Bu çalışma, NIH R01EY020560-01 ve WM Keck Tıp Araştırma Ödülü Genç Bilim İnsanı tarafından finanse edildi. Yazarlar retina hazırlıkları ve enjeksiyonlar görüntüleme sırasında Joseph Bedont yaptığı yardım için teşekkür etmek istiyorum.

1. Plazmid elektroporasyon için hazırlık Elektroporasyon için gerekli olan DNA konsantrasyonu 5μg/μl. Bu genellikle istenen plazmid çalışma miktarda DNA saflaştırma ve konsantrasyon takip Maxi-hazırlık (Qiagen) veya eşdeğer yöntemi kullanılarak amplifiye gerektirir. Çalışma miktarda DNA hazırlık aşağıdaki adımları açıklar. <ol><li> Kısım DNA 100 mikrogram (Maxi-hazırlık veya eşdeğeri) ve manipülasyon kolaylığı için 100 mcL hacmi sulandırmak. </li><li> Fenol ekleyin; fenol miktarı yaklaşık% 60 DNA / hacim oranı (mg DNA: toplam hacim) elde etmek için hesaplanmış olmalıdır yani: 100 mikrogram DNA (100 mcL) artı 67 mcL fenol (100 mikrogram: 167 mcL). Iyice karıştırın, bu DNA aşırı kesme neden olabilir pipet ve aşağı yukarı yok. </li><li> DNA 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 14000 RPM Spin. </li><li> Süpernatant toplayın ve aynı DNA kullanarak kloroform ekleyin: adım 1.2 &#39;de toplam hacim oranı; karışımı olarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 14000 RPM adım 1.2 ve spin. </li><li> Süpernatantı toplayın, DNA çözümü için% 10 supernatant hacim 3 M sodyum asetat ekleyin, hafifçe karıştırın ve 2,5 X supernatant% 100 etanol hacmi ekleyin. Tersine çevirerek karıştırın. DNA karıştırma sırasında çözüm çökelek olmalıdır. </li><li> 14000 RPM 10 dakika DNA 4 ° C dönerler. </li><li> 4% 70 etanol 350 ul, 5 dakika 14000 RPM dönmesi ile durulayın ° C. </li><li> Hava kuru pelet sonra 5μg/μL 1 X PBS (Hücre biyolojisi grade) DNA çözülür. PBS içine çok zor çözülür yapacak örnek overdry etmeyin. </li><li> DNA çözüm Fast Yeşil boya (% 10 hisse), boya son konsantrasyonu bir enjeksiyon tracer olarak hareket etmeye,% 0.1 &#39;dir. </li></ol> 2. Subretinal DNA enjeksiyonu Aşağıdaki adımlar bir stereomikroskopta yardımı ile yapılır. Bir kez uygulanan göz açma, kesi ve enjeksiyon işlemi düzgün anestezi kurtarmak için bir yavru için yeterli zamanı değil en az 1,5 dakika sürer. Keskin bir 30-gauge iğne kullanarak, erimiş junctional epitel (Şekil 1C) boyunca keserek dikkatlice göz açın. Bu, altta yatan bir göz kesme neden olabilir gibi aşırı kuvvet uygulamayın. Bu enjeksiyon belirsiz olabilir kanama sonucu olarak, göz kapağı kavşak aralığının dışında kesim kaçının. <ol><li> Bu ölüm neden olabilir (Şekil 1A) için birkaç dakika buz üzerinde yeni doğmuş farelerin anestezisi, buz yavrular gömmek yok. Buz üzerinde zaman uzunluğu, yavru, genellikle 5 dakika yavru yeterli ancak bireylerin çok hızlı bir şekilde cevap verebilir veya uygun anestezi sağlamak için uzun pozlama gerekebilir fareler dikkatle izlenmelidir değişkendir. Geri çekilme refleksi kontrol etmek için hemostat bir