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).</li><li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2/3+partial+hepatectomy+in+mice.">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).</li><li>Zhang, D. Y., Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis-dependent+mechanisms+of+hepatocarcinogenesis.">Fibrosis-dependent mechanisms of hepatocarcinogenesis.</a> Hepatology. 56, 769-775 (1002).</li><li>Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+solid+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice+are+vulnerable+to+lymphomagenesis+associated+with+Epstein-Barr+virus.">Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus.</a> PLoS One. 7, e39294 (2012).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bu deneysel sorular ve deneyleri geniş bir yelpazede uygulanabilir bağışıklık yetersizliği olan farelerde deri altından ve intrahepatik insan HCC ksenograftları kurmak için çeşitli teknikler tarif edilmiştir. Deri altı ksenograftlar yaygın HCC biyoloji çeşitli yönlerini incelemek için kullanılmış olsa da, intrahepatik xenografts nadiren literatürde tarif edilmiştir. Ayrıca, ksenograftlarının kullanımını anlatan çalışmaların çoğunluğu iyi kurulan hücre hatları bu yarattı. Insan tü...

Hepatosellüler karsinom (HCC), dünya çapında en sık görülen beşinci kanser ve Kuzey Amerika&#39;da kanser ölümlerinin en hızlı artan nedenidir. HCC için en yaygın bir risk faktörü, en sık kronik viral hepatit, alkol kullanımı, oto-bağışıklık hastalığı ya da kalıtsal metabolik bozukluklar 1 meydana gelen, karaciğer sirozu olan. Dünya nüfusu üzerinde HCC dayattığı ağır hastalık yükünün rağmen, HCC patofizyolojisi nispeten zayıf gibi kolorektal, meme veya prostat kanseri gibi diğer sık ​​görülen kanserlerle karşılaştırıldığında anlaşılmaktadır. Örneğin, tümörogenez sürüş spesifik moleküler ve hücresel olayları açıkça 2 tanımlanmalıdır kalır. Çoğu diğer katı epitel kanserleri gibi, genomik yaklaşımlar HCC 3 ile ilişkili aberasyonlarında heterojenliğini ortaya koymuştur. Bazı çalışmalar, hücre çoğalması, sur katılan sinyal yollarının çeşitli düzensiz aktivitesi ortaya koymuşturyaşamasının çok, farklılaşma ve anjiyogenez 4. Buna ek olarak, HCC patobiyolojisinde kanser kök hücrelerinin rolü 5 açıklık gerekmektedir. HCC patofizyolojisi sınırlı bir anlayış ile, HCC için etkili tedavilerin edevatı da nispeten sınırlı kalmıştır. Nüks yaygın olmasına rağmen karaciğere sınırlı tümörlerin erken evre hastalarda, tümör ablasyonu veya cerrahi rezeksiyon kullanılarak küratif tedavi için adaydırlar. Daha ilerlemiş hastalık, kemoterapi ve radyasyon olan hastalar için etkinliği sınırlı olan ve palyatif amaçla 6 ile hastalık kontrolü için öncelikle kullanılır. Insan HCC vivo deneysel modellerinde, yüksek kaliteli, böylece yeni terapötik yaklaşımlar değerlendirme için hem de insan HCC patofizyolojisi çok gerekli temel araştırma için değerli bir platform sağlar. Hücre çizgileri ya da yüksek tanımlı fare modellerinin kullanımı, PRI ksenograftlarının ile karşılaştırıldığındaonlar da 7,8 içinde ve farklı hastalar arasında mevcut heterojenliğini çekerken yüksek sadakat ile insan hastalığına recapitulating yetenekli beri immünyetmezligi farelerde mary insan tümörleri bu tür çalışmalar için değerli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu amaçla, bağışıklık yetersizliği olan farelerde insan HCC ksenograftları kurmak için çeşitli yöntemler geliştirdik. HCC ksenograftlarını ilgili yayınlanmış çalışmaların çoğunluğu bu amaçla köklü insan HCC hücre hatlarının kullanımını tarif ederken, biz hemen hastaların cerrahi sonrası elde edilen primer HCC örneklerden ksenograftlarını oluşturmak için bizim tahliller optimize odaklanmıştır. Farklı Xenografting teknikler farklı araştırma uygulamaları için gerekli olabilir. Örneğin, tümör fragmanlarından üretilen deri altı ksenograftlar, hızlı bir şekilde oluşturulur kolay bir şekilde kontrol edilir, ve uygun olan yeni terapötik maddelerin lokal uygulama için daha uygun olabilirtümör yanıtının izlenmesi. &lt;ntrahepatik Ksenogratflardır HCC biyoloji hepatik mikroçevresinin rolüne ilişkin çalışmalar için daha uygun olabilir. Tümör hücre süspansiyonu elde Ksenograftlar, tümör başlatıcı bir hücre alt tanımlanması ve karakterizasyonu için ya da önceden ksenonakli tümör hücrelerinin in vitro manipülasyon gerektiren uygulamalar için gerekli bulunmaktadır. Dolayısıyla gelişmiş ve primer insan HCC örneklerden elde edilen hücre süspansiyonları ya da tümör fragmanlarından deri altından ya da intrahepatik ksenograftları kurmak için aşağıdaki protokolleri onaylamıştır.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Mod. Eagle Medium/Ham's F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12)</td>
			<td>WISENT Bioproducts</td>
			<td>319-075-CL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase TypeIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Buffered Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1011-L8001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine surgical scrub</td>
			<td>Purdue Pharma</td>
			<td>NPN 00158313</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LORIS 10% PVP-I Solution</td>
			<td>LERNA Pharma Inc.</td>
			<td>109-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>M60302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear-Gel</td>
			<td>Novartis Pharmaceuticals</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen section compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95057-838</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold, Tissue -Tek</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide Needle 18G 1 &frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide Needle 27G &frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>305109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G&frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>309301</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade No.10</td>
			<td>Feather Safety Razor Co.</td>
			<td>08-916-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle</td>
			<td>Syneture</td>
			<td>VS-880</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore surgical tape</td>
			<td>3M Health care</td>
			<td>1577-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton applicator</td>
			<td>Medpro</td>
			<td>018-425</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgicel, oxidized regenerated cellulose</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1951</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 100 &mu;m nylon</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnification lighting with mobile base</td>
			<td>Benson medical Industries Inc.</td>
			<td>model: RLM-CLT-120V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish sterile 100x20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821474</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A10-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson dressing forcep 4-3/4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A10-220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye dressing forcep, serrated, straight, 4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A19-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A12-142</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor, curved, 4-1/4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A8-690</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor, straight, 4-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A8-684</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A17-228</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice

In vivo insan hastalığı recapitulate hepatosellüler karsinom (HCC) deneysel modeller hastalığın patofizyolojisi araştırma ve yeni tedavilerin klinik öncesi değerlendirilmesi için değerli bir platform sağlamak. Bu araştırma çeşitli uygulamalar yararlanılabilir bağışıklık yetersizliği olan farelerde, deri altından ya da ortotopik insan HCC ksenograftları üretmek için çeşitli yöntemler sunulmuştur. Bir başlangıç ​​noktası olarak cerrahi rezeksiyon yapılan hastalarda birincil tümör dokusunun kullanımı ile ilgili bir odak ile, yabancı-doku naklinde hücre süspansiyonları veya tümör fragmanlarının hazırlanmasını tarif etmektedir. Fare dalak hücreleri içine enjeksiyonu ile ya da dolaylı olarak ii) intrahepatically, ya da tümör hücreleri ya da fragmanlarının doğrudan implantasyon ile karaciğer içine, ya da, biz bu dokuları i) subkütan ksenograft için özel teknikler tarif eder. Ayrıca, bir strateji olarak Xenografting zamanda doğal fare karaciğer rezeksiyonu kısmi kullanımını tarifprimer insan tümör hücrelerinin, intrahepatik bütünleşmesini kolaylaştırabilir alıcı fare aktif karaciğer rejenerasyonu için bir durum ortaya çıkarmaktadırlar. Bu tekniklerin beklenen sonuçlar gösterilmektedir. Açıklanan protokolleri genellikle daha az sağlam literatürde yaygın olarak kullanılan ve sık sık atıf köklü insan HCC hücre hatları daha gerçekleştirmek birincil insan HCC örnekleri ve ksenograftlarını kullanılarak valide edilmiştir. Hücre hatları ile karşılaştırıldığında, biz xenotransplantasyon modellerinde birincil HCC engraftman nispeten düşük şans katkıda bulunmak ve ksenogreft büyüme kinetiği etkileyebilecek teknik konularda yorum yapabilir faktörleri tartışmak. Ayrıca, elde edilen xenografts doğru ana HCC dokuları benzer sağlamak için uygulanması gereken yöntemler önerir.

Şekil 3, bir subkutan insan HCC ksenograft ve tümörün histopatolojik mukabil bir görünüm tipik görünümünü göstermektedir. Deri altı ksenograftlarının gelişimi ve büyümesi kolayca alıcı farelerin günlük olarak muayene ile izlenebilir. Bir tümörün Xenografting ve kalkınma arasındaki zaman aralığı (doku tipi (hücre süspansiyonu vs tümör fragmanı), doku kaynağı (birincil hasta örneği, pasaj ksenogreft veya hücre hattı) ve implante doku miktarına bağlı olarak büy...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice at JoVE.com

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

Immünyetmezligi farelerde insan tümör ksenogratflardır kanser biyolojisi okumak için değerli araçlardır. Insan hepatoselüler karsinoma hücreleri ya da tümör fragmanlarından deri altı ve intrahepatik ksenograftları oluşturmak için özel protokolleri açıklanmıştır. Alıcı farede hepatektomiden tarafından uyarılan karaciğer rejenerasyon intrahepatik naklini kolaylaştırmak için bir strateji olarak sunulmuştur.

Bağışıklık yetersizliği olan farelere subkutan olarak ve intrahepatik insan hepatoselüler karsinoma ksenograftlarının Üretimi

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

generation-subcutaneous-intrahepatic-human-hepatocellular-carcinoma

Research

JoVE Journal

Medicine

35.8K Görüntüleme.  University Health Network.  Immünyetmezligi farelerde insan tümör ksenogratflardır kanser biyolojisi okumak için değerli araçlardır. Insan hepatoselüler karsinoma hücreleri ya da tümör fragmanlarından deri altı ve intrahepatik ksenograftları oluşturmak için özel protokolleri açıklanmıştır. Alıcı farede hepatektomiden tarafından uyarılan karaciğer rejenerasyon intrahepatik naklini kolaylaştırmak için bir strateji olarak sunulmuştur. 

Video: Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

C57BL/6J Fare Stromal Cells ve Karsinomu Hücreler Meme Nakli

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Tıp

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy and/or cytotoxic chemotherapy. To induce bladder cancer, C57BL/6 mice (MUC1.Tg and wild type) were treated orally with the carcinogen N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (OH-BBN) at 3.0 mg/day, 5 days/week for 12 weeks. To assess the effects of OH-BBN on serum cytokine profile during tumor development, whole blood was collected via submandibular bleeds prior to treatment and every four weeks. In addition, a MUC1-targeted peptide vaccine and placebo were administered to groups of mice weekly for eight weeks. Multiplex fluorometric microbead immunoanalyses of serum cytokines during tumor development and following vaccination were performed. At termination, interferon gamma (IFN-&#947;)/interleukin-4 (IL-4) ELISpot analysis for MUC1 specific T-cell immune response and histopathological evaluations of tumor type and grade were performed. The results showed that: (1) the incidence of bladder cancer in both MUC1.Tg and wild type mice was 67%; (2) transitional cell carcinomas (TCC) developed at a 2:1 ratio compared to squamous cell carcinomas (SCC); (3) inflammatory cytokines increased with time during tumor development; and (4) administration of the peptide vaccine induces a Th1-polarized serum cytokine profile and a MUC1 specific T-cell response. All tumors in MUC1.Tg mice were positive for MUC1 expression, and half of all tumors in MUC1.Tg and wild type mice were invasive. In conclusion, using a team approach through the coordination of the efforts of pharmacologists, immunologists, pathologists and molecular biologists, we have developed an immune intact transgenic mouse model of bladder cancer that expresses hMUC1.

An N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced bladder cancer model was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic mice for the purpose of testing MUC1-directed immunotherapy. After administering a MUC1-targeted peptide vaccine, a cytotoxic T lymphocyte response to MUC1 was confirmed by measuring serum cytokine levels and T-cell specific activity.

Bağışıklık Sağlam İnsan MUC1 Transgenik Farelerde İnvaziv Geçici Hücre Mesane Karsinomu indüksiyon: immünoterapi Kalkınma İçin Bir Model

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Oluşturma Anatomik Doğru ve İnsan Beyin Tümörleri Reproducible İntrakraniyal Ksenograftlar

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

<em&gt; Ovo</emHepatosellüler karsinom Verimli Xenograftlarında Modeli olarak&gt; Piliç Chorioallantoic Membran (CAM) Deneyi

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of infection-induced immunopathology. Although Th17 cells are implicated in antifungal defense, their role in immunopathology is unclear. This study presents a method for establishing oral Th17 immunopathology associated with oral candidal infection in immunodeficient mice. The method is based on reconstituting lymphopenic mice with in vitro cultured Th17 cells, followed by oral infection with Candida albicans (C. albicans). Results show that unrestrained Th17 cells result in inflammation and pathology, and is associated with several measurable read-outs including weight loss, pro-inflammatory cytokine production, tongue histopathology and mortality, showing that this model may be valuable in studying OPC immunopathology. Adoptive transfer of regulatory cells (Tregs) controls and reduces the inflammatory response, showing that this model can be used to test new strategies to counteract oral inflammation. This model may also be applicable in studying oral Th17 immunopathology in general in the context of other oral diseases.

Although Candida infection models are available to study host immune resistance, a model to study T cell mediated immunopathology in the context of Candida infection is absent. Here we describe a method to establish Th17 immunopathology associated with oral Candida infection in immunodeficient mice.

Immünyetmezligi Farelerde Orofaringeal kandidiyazis ve Th17 İltihabı Modeli

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

Bir &quot;Hasta gibi&quot; Ortotopik singenik Fare Modeli Hepatoselüler karsinomu metastazı

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 - 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Subcutaneous implantation of osmotic pumps provides a convenient approach for prolonged and consistent delivery of compounds. This approach has been used extensively to study both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice.

Ozmotik kullanarak Subkutan Anjiotensin II İnfüzyon Farelerde İndükler Aort anevrizmaları Pompalar

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying the mechanisms of normal and malignant hematopoiesis and are the gold standard for identifying effective chemotherapies for many malignancies. PDX models are possible because many of the mouse cytokines also act on human cells. However, this is not the case for all cytokines, including many that are critical for studying normal and malignant hematopoiesis in human cells. Techniques that engineer mice to produce human cytokines (transgenic and knock-in models) require significant expense before the usefulness of the model has been demonstrated. Other techniques are labor intensive (injection of recombinant cytokine or lentivirus) and in some cases require high levels of technical expertise (hydrodynamic injection of DNA). This report describes a simple method for generating PDX mice that have exogenous human cytokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) via weekly intraperitoneal injection of stroma that have been transduced to overexpress this cytokine. Use of this method provides an in vivo source of continuous cytokine production that achieves physiological levels of circulating human cytokine in the mouse. Plasma levels of human cytokine can be varied based on the number of stromal cells injected, and cytokine production can be initiated at any point in the experiment. This method also includes cytokine-negative control mice that are similarly produced, but through intraperitoneal injection of stroma transduced with a control vector. We have previously demonstrated that leukemia cells harvested from TSLP-expressing PDX, as compared to control PDX, exhibit a gene expression pattern more like the original patient sample. Together the cytokine-producing and cytokine-negative PDX mice produced by this method provide a model system that we have used successfully to study the role of TSLP in normal and malignant hematopoiesis.

Described here is a method for producing exogenous cytokine in patient-derived xenograft (PDX) mice via weekly intraperitoneal injection of a cytokine-transduced stromal cell line. This method broadens the utility of PDX and provides the option for transient or sustained exogenous cytokine delivery in a multitude of PDX models.

Hastadan türeyen Xenograftlarda Exogenous Cytokine&#39;in Sitokinle Transmurgated Stromal Hücre Hattı İle Enjeksiyon Vasıtasıyla İfade Edilmesi

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...