이 작품은 건강 연구 1 단계 임상의 과학자 상 (AG)의 캐나다 연구소와 암 연구 협회 (AG)에서 운영 보조금에 의해 지원되었다. 저자는이 프로젝트의 그의 지원을위한 닥터 존 딕에게 감사의 말씀을 전합니다.

프로토콜의 개략도는 그림 1에 제시되어있다. 1. 인간의 HCC 샘플의 처리 서면 환자의 동의와 기관 연구 윤리 보드의 승인을 인간의 기본 간암 검체를 얻습니다. 이러한 프로토콜은 인간의 복지에 대한 모든, 기관, 국가, 국제 가이드 라인을 준수 대학 건강 네트워크 연구 윤리위원회의 승인을 우리의 기관에서 수행되었다. 일단 적절한 샘플 임상 목적으로 촬영 한 수술 절차에 따라 가능한 한 빨리 신선한 HCC의 표본을 수집합니다. 이상적으로는이 환자의 조직을 제거 후 30 분 이내에 자리를 대신한다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 종양의 중앙부가 괴사 될 수 있으므로, 종양의 주변부로부터 얻어진 적어도 1cm 3의 샘플에서는, 최적이다.종래와 같은 방사선, 화학 요법, 또는 박리와 같은 절제에 어떤 처리를받지 않는 종양은 종양 세포가 생존 있다는 가능성을 최대화하기 위해 바람직하다. 생물학적 물질에 대한 표준 개인 보호 프로토콜에 따라 인간의 기본 조직을 처리합니다. 무균 기술을 사용하여 클래스 II 바이오 캐비닛 종양 조직 및 세포 제제의 모든 실험 조작을 수행. <ol><li> 4 ° C에서 10 ~ 25 ㎖의 혈청 둘 베코의 수정 이글 중간 / 햄의 F12에 신선한 HCC 샘플을 놓고 즉시 처리 및 마우스에 xenografting에 대한 조직의 조각 및 / 또는 세포의 준비를 위해 실험실로 얼음에 전송할 수 있습니다. </li><li> 멸균 집게를 사용하여, 100mm X 20mm 페트리 접시 또는 다른 적절한 멸균 작업 표면에 종양 샘플을 놓습니다. 10 번 수술 메스 블레이드를 사용하여 약 2 ~ 3 ㎜의 조각으로 종양 샘플을 나눈다. 이 시점에서, 스냅 동결 또는 포르말린 고정의 고려필요에 따라 오메 종양 다른 실험을위한 조각 또는 분석. </li><li> 종양 절편 xenografting 위해, 프래그먼트가 잠긴 남아 있도록 충분한 마트 리겔을 포함하는 하나 이상의 마이크로 원심 튜브에 HCC 단편의 일부를 배치. 얼음이 튜브를 유지합니다. </li><li> 종양 세포 현탁액의 제조를 위해, 나머지 HCC 조직에게 극력 말하다 및 다진 조직의 양에 따라서 50 ㎖ 원추형 튜브에 DMEM-F12 5-10 ㎖로 섞고 수술 메스 블레이드를 사용한다. </li><li> ML 200 단위 /의 최종 농도에 콜라게나 제 타입 IV와 디스 파제 II를 추가하고 0.8 단위 / ml로 각각. 25 ML 피펫을 사용하여 잘 아래로 혼합물을 피펫. </li><li> 튜브를 밀봉하고 종양 조직의 부드러움에 따라 30 ~ 60 분 동안 5 % 이산화탄소 배양기에서 37 ° C에서 1.6 단계에서 혼합물을 품어. 소화 효소의 진행 상황을 평가하기까지 몇 시간마다 10 분 아래로 혼합물을 피펫. </li><li> 디 후Gestion의는 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 종양의 솔루션을 전달 완료됩니다. 부드럽게 통과하는 종양 세포의 최대 수를 활성화하기 위해 25 ㎖ 피펫 팁을 사용하여 세포 고사에 남은 조직 매쉬. 15 ML 원뿔 관에서 변형 된 세포 현탁액을 수집합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 1,200 rpm에서 종양 세포 현탁액을 원심 분리기 </li><li> 조심스럽게 뜨는을 가만히 따르다. 펠렛의 크기에 따라, 차가운 얼음 1X 적혈구 (RBC)의 ML 버퍼를 용해하고 부드럽게까지 피펫 아래로 펠렛을 재현 탁 2-5를 추가합니다. 5 분 동안 얼음에 보관하십시오. </li><li> RBC의 용해 버퍼를 씻어 4 ° C에서 5 분 1,000 rpm에서 15 ㎖의 원심 분리기의 총 볼륨에 DMEM-F12를 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 가만히 따르다 및 DMEM-F12의 RBC없는 종양 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 수동 또는 자동 셀 카운터와 트리 판 블루 배제를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. </li><li> 원하는 번호 18를 포함하는 원심 분리기 종양 세포 분취상술 한 바와 같이 주사에 대한 세포의 연구는, 그 결과 세포 얼음처럼 차가운 리겔의 30 μL에 펠렛, 그리고 얼음 가게를 재현 탁. </li></ol> 선택 사항 : 단계 1.11 후에, 우리는 정기적으로 대량 종양 세포 현탁액에서 인간 CD45 + 세포 (백혈구)를 고갈 및 / 또는 유동 세포 계측법 또는 면역 자석 구슬을 사용하여 종양 세포의 하위 집합을 정화. 이러한 기술에 대한 자세한 프로토콜은 물론 관련 항체, 구슬, 흐름 세포 계측기의 제조 업체에 의해 설명되어 있습니다. 참고 : 프로토콜 상술 또한 단계 1.1에서 일차 인간 HCC 조직에 대한 이종 이식 조직을 대체 직렬 이식을 수행하기 위해 마우스로부터 수확 된 인간 종양 이종 이식을 처리하기 위해 사용될 수있다. 이러한 상황에서, 단계 1.11 후에, 우리는 일상적 마우스 조직 적합성 항원 H2K에 대한 항체를 사용하여 세포 현탁액에서 뮤린 세포 침윤 고갈. 2.Xenografting 기관 동물 관리위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 준수하는 모든 동물의 절차를 실시한다. 여기에서 설명하는 절차는 모든 관련 규제 및 제도 기관, 규정 및 지침에 따라 규격에 맞추어 대학 건강 네트워크 동물 관리위원회의 승인을 특정 동물 사용 프로토콜에 따라 완료되었습니다. 작은 동물에 흡입 휘발성 마취제의 전달을위한 장비는 동물 시설 및 연구 기관의 표준 운영 절차에 따라 사용되어야한다. 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 무균 기술과 무균 장비를 사용하는 모든 수술 절차를 수행합니다. 비만이 아닌 당뇨병 심한 결합 면역 결핍을 활용 (NOD / SCID) 또는 연령 6-8 주에 섹스를 하나의 마우스의 NOD / SCID / 인터루킨 2 수용체 감마 체인 널 (null) (NSG) 균주 (잭슨 연구소, 바 하버, ME) 9, 10. 이들생쥐는 면역 결핍 동물에 적합한 무균 조건을 제공 할 수있는 시설에 보관하고 유지해야합니다. 1 L / 산소의 분 5 % (V / V) 흡입 아이소 플루 란을 공급하는 실에서 수술을 위해 마우스를 준비합니다. 각막과 발가락의 반사 손실이 동물 (들)에있을 때까지 마취를 유지합니다. 피하 xenografting 들어 동물 (들)의 등쪽에있는 하나 이상의 작은 영역을 면도하고 70 % 에탄올로 피부를 정화. 간내 xenografting를 들어, 아래 서혜부에 겨드랑이에서 동물 (들)의 복부 흉부와 복부를 면도하고 70 % 에탄올로 피부를 정화. 종양 파편의 2.1 피하 주입 <ol><li> 마우스 피스 흡입 아이소 플루 란 마취 (2 % (V / V) 1 L에 / 분 O 2)를 유지, 경향 마취 마우스를 놓습니다. 외상성 부상에서 동물의 눈을 보호하기 위해 눈물 - 젤을 적용합니다. </li><li> 베타 딘으로 등쪽 면도 영역 (들)을 살균수술 스크럽은 70 % 에탄올 다음과 마지막으로 포비돈 - 요오드 용액. </li><li> 멸균 날카로운 가위를 사용 5mm의 피부 절개를합니다. </li><li> 부드럽게 피하 공간으로 폐쇄 무딘 가위를 삽입하고 종양 조각을 수용 할 수있을만큼 큰 포켓을 개발하기 위해 부드럽게 확산. </li><li> 살균 미세 집게를 사용하여 피하 주머니에 1.3 단계에서 제조 된 종양 조각을 삽입합니다. </li><li> 봉합 또는 클립을 사용하여 피부 절개를 닫습니다. </li><li> 아래에 설명 된대로 마우스로 수술 후 치료를 제공합니다. </li></ol> 종양 세포의 피하 주사 2.2 <ol><li> 단계 2.1.1와 2.1.2에 설명 된대로 동물을 준비합니다. </li><li> 바늘에 29 G 1 / 2 인슐린 주사기로 단계 1.13에서 제조 리겔에서 종양 세포의 현탁액을로드합니다. </li><li> 피하 공간으로 바늘을 삽입하고 주사기의 내용을 방출. 멀리 피하 평면을 따라 바늘을 몇 밀리미터 정도 FR 발전톰 피부 천자 사이트는 바늘의 철수에 따라 천자 사이트 중 종양 세포 현탁액의 누출을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 아래에 설명 된대로 마우스로 수술 후 치료를 제공합니다. </li></ol> 종양 파편의 2.3 간내 주입 <ol><li> 1 ML의 주사기에서 바늘에 27 G 1 / 2를 사용하여, 수술 유체 손실을 보상하기 위해 마취 된 동물의 목의 배부에 멸균 생리 식염수를 피하의 350 μl를 관리 할 수​​ 있습니다. 진통제를 들어, 1 ML의 주사기에 27 G의 2 인치 바늘을 사용하여 피하 동물의 측면에 멸균 생리 식염수를 포함하는 부 프레 노르 핀 (0.1 ㎎ / ㎏)의 350 μl를 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 유지 보수에게 흡입 아이소 플루 란 마취 (2 % (V / V) 1 L에 / 분 O 2)를 전달하기 위해 마우스 피스 내부에 위치 코와 입으로 미리 가열 패드에서 마우스 부정사를 놓습니다. </li><li> 사지를 확장하고 노출을 최적화하기 위해 운영면에 테이프로 고정복부 복부 및 흉부. </li><li> 시각화를 최적화하기 위해 돋보기 램프의 절차를 수행합니다. </li><li> 그리고 마지막으로 포비돈 - 요오드 용액과 70 % 에탄올 다음 베타 딘 수술 스크럽 복부 복부와 흉부에 면도​​ 피부를 소독. </li><li> 멸균 예리한 가위를 사용하여, 횡 방향 양측 subcostal 피부 절개를하고, 전체 간의 충분한 노출을 허용하도록 복강을 입력 근육층 나눈다. </li><li> 칼 모양의 과정 위의 피부에 스티치를 넣고 간장과 주변 구조의 더 나은 노출을 허용하기 위해 테이프로 마우스 피스에 고정. </li><li> 안정화에 간 두 면봉 인접 도포 및 후방을 사용합니다. </li><li> 멸균 제 10 메스 블레이드를 사용하여 간 표면의 길이와 깊이 절개 3mm를 확인합니다. </li><li> 즉시의 Surgicel 및 지혈을 달성하기 위해 절개 사이트에 약간 힘을 주어, 60 ~ 90 초 후에 제거완전한 지혈이 달성 된 경우에만 진행합니다. </li><li> 살균 미세 집게로 또는 18 G 바늘 간 절개로 종양 조각의 단계 1.3를 놓습니다. </li><li> 종양 조각의 변위를 방지하고 계속 지혈을 보장하기 위해 간 절개에의 Surgicel의 작은 조각을 적용합니다. </li><li> 봉합 또는 클립 절개를 닫습니다. </li><li> 아래에 설명 된대로 수술 치료를 제공 </li></ol> 간에 직접 분사를 통해 종양 세포의 2.4 간내 주입 <ol><li> 위의 2.3.7에 2.3.1 단계에서 설명한대로 마우스를 준비합니다. </li><li> 바늘 (29) G 1 / 2를 사용하여 인슐린 주사기에 종양 세포 현탁액 (1.13 단계에서 제조 된)을로드. </li><li> 간 코튼 팁 어플리케이터를 사용하여 안정화와 함께, 간장에 인슐린 주사기 바늘을 삽입하고 끝에게 낭하 평면을 따라 구멍 사이트 넘어 몇 mm를 진행. </li><li> 부드럽게 주사기 및 t의 내용 방전암탉은 간에서 바늘을 제거합니다. </li><li> 장소 구멍 사이트에의 Surgicel 종양 세포 현탁액의 유출을 방지하고 완전한 지혈을 달성하기 위해 면봉과 부드러운 압력을 적용합니다. </li><li> 봉합 또는 클립 절개를 닫고 아래에 설명 된대로 수술 치료를 제공합니다. </li></ol> 비장에 주입을 통해 종양 세포의 2.5 간내 Xenografting <ol><li> 위의 2.3.5 단계 2.3.1에서 설명한대로 마우스를 준비합니다. </li><li> 멸균 날카로운 가위를 사용하여, 1 cm의 복강을 입력 subcostal 절개를 왼쪽으로합니다. </li><li> 비장을 노출하기 위해 cranially과 동물의 오른쪽에 배를 반영하기 위해 면봉을 사용합니다. </li><li> 멸균 미세 atraumatic 집게로 주변의 지방 조직을 처리하여, 절개로 비장을 제공하고 안정화하기 위해 비장 뒤에 면봉을 배치합니다. </li><li> 5-0 실크 봉합사, 장소 사용폴 하부 위의 비장 주위에 느슨한 미리 묶어 매듭. </li><li> 바늘 (29) G 1 / 2를 사용하여 인슐린 주사기에 종양 세포 현탁액 (1.13 단계에서 제조 된)을로드. </li><li> 비장의 하부 기둥에 인슐린 주사기 바늘을 삽입하고 느슨한 미리 묶어 매듭의 수준 지나치을 사전. </li><li> 천천히 주사기의 내용물을 배출 비장​​에서 바늘을 제거하고 주입 된 종양 세포 현탁액의 임의의 누출을 방지하기 위해 매듭을 조인다. </li><li> 복강에 비장을 교체합니다. </li><li> 봉합 또는 클립 절개를 닫고 아래에 설명 된대로 수술 치료를 제공합니다. </li></ol> 인간의 종양 조직의 간내 생착을 촉진하기 위해 2.6 부분 간 절제술 <ol><li> 2.3.7에 단계 2.3.1에서 설명한대로 마우스를 준비합니다. </li><li> 멸균 날카로운 가위, 간장의 중간 엽에 부착 된 낫 모양의 인대를 나눕니다. </li><li> 면봉을 사용하여, 동원왼쪽 엽 주위에 5-0 실크 봉합사의 간 및 위치 느슨한 미리 묶어 매듭의 왼쪽 엽. 왼쪽 엽의 bilio 혈관 척추 경으로 가능한 한 가까운 느슨한 매듭을 진행하고 매듭을 조입니다. </li><li> 매듭 이후 출혈의 미끄러짐을 방지하기 위해 작은 그루터기를 떠나, 멸균 가위를 사용하여 합자에 왼쪽 엽 말단을 절제. </li><li> 유사한 기술을 사용하여, 결찰 및 담낭을 피하고, 간의 중간 엽의 대부분을 절제. </li><li> 사용의 Surgicel 완전한 지혈을 달성하기 위해 간 실질의 절단면을 따라 면봉과 부드러운 압력. </li><li> 종양 조각 또는 종양 세포의 간내 xenografting를 들어, 상기 한 바와 같이 2.4.5 단계 2.3.11 또는 2.4.2에 2.3.8를 진행합니다. </li><li> 비장 주입을 통해 종양 세포의 간내 xenografting를 들어, exposi 부드럽게 cranially과 동물의 오른쪽에 배를 반영하기 위해 면봉을 사용비장 겨. 상술 한 바와 같이 2.5.9에 2.5.4 단계를 진행합니다. </li><li> 봉합 또는 클립 절개를 닫고 아래에 설명 된대로 수술 치료를 제공합니다. </li></ol> 2.7 수술 후 관리 <ol><li> 흡입 마취 마우스 피스에서 마우스를 제거합니다. </li><li> 마취에서 회복 충분히 동원 할 때까지 약 20 분간 가열 램프 아래 새장에 마우스를 놓습니다. </li><li> 처음 2 ~ 3 일 동안 수술 후 부 프레 노르 핀 투여마다 8 ~ 12 시간을 반복합니다. </li></ol>

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E., Ghanekar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+solid+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice+are+vulnerable+to+lymphomagenesis+associated+with+Epstein-Barr+virus.">Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus.</a> PLoS One. 7, e39294 (2012).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 실험적 질문과 분석의 다양한 적용 할 수있는 면역 결핍 생쥐에 피하 및 간내 HCC 인간 이종 이식을 수립하는 다양한 기술을 설명 하였다. 피하 이종 이식이 널리 HCC 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 사용되었지만, 간내 이종 이식은 거의 문헌에 기술되지 않습니다. 또한, 이종 이식의 사용을 설명하는 연구의 대부분은 잘 확립 세포주에서 이들을 생성했다. 인간의 종양 생물학 (12)를 모델링에 암 세포 라인의 한계를 감안할 때, 우리는 인간의 기본 간암 조직을 사용하여 위에서 설명한 기술의 유효성을 검사하는 데 동기를 부여하고 있습니다. 때문에 실험 그룹의 작은 샘플 크기에 통계 분석에 의해 지원되지는 않지만, 우리의 관찰은 주관적으로 종양 세포 또는 조각의 간내 주입에 부분 간 절제술의 추가 개선 생착 속도를 향해 강력한 경향을 알 수있다. &lt;/ P&gt; 엄격하게 기본 조직을 활용하려고 시도한 몇 가지 연구는 13 ~ 15를 얻은 환자 샘플의 단지 아주 작은 비율로 성공적인 피하 생착을 달성했다. 또한 성공적으로 상기 기술을 이용하여 면역 결핍 마우스의 피하 공간에 생착 일차 인간 HCC 샘플의 비율은 약 15 %로 제한되어 있음을 관찰 하였다. 인간의 간에서, HCC 병변 간장 동맥 (16, 17)을 통해 주로 그들의 혈액 공급을 받고, 혈관성이다. 우리는 우리와 다른 사람이 관찰 차 HCC 조직의 낮은 생착 속도가 그들이 설립 동맥 공급하지 않고, 이종 이식되는에 미세 환경의 상대적 저산소증에 신선한 HCC 조직의 취약성의 결과가 될 수 있다는 것을 추측. 수술 적 절제와 xenografting 사이의 간격의 빠른 허혈성 괴사 HCC 조직의 감수성도 기 술의 수마우스에 달성 낮은 생착 속도에 대한 NT. 종양 세포 현탁액에서 간내 인간 HCC 이종 이식의 생성을 위해, 우리는 비장에 세포의 주입은 인간의 기본 HCC 샘플에서 간 생착의 우수한 속도 결과 기술적으로 유리한 방식입니다 것으로 나타났습니다. 비장 더 마우스 체내에서 다른 사이트에 비해서 HCC 세포를 지원할 수도 높게 혈관 구조이며, 종양 세포는 용이 비장 및 포털 정맥을 통해 간으로 여행 나타나는부터. 직접 누설이나 출혈없이 세포를 주입하는 것은 기술적으로 곤란하다 처 간 실질과 비교하여, 비장 주입되는 세포 현탁액의 양을 수용하기위한 구조적인 용량을 갖고 쉽게 결찰 될 수있는 한 종양 세포 주입 완료됩니다. 직접 6~8주 된 생쥐의 문맥이나 간동맥에 세포 현탁액의 주입은 기술적으로 feas 없습니다호 환. 우리는 인간의 간암 조직의 간내 생착을 촉진하기 위해받는 생쥐의 부분 간 절제술을 이용했다. 부분 간 절제술의 마우스 모델이 널리 간 중생 (18)의 생물학을 연구하는 데 사용되었지만, 우리는 간내 종양 이종 이식과 함께 그것을 설명하는 보고서를 인식하지 못합니다. 간 재생이 부분 간 절제술 후 처음 몇 일 이내에 신속하게 발생하기 때문에, 우리는 간 실질 조직 내에서 세포 분열과 혈관 자극의 크게 향상된 표현이 더 나은의 나머지 부분에서 이식 취약한 인간의 종양 조직 또는 세포의 생착과 확산을 지원하는 것이라고 추측 마우스 간, 그 「휴식」상태 (19)에서 마우스의 간와 비교. 인간, HCC의 개발을위한 가장 큰 위험 요인은 조직을 파괴없이 재생의 개발이 특징입니다 간 섬유증 또는 간경변, 전진dules하고있는 만성 간 손상 및 재생 (20)의 상태로 몇몇에 의해 개념화되었다. 우리가 간 재생을 활성화하여 마우스 간에 인간의 간세포 암 조직을 합치다 입증 한 기술은 HCC의 병태 생리에 간 미세 환경과 간 재생 메커니즘의 역할에 대한 조사를 허용 할 수있는 가치있는 모델이 될 증명할 수 있습니다. 본 명세서에 기재된 기술은 면역 결핍 마우스에서 고품질 일차 인간 HCC 이종 이식편을 생성 할 수 있지만, 이러한 프로토콜의 사용을 염두 조사자는 모델의 몇 가지 제한을 고려해야한다. 첫째, 우리의 프로토콜은 아직 도전을 유지하고 높은 생착 속도를 달성, 환자 조직의 수술 적 절제와 실험실에서의 후속 처리 사이의 최소한의 지연을 포함, 이것은이 기술의 가능한 구현에 환자 조직 수거 장소의 근접을 필요로하는 것이 좋습니다신선한 표본의 전송 지연을 최소화 할 수있는 실험실, 또는 인프라. 이종 이식이 형성되기 전에 두 번째로 6 ~ 8 주 된 면역 결핍 쥐에 복잡한 복강 내 수술은 몇 달 동안 동물의 생존을 달성하기 위해 적절히 훈련 된 인력에 의해 수행되어야하며 이러한 절차 이후의 동물 관리는 시간을 모두하고 자원 집약적. 셋째, 간내 이종 이식의 개발 및 진행, 위에서 설명 된대로 분석의 몇 가지 유형이 위치에 이종 이식의 유용성을 제한하는 소정의 timepoints에서 동물을 희생하지 않고도 모니터링 할 수 없습니다. 또한, 비장에 세포의 주입에서 파생 된 간내 이종 이식은 정확하게 전체 종양 부담의 측면에서 정량화하기 어려운 간 실질 곳곳에 여러 개의 결절을 제시 할 수 있습니다. 마지막으로, 비장 세포로의 주입으로 인한 간내 종양 결절이 선택할 수 있다는 것을주의하는 것이 중요하다ively 간 이후 종양 개시에 비장에서 마이그레이션 할 수있는 세포의 특정 부분 모집단을 반영합니다. 인간의 기본 간암 조직에서 이종 이식을 생성 할 때, 그 결과 이​​종 이식은 HCC 닮은 있는지 확인하는 것도 중요합니다. 우리는 이전 림프종 실수 xenotransplanted 인간 간암 조직 (21) 내에 승객의 백혈구에서 발전 할 수 있음을 증명하고있다. 따라서 우리는 일상적으로 기본 종양 세포 현탁액에서 인간 CD45 + 백혈구를 고갈 및 RT-PCR을 이용, 세포 계측법, 조직 병리학 적 평가를 흐르게하고, HCC의 전형적인 특성을 이종 이식을 분석 실험에 면역. 추가 연구를 위해 설립 된 이종 이식을 계대 때, 종양 침투 쥐의 세포는 또한 마우스 조직 적합성 항원 H2K에 대한 항체를 사용하여 소모해야한다. 연구 응용 종양 단편의 사용 또는 이종 이식의 성장의 측정 xenogra의 분석을 포함하면연구 종점에서 FTS는 종양이 인간 백혈구와 마우스 세포에 의해 침투되는 정도에 대한 평가를 포함해야한다.

간세포 암 (HCC)은 전 세계적으로 다섯 번째로 가장 흔한 암과 북미에서 암 사망의 가장 빠르게 증가하는 원인이다. HCC에 대한 가장 일반적인 위험 인자는 가장 자주 만성 바이러스 성 간염, 알코올 남용,자가 면역 질환, 또는 유전성 대사 장애 1로 발생, 간경변입니다. 세계 인구에 HCC에 의해 부과 된 무거운 질병 부담에도 불구하고, HCC의 병태 생리는 상대적으로 저조한 같은 대장, 유방, 전립선 암과 같은 다른 일반적인 암에 비해 이해된다. 예를 들어, 종양 구동 특정 분자와 세포 사건 깨끗이이 정의 될 남아. 다른 대부분의 고체 상피 암과 마찬가지로 유전 방식은 HCC 3와 관련된 수차의 이질성을 공개했다. 다수의 연구는 세포 증식, 쉬르에 관련된 신호 전달 경로의 다양한 무질서 활동을 밝혀vival, 분화 및 혈관 4. 또한, HCC의 한테 진찰 Pathobiology 암 줄기 세포의 역할은 5를 명확히하도록 남아있다. HCC의 병태 생리의 제한된 이해를 바탕으로, HCC에 대한 효과적인 치료의 armamentarium에도 상대적으로 제한된 남아있다. 재발은 일반적이지만 간장에 국한 종양과 초기 단계의 환자는 종양 절제술 또는 수술 적 절제를 사용하여 치료 치료를위한 후보입니다. 고급 질병, 화학 요법과 방사선 환자에 대한 제한 효능하고 완화 의도 6 질병 관리에 주로 사용됩니다. 인간의 HCC의 생체 실험 모델에서 고품질, 따라서 새로운 치료 방법의 평가뿐만 아니라 인간의 간세포 암의 병태 생리에 많이 필요한 기초 연구를위한 가치있는 플랫폼을 제공합니다. 세포주 또는 고도로 정의 마우스 모델의 사용, PRI의 이종 이식에 비해그들은 또한 7,8 내에서 다른 환자들 사이에 존재하는 이질성을 캡처하는 동안 높은 정확도와 인간의 질병을 recapitulating 할 수 있기 때문에 면역 결핍 생쥐의 메리 인간의 종양은 연구를위한 유용한 도구로 등장했습니다. 이를 위해, 우리는 면역 결핍 쥐에 인간의 간세포 암 이종 이식을 설정하는 다양한 방법을 개발했습니다. HCC 이종 이식과 관련된 발표 된 연구의 대부분은 이러한 목적 노포 인간 HCC 세포주의 사용을 설명하지만, 우리는 즉시 환자의 수술 적 절제 후의 일차 HCC 표본에서 이종 이식편을 생성하기 위하여 분석을 최적화에 초점을 맞추고있다. 다른 xenografting 기술은 서로 다른 연구 응용 프로그램에 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 종양의 조각에서 생성 피하 이종 이식은 빠르게 생성을 쉽게 모니터링하고, 편리과 새로운 치료제의 로컬 관리를위한 더 적합 할 수있다종양 반응의 모니터링. 간내 이종 이식은 HCC 생물학의 간 미세 환경의 역할에 관한 연구에 대한 더 많은 관련이있을 수 있습니다. 종양 세포 현탁액에서 생성 된 이종 이식 종양을 시작하는 셀의 서브 세트의 식별 및 특성 또는 종래 이종 이식 종양 세포의 체외 조작에 필요로하는 실험이 필요하다. 따라서 우리는 개발 및 기본 인간 HCC 표본에서 파생 된 세포 현탁액 또는 종양 조각에서 피하 또는 간내 이종 이식을 설정하기 위해 다음과 같은 프로토콜을 확인했다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Mod. Eagle Medium/Ham's F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12)</td>
			<td>WISENT Bioproducts</td>
			<td>319-075-CL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase TypeIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Buffered Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1011-L8001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine surgical scrub</td>
			<td>Purdue Pharma</td>
			<td>NPN 00158313</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LORIS 10% PVP-I Solution</td>
			<td>LERNA Pharma Inc.</td>
			<td>109-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>M60302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear-Gel</td>
			<td>Novartis Pharmaceuticals</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen section compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95057-838</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold, Tissue -Tek</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide Needle 18G 1 &frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide Needle 27G &frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>305109</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G&frac12;</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>309301</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade No.10</td>
			<td>Feather Safety Razor Co.</td>
			<td>08-916-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle</td>
			<td>Syneture</td>
			<td>VS-880</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore surgical tape</td>
			<td>3M Health care</td>
			<td>1577-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton applicator</td>
			<td>Medpro</td>
			<td>018-425</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgicel, oxidized regenerated cellulose</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1951</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 100 &mu;m nylon</td>
			<td>Becton-Dickinson Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnification lighting with mobile base</td>
			<td>Benson medical Industries Inc.</td>
			<td>model: RLM-CLT-120V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish sterile 100x20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821474</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A10-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson dressing forcep 4-3/4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A10-220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye dressing forcep, serrated, straight, 4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A19-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A12-142</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor, curved, 4-1/4"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A8-690</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor, straight, 4-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A8-684</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2"</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>A17-228</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice

생체 내에서 인간의 질병을 요점을 되풀이 간세포 암 (HCC)의 실험 모델은 질병의 병태 생리에 대한 연구 및 새로운 치료법의 전임상 평가를위한 가치있는 플랫폼을 제공합니다. 우리는 연구 다양한 애플리케이션에 이용 될 수있는 면역 결핍 생쥐에 피하 또는 동소 인간 HCC 이종 이식편을 생성하는 다양한 방법을 제시한다. 출발점으로 절제술을받은 환자에서 일차 종양 조직의 사용에 초점을 제외한 xenografting위한 세포 현탁액 또는 종양 단편의 제조를 기술한다. 마우스 비장 세포에 주입에 의해 간접적으로 또는 II) intrahepatically, 하나 종양 세포 또는 조각을 직접 주입하여 간으로, 또는, 우리는이 조직 I) 피하 이종 이식 특정 기술에 대해 설명합니다. 또한 전략으로서 xenografting시 네이티브 마우스 간 부분 절제술의 사용을 설명일차 인간 종양 세포의 생착 간내을 용이하게 할 수있다받는 마우스에서 활성 간 재생의 상태를 유도한다. 이러한 기술의 예상 결과가 설명된다. 설명하는 프로토콜은 일반적으로 덜 견고 문헌에 널리 사용되는 자주 인용된다 노포 인간의 간세포 암 세포주에 비해 수행하는 인간의 기본 HCC 샘플 및 이종 이식을 사용하여 검증되었다. 세포 라인에 비해, 우리는 이종 이식 모델에서 기본 HCC의 생착의 상대적으로 낮은 기회에 기여하고 이종 이식 성장의 반응 속도에 영향을 미칠 수있는 기술적 인 문제에 대한 의견 수있는 요소에 대해 설명합니다. 우리는 또한 얻은 이종 이식 정확하게 부모 HCC 조직과 유사하도록 적용 할 방법을 제안한다.

그림 3은 피하 인간 HCC 이종 이식 종양의 해당 조직 학적 모양의 전형적인 모습을 보여줍니다. 피하 이종 이식의 발전 및 성장을 용이하게받는 마우스의 일상 시험에 의해 모니터링 될 수있다. 종양 xenografting 개발 간의 시간 간격은 (조직의 유형 (세포 현탁액 대 종양 단편), 조직의 소스 (주 환자 샘플, 계대 이종 또는 세포주) 및 이식 조직의 양에 따라서 크게 다를 수 세포의 수 또는 종양 조각의 크기). 6 개월 얻어 1 × 10 5 세포에서 유사한 이종 이식의 발전을 위해해야 할 수도 있습니다 예를 들어, 상당한 크기의 이종 이식은 1 ~ 2 주 이내에 잘 설립 간세포 암 세포주의 5 × 10 6 세포의 주입에서 개발할 수 있습니다 기본 HCC 환자 샘플에서. 우리는 implantatio 6 개월 후 이후에 피하 이종 이식의 형성을 관찰하지 않은종양 샘플의 n 및 이종 이식이 개발하지 않은 경우, 따라서이 평가시기에받는 사람의 쥐를 희생. 도 4는 간 종양 조직으로의 직접 이식에서 달성 간내 HCC 인간 이종 이식의 전형적인 모습을 보여뿐만 아니라 비장으로 종양 세포의 주입에서 달성 것과. 종양이 매우 크거나 복수 또는 복부 팽만의 개발 결과 않는 간내 이종 이식은 쉽게받는 마우스의 일반적인 신체 검사에 의해 감지 할 수 없습니다. 이러한 CT 스캔 등의 작은 동물 영상 기법은 일부 연구 기관에서 사용할 수 있으며, 정확하게받는 사람 마우스 (11)의 간을 심문하기 위해 이용 될 수 있지만, 우리는이 대부분의 연구자를위한 널리 적용 할 수있는 실제적인, 또는 비용 효과적인 접근 방법을 고려하지 않습니다. 우리는 간내 이종 이식편을 개발하는 속도는 subcutaneo되는 속도 유사하다는 것을 관찰우리는 개발 이종 이식과 마찬가지로 같은 유형, 소스 및 이식 조직의 양 같은 변수에 의해 영향을 받는다. 큰 간내 종양의 명확한 기록이 이전에 존재하지 않는 간내 이종 이식에 사용 된 것과 동일한 상위 조직에서 파생 된 피하 이종 이식의 성능을 바탕으로, 우리는받는 사람의 마우스와 간 검사의 희생에 대한 평가시기를 선택합니다. 우리는 이용 간내 xenografting 절차에 부분적 간절 제의 첨가는 쥐 간에서의 인간 종양 조직의 생착을 달성 확률을 향상 시키지만, 이종 이식의 성장 속도를 촉진하는 것 같지 않음을 관찰 하였다. 표 1은이 프로토콜에 설명 된 다른 기술을 사용하여 면역 결핍 쥐에서 인간의 기본 간암 조직의 주입 후 달성 종양 생착 속도를 요약 한 것입니다. 각 주입 방법의 경우, 종양의 인출 속도의 분모는 고유 잡음을 반영<html> HCC 샘플. 이러한 데이터는 인간의 기본 간암 조직을 위해, 피하 생착 속도가 intrasplenic 종양 세포 주입 또는 간내 종양 조각 주입에 의해 달성 간내 생착의 비율 열등, 입증, 그 부분 간 절제술은 간내 생착을 향상시키기 위해 나타납니다. 우리가 성공적으로 잘 확립 인간 HCC 세포주 (데이터 미도시)까지 간내 이종 이식편을 생성하는 마우스 간장에 직접적인 세포 주입을 이용했지만, 우리는 부분 간절 제의 사용에도 불구하고 인간의 기본 HCC 샘플을 이용하여이 방법에 대한 어떤 간내 이종 이식편을 생성하지 않은 . <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50544/50544fig1.jpg" /> 그림 1. 처리 및 HCC 샘플의 준비뿐만 아니라 이후의 xenografting 옵션 (삽입)를위한 워크 플로우를 설명 프로토콜의 개요도. 544fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 간세포 암종 환자에서 간 절제술의 표본.이 환자는 종양에 대한 보조 치료를받지 못했습니다. 흰색 상자는 xenografting에 얻은 주변에 가까운 종양의 실행 가능한 부분을 나타냅니다. 오른쪽 상단의 스케일 바는 1cm에 해당합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50544/50544fig3.jpg" /> 그림 3. 종양 세포의 피하 주사에서 생성 된 인간 간세포 암종 이종 이식. A) 종양이 용이 종양 동물을 희생 후 주위 조직과 구별 될 보이는 동물. B)의 오른쪽 측면에서 평가 될 수있다. C) 종양의 조직 학적 핵 비정 형성 및 높은 핵 - 투 - 세포질 비율, 포털 책자의 부재, 그리고 DIST와 간세포와 같은 세포를 포함한 간세포 암의 전형적인 특징을 보여줍니다간세포 판의 두께를 증가와 orted trabeculae. 스케일 바는 1 패널에있는 ㎝, B, 및 패널 C에서 100 μm의에 해당한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50544/50544fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50544/50544fig4.jpg" /> 그림 4. 간내 인간의 간세포 암 이종 이식. 마우스의 간에서 인간의 종양 조각의 주입에서 생성 A) 이종 이식. 뇌실질 내 종양은 검은 색 화살표로 표시. 부분 간 절제술 다음 마우스의 비장의 인간 종양 세포의 주입에서 생성 cm. B) 이종 이식에있는 사진의 하단에있는 통치자의 규모. 뇌실질 내 종양은 검은 색 화살표로 표시. 스케일 바는 1cm에 해당합니다. C) 조직학 섹션을 간내 이종 이식 demonstrat의 여백을 통해(오른쪽 아래) 사람의 간세포 암종 및 인접 정상 쥐의 간 (왼쪽)의 전형적인 특징을 보내고. 스케일 바는 100 μm의에 해당한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50544/50544fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> 주입 사이트 </td><td> 주입 방법 </td><td> 종양 포획 평가 </td></tr><tr><td> 피하의 </td><td> 세포 현탁액 </td><td> 55분의 6 (10.9 %) </td></tr><tr><td></td><td> 종양 조각 </td><td> 136분의 23 (16.9 %) </td></tr><tr><td> 비장 </td><td> 세포 현탁액 </td><td> 15분의 3 (20 %) * </td></tr><tr><td></td><td> 세포 현탁액 + 부분 간 절제술 </td><td> 14분의 6 (42.9 %) * </td></tr><tr><td> 간 </td><td> 종양 조각 </td><td> 13분의 6 (46.2 %) </td></tr><tr><td></td><td> 종양 조각 + 부분 간 절제술 </td&gt; <td> 2 / 3 (66.7 %) </td></tr><tr><td></td><td> 세포 현탁액 </td><td> 수행되지 </td></tr><tr><td></td><td> 세포 현탁액 + 부분 간 절제술 </td><td> 0 / 13 (0 %) </td></tr><tr><td colspan="2"> * 간내 종양 결절이 나왔고 샘플 비율 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 다른 주입 기술에 대응하는 면역 결핍 쥐에서 인간의 HCC의 생착 속도.

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Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

면역 결핍 쥐에서 인간 종양 이종 이식은 암 생물학을 연구하는 중요한 도구입니다. 인간의 간세포 암 세포 또는 종양 파편에서 피하 및 간내 이종 이식을 생성하는 특정 프로토콜이 설명되어 있습니다. 받는 사람 생쥐의 부분 간 절제술에 의해 유도 된 간 재생은 간내 생착을 촉진하기위한 전략으로 제시된다.

면역 결핍 마우스의 피하 및 간내 인간의 간세포 암 이종 이식의 생성

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

generation-subcutaneous-intrahepatic-human-hepatocellular-carcinoma

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

35.9K 조회수.  University Health Network.  면역 결핍 쥐에서 인간 종양 이종 이식은 암 생물학을 연구하는 중요한 도구입니다. 인간의 간세포 암 세포 또는 종양 파편에서 피하 및 간내 이종 이식을 생성하는 특정 프로토콜이 설명되어 있습니다. 받는 사람 생쥐의 부분 간 절제술에 의해 유도 된 간 재생은 간내 생착을 촉진하기위한 전략으로 제시된다. 

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Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

C57BL/6J 마우스의 Stromal 셀 및 암종 세포 이식 내유

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

연구

의학

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Dual-phase Cone-beam Computed Tomography to See, Reach, and Treat Hepatocellular Carcinoma during Drug-eluting Beads Transarterial Chemo-embolization

The advent of cone-beam computed tomography (CBCT) in the angiography suite has been revolutionary in interventional radiology. CBCT offers 3 dimensional&#160;(3D) diagnostic imaging in the interventional suite and can enhance minimally-invasive therapy beyond the limitations of 2D angiography alone. The role of CBCT has been recognized in transarterial chemo-embolization (TACE) treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). The recent introduction of a CBCT technique: dual-phase CBCT (DP-CBCT) improves intra-arterial HCC treatment with drug-eluting beads (DEB-TACE). DP-CBCT can be used to localize liver tumors with the diagnostic accuracy of multi-phasic multidetector computed tomography (M-MDCT) and contrast enhanced magnetic resonance imaging (CE-MRI) (See the tumor), to guide intra-arterially guidewire and microcatheter to the desired location for selective therapy (Reach the tumor), and to evaluate treatment success during the procedure (Treat the tumor). The purpose of this manuscript is to illustrate how DP-CBCT is used in DEB-TACE to see, reach, and treat HCC.

Dual-phase cone-beam computed tomography (DP-CBCT) is a useful intraprocedural imaging technique for transarterial chemo-embolization treatment with drug-eluting beads of hepatocellular carcinoma. DP-CBCT has been used to perform three major steps in oncologic interventional radiology: tumor localization (see), navigation and intraprocedural catheter guidance (reach), and intraprocedural evaluation of treatment success (treat).

The advent of cone-beam computed tomography (CBCT) in the angiography suite has been revolutionary in interventional radiology. CBCT offers 3 ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy and/or cytotoxic chemotherapy. To induce bladder cancer, C57BL/6 mice (MUC1.Tg and wild type) were treated orally with the carcinogen N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (OH-BBN) at 3.0 mg/day, 5 days/week for 12 weeks. To assess the effects of OH-BBN on serum cytokine profile during tumor development, whole blood was collected via submandibular bleeds prior to treatment and every four weeks. In addition, a MUC1-targeted peptide vaccine and placebo were administered to groups of mice weekly for eight weeks. Multiplex fluorometric microbead immunoanalyses of serum cytokines during tumor development and following vaccination were performed. At termination, interferon gamma (IFN-&#947;)/interleukin-4 (IL-4) ELISpot analysis for MUC1 specific T-cell immune response and histopathological evaluations of tumor type and grade were performed. The results showed that: (1) the incidence of bladder cancer in both MUC1.Tg and wild type mice was 67%; (2) transitional cell carcinomas (TCC) developed at a 2:1 ratio compared to squamous cell carcinomas (SCC); (3) inflammatory cytokines increased with time during tumor development; and (4) administration of the peptide vaccine induces a Th1-polarized serum cytokine profile and a MUC1 specific T-cell response. All tumors in MUC1.Tg mice were positive for MUC1 expression, and half of all tumors in MUC1.Tg and wild type mice were invasive. In conclusion, using a team approach through the coordination of the efforts of pharmacologists, immunologists, pathologists and molecular biologists, we have developed an immune intact transgenic mouse model of bladder cancer that expresses hMUC1.

An N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced bladder cancer model was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic mice for the purpose of testing MUC1-directed immunotherapy. After administering a MUC1-targeted peptide vaccine, a cytotoxic T lymphocyte response to MUC1 was confirmed by measuring serum cytokine levels and T-cell specific activity.

면역 본래대로 사람 MUC1 유전자 변형 마우스의 침략 과도 셀 방광 암의 유도 : 면역 요법 개발을위한 모델

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

만들기 해부학 적으로 정확하고 인간의 두뇌 종양의 재현 두개 내 이종 이식

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

<em&gt; 비켜에서</em간세포 암의 효율적인 이종 이식 모델로&gt; 병아리 융모 막 (CAM) 분석

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of infection-induced immunopathology. Although Th17 cells are implicated in antifungal defense, their role in immunopathology is unclear. This study presents a method for establishing oral Th17 immunopathology associated with oral candidal infection in immunodeficient mice. The method is based on reconstituting lymphopenic mice with in vitro cultured Th17 cells, followed by oral infection with Candida albicans (C. albicans). Results show that unrestrained Th17 cells result in inflammation and pathology, and is associated with several measurable read-outs including weight loss, pro-inflammatory cytokine production, tongue histopathology and mortality, showing that this model may be valuable in studying OPC immunopathology. Adoptive transfer of regulatory cells (Tregs) controls and reduces the inflammatory response, showing that this model can be used to test new strategies to counteract oral inflammation. This model may also be applicable in studying oral Th17 immunopathology in general in the context of other oral diseases.

Although Candida infection models are available to study host immune resistance, a model to study T cell mediated immunopathology in the context of Candida infection is absent. Here we describe a method to establish Th17 immunopathology associated with oral Candida infection in immunodeficient mice.

면역 결핍 마우스의 구인두 칸디다증의 Th17 염증 모델

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

&quot;환자와 같은&quot;동소 이식 동계 마우스 모델 간세포 암의 전이

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 - 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Subcutaneous implantation of osmotic pumps provides a convenient approach for prolonged and consistent delivery of compounds. This approach has been used extensively to study both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice.

삼투압을 이용하여 피하 안지오텐신 II 주입 쥐에서 유도 대동맥 동맥류 펌프

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...