pençe tutam gerçekleştirin. </li><li> Subretinal alana DNA enjeksiyonu kolaylaştırmak amacıyla göz açılmalıdır. Swab% 70 izopropil alkol hazırlık (Tyco sağlık) ile enjekte edilen ve iki göz kapaklarını bir araya gelip (Şekil 1B) erimiş junctional epitel belirlemek için göz. </li><li> Keskin bir 30-gauge iğne kullanarak, erimiş junctional epitel (Şekil 1C) boyunca keserek dikkatlice göz açın. Bu, altta yatan bir göz kesme neden olabilir gibi aşırı kuvvet uygulamayın. Bu enjeksiyon belirsiz olabilir kanama sonucu olarak, göz kapağı kavşak aralığının dışında kesim kaçının. </li><li> Künt uçlu enjeksiyon iğnesi kornea ile birleşme sklerasına (Şekil 1E) yakınlarındaki küçük bir kesi yapmak 30-guage iğne ucu göz penetrasyonunu kolaylaştırmak için. Bu objektif bir delinmeye neden olabileceği için çok derinden nüfuz etmeyin. </li><li> Her bir enjeksiyon (Exmire mikroenjektör; Ito corp iğne dış çapı 0.52 mm, iç çapı 0.13 mm) için ayrı ayrı hacmini ölçmek için şırınga gradyanlar kullanarak 33 göstergesi künt sona erdi enjeksiyon iğnesi 0.3 ul DNA çözüm çizin. Skleral duvara karşı direnç hissedilir kadar iğne kesi içine yerleştirin. Iğne vitre odası (Şekil 2B) geçerken objektif nüfuz önlemek için dikkatli olun. </li><li> 0.3 ul DNA çözüm, yavaş yavaş şırınga pistonu bastırmak için işaret parmağı ve başparmak kullanarak subretinal boşluğa enjekte edilir. Deneyci DNA çözüm subretinal boşluğa enjekte edilir oranı DNA çözümü subretinal alanı (Şekil 2C) içinde yayılır hangi hızda geride kalmaması, piston depresyon hızını kontrol etmek için dikkatli olmak gerekir . Bu DNA enjekte ediliyor ya da eşit yayılmasını sonucu olarak iğne skleral duvara karşı çok sıkı basıldığında değildir ki önemlidir, böylece DNA çözüm viskoz. Başarılı bir enjeksiyon bile neden olacaktırsubretinal boşluğa bir kısmını DNA çözüm yayılmıştır. Enjekte hayvan dönen ve yeşil tracer altında yatan olmadan Bölgeler retinanın belirgin olmalıdır. </li></ol> 3. Elektroporasyon <ol><li> Elektroporasyon 10 mm çapında cımbız elektrot (BTX Aletleri Model # 522) kullanılarak yapılır. Hayvan elektrot elektrik iletkenliği en üst düzeye çıkarmak ve pozitif kutuplu elektrot bitişik enjekte göz ve negatif kutupta bitişik olmayan enjekte göz ile elektrot arasındaki enjekte yavru baş koyun için PBS içinde cımbız elektrot Soak elektrot (Şekil 3B). </li><li> Bir darbe jeneratörü kullanarak beş kare darbeleri uygulayın: Her darbe bakliyat arasında 950 milisaniye aralığı ile 80 volt ve süresi 50 milisaniye. </li><li> Buz anestezi kurtarmak kadar electroporated yavrular artık ısınmış olması gerekir. Bu yavrular bir ısınma lambası altında ya da sıcak bir slayt üstüne koyarak yapılabilir. Eğer sıcak bir slayt kullanarak metal yüzey ve kurtarma yavru arasında uygun bir ped yerleştirildiğinden emin olun. Kurtarma üzerine electroporated yavrular annelerinin dönün. </li></ol> 4. Gözleri analiz için hazırlanması <ol><li> Electroporated retina toplama ve analiz, deney amaçları için yapılır. GFP ifade elektroporasyon 3 gün sonra kabaca görüntülenmiştir olabilir. Cryoembedding ve şu şekilde devam kesit. </li><li> Istenilen timepoint electroporated hayvanların Kurban. Electroporated göz Disect ve 4% 4 paraformaldehid düzeltmek ° C&#39;de 50 dakika. </li><li> Sklera, kornea, lens, koroid ve retina pigmente epitel uzak mikro diseksiyon göz retinanın dikkatlice çıkarın. Floresan altında diseke retina kabaca elektroporasyon etkinliğini belirlemek için analiz edilebilir. 4 gecede% 30 sakaroz çözeltisini retina transfer ° C </li><li> Freeze retina içine Ekim cryo gömme medya (Sakura Finetek ABD) ve mağaza -80 ° C Retinanın kesitli bir kriyotom ve cam slaytlar üzerine yakalanan olabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Elektroporasyon (P3) ve Şekil 4 elektroporasyon (P14) takip eden 14 gün sonra 3 gün plazmid pCAG-EGFP bir ifade ile electroporated P0 yenidoğan retina örnekleri sunulmaktadır. Electroporated retina dokusunun alan deney subretinal boşluğa DNA çözüm yayılma enjeksiyon ve düzgünlüğü sırasında ortaya çıkan doku hasarı ölçüde bağlı deney değişken. Genelde% 90-100 electroporated retina, başarılı bir şekilde kurulmuş ve piyasaya plazmid ifade hücrelerin yer alacak. Ancak, doku morfolojisi ve elektroporasyon verimliliği electroporated retina sadece% 40-60 faktoring karşılaştırmalı bir analiz için uygun olacaktır. Rozet oluşumu ve retina dekolmanı iğne penetrasyon yerinde hemen hemen her zaman görülmektedir ve bu bölgede analiz için kullanılmamalıdır. Başarılı DNA, rozet ve dekolmanı iğne penetrasyon site lateral verimli electroporated doku mikroenjeksiyon sonuçları sırasında yayılmıştır. Gliozis, ayrıca önemli bir deneysel sorundur ve neredeyse her zaman iğne penetrasyon yerinde meydana gelir. Ancak, rozet oluşumu ve retina dekolmanı ile, gliozis yanal electroporated doku genellikle önemli değildir. Glial fibriller asidik protein (GFAP) gibi immünohistokimyasal belirleyicileri analiz bölgelerde reaktif gliozis düzeyleri kabul eşikleri giren olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Kesitli retina electroporated retinanın morfolojisi sağlam ve EGFP ifade etiketleri bireysel electroporated hücreleri sunulmaktadır kaldığını göstermektedir. Örnekler, P0 elektroporasyon (Şekil 4D-F) aşağıdaki P0 elektroporasyon (Şekil 4A-C) ve 14 gün sonra 3 gün sunulmaktadır . P3 retina, retina neuroblastic tabakası (NBL) electroporated hücrelerinin çoğunluğu bulunan ve herhangi bir retina (Şekil 4B, C) ​​farklılaştırılmış nöral veya glial hücrelerin farklı morfolojik özellikleri göstermek yok . P14 electroporated hücreleri dış nükleer tabaka (onl) ve retinanın iç nükleer tabaka (INL) bulunabilir. Ayrıca çeşitli etiketli hücreleri INL, fotoreseptör ve Müller glia internöronlar (Şekil 4E, F) de dahil olmak üzere farklılaşmış nöronların karakteristik morfolojik işaretlerinden gösterilecek. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 (P0) yeni doğmuş bir yavru fare ve DNA çözüm subretinal enjeksiyon için göz açılış Anestezi. A) Yenidoğan yavru yerleştiriliranesthetization için ezilmiş buz bir yatak. Enjekte edilecek Göz buz karşı aşağı yerleştirilir. B) göz kapaklarının erimiş junctional epitelin yerini (B ok) Göz açılması için kesilecek. C) erimiş junctional epitel (C, ok) birlikte göz kapaklarının göz maruz Kesme. D) açıldı göz erimiş kavşağında kesme. E) künt sona erdi mikro-enjeksiyon şırınga kolay ekleme bir kesi kolaylaştırmak için göz kornea altındaki sklerasına altında yapılır. Ölçek barlar, B, C, D, E: 4mm. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Künt Şekil 2 Eklemesi subretinal boşluğa mikro-enjeksiyon şırınga ve DNA plazmid çözüm enjeksiyon sona erdi. A) Karikatür şematik subretinal boşluğa şırınga ucu göz ve yerleşim içine mikro enjeksiyon şırınga doğru ekleme göstermektedir. Vitreus odasına DNA çözüm enjeksiyon, göz lensin içine soket veya enjeksiyon yoluyla şırınga geçişi, herhangi bir electroporated hücreleri eğer birkaç başarısız deneyler neden olacaktır. B) subretinal boşluğa şırınga ucu skleral duvar ve yerleşim yapılan kesi içine şırınga Penetrasyon. C) Enjeksiyon subretinal boşluğa DNA çözümü. Ölçek barlar, B, C: 4mm. Kısaltmalar aşağıdaki gibidir: R-retina, L-lens, V-vitreus, SRS subretinal alan, BES-künt şırınga sona erdi. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 elektroporasyon için fare üzerine cımbız elektrot Oryantasyon. A) Karikatür şematik electroporated göz göre cımbız elektrot pozitif ve negatif kürekler yönünü göstermektedir. Yeşil subretinal boşluğa enjekte DNA konumunu temsil eder. Kesikli oklar pozitif elektrot doğru negatif yüklü enjekte DNA&#39;nın elektroforetik hareketi temsil eder. DNA elektroforez pozitif elektrot yönelik retina içine negatif elektrot bitişik subretinal alan oluşur. B) cımbız olumlu kürek göz microinjected ve negatif kürek olmayan enjekte göz bitişik yerleştirilen DNA bitişik yerleştirilir. C) Yüksek yenidoğan fare cımbız elektrot yerleştirme büyütme görüntü. Kesikli çizgiler, pozitif elektrot doğru DNA&#39;nın elektroforetik hareket yönünü temsil eder. Ölçek bar, C: 5mm. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4 Yenidoğan fare retina (P0) pCAG-EGFP electroporated ve doğum sonrası 3. günde (P3) ve doğum sonrası 14. günde (P14) analiz. AC) P0 pCAG-EGFP ile electroporated kesitli P3 retinanın Konfokal görüntüler. Electroporated hücrelerinin çoğunluğu, retina neuroblastic tabakası (NBL) oturun. (DF) P0 pCAG-EGFP ile electroporated kesitli P14 retinanın Konfokal görüntüler. Electroporated hücreleri dış nükleer tabaka (onl) ve retinanın iç nükleer tabaka (INL) tespit edilebilir. Ölçek Barlar, AF: 50 mm.

<ol>
	<li>Neumann, E., Rosenheck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+changes+induced+by+electric+impulses+in+vesicular+membranes.">Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).</li><li>Turnbull, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Letter:+Letter:+An+alternate+explanation+for+the+permeability+changes+induced+by+electrical+impulses+in+vesicular+membranes.">Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).</li><li>Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+ion+flow+in+Escherichia+coli+B+and+electrical+sizing+of+bacterias.">Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias.</a> Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).</li><li>Kinosita, K., Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-induced+pore+formation+and+hemolysis+of+human+erythrocytes.">Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pias3-dependent+SUMOylation+directs+rod+photoreceptor+development.">Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development.</a> Neuron. 61, 234-246 (2009).</li><li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+hormone+receptor+ERRbeta+controls+rod+photoreceptor+survival.">The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).</li><li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Core+Paired-Type+and+POU+Homeodomain-Containing+Transcription+Factor+Program+Drives+Retinal+Bipolar+Cell+Gene+Expression.">A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression.</a> J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li></ol>

In vivo elektroporasyon DNA ifade plazmid ile retina hücrelerinin dönüşümü için hızlı ve etkili bir yöntem temsil eder. Bu yöntem, deneyci ektopik yayg ifade organizatörü kontrolü altında bir ilgi gen tanıtan veya ilgi gen hedefleme shRNA yapıları kullanarak fonksiyon testleri kaybı gerçekleştirmek için fonksiyon testleri kazanç gerçekleştirmek için olanak sağlar. Ayrıca, birden fazla DNA plazmid deneyci birden fazla genin etkilerini analiz etmek veya ilgi ikinci bir gen tanıtan bir...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Tampon Fenol Doymuş </td><td> Invitrogen </td><td> 15513-039 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> JT Baker </td><td> 9180-03 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Sodyum Asetat </td><td> JT Baker </td><td> 3470-05 </td><td> 3 M stok </td></tr><tr><td> Hızlı Yeşil FCF </td><td> Fisher Biotech </td><td> BP123-10 </td><td> % 10 hisse senedi </td></tr><tr><td> Izopropil alkol Hazırlık </td><td> Tyco Healthcare </td><td> 6918 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 30-guage iğne </td><td> Terumo Tıp Corp. </td><td> SG2-3013 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Exmire mikroenjektör </td><td> Ito Corporation&#39;ın </td><td> MS * E05 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Tweezertrode (cımbız elektrot) </td><td> BTX Instrument, Genetronics Inc. </td><td> 522 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Electro Meydanı Porator (Elektroporatör) </td><td> BTX Instrument, Genetronics Inc. </td><td> ECM 830 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Ekim Bileşik </td><td> Sakura Finetek ABD </td><td> 4583 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of developing mouse retina

Memeli retina gelişimi sırasında genlerin fonksiyonel karakterizasyonu önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Gen fonksiyonu tırnakları kurucu veya koşullu kaybı üretmek için hedef maliyet ve yoğun emek, zaman alıcı gibi kalır. Bu zorluklara ek olarak, retinaya bir nakavt yaklaşımı kullanılarak genler, retina dışında istenmeyen boşa giden temel rolleri olabilir dile getirdi. Ayrıca, hücre kaderinin şartname ve / veya terminal farklılaşma önemli bir rol tanımlamak için çalışırken ektopik fonksiyon deney bir kazanç bir gen ifade etme yeteneği son derece değerli olabilir. Biz elektroporasyon yenidoğan fare retina içine DNA plazmid hızlı ve verimli bir ortaklık için bir yöntem mevcut. 1,2,3,4 membran boyunca malzeme transferi kolaylaştıran plazma zarının geçirgenliğini geçici bir artış belirli bir alan şiddeti sonuçları üzerinde kısa elektrik darbeleri, uygulama. Çığır açan çalışma elektroporasyon yüksek ücret DNA&#39;nın çift katlı lipid 5 üzerinden geçişine izin veren hidrofilik plazma membran gözeneklerin oluşumunu uyararak memeli hücrelerine gen transferi bir yöntem olarak kullanılmaktadır olabilir göstermiştir. Sürekli teknik gelişme, retina, burada 6, 7, 8, 9, 10 olduğu yöntemi de dahil olmak üzere birden fazla fare dokularda in vivo gen transferi için bir yöntem olarak elektroporasyon canlılığı sonuçlandı. DNA&#39;nın yenidoğan (P0) fare ve elektrik sinyalleri retina pigmente epitel ve retina arasına yerleştirilir, böylece DNA&#39;nın bir cımbız elektrot kullanarak çözüm uygulanan subretinal boşluğa enjekte edilir. Fare gözleri lateral yerleşimi, gerekli negatif kutup-DNA-retina-pozitif kutup hizalama cımbız elektrot kolay yönelim sağlar. Aktarılan genlerin yoğun birleşme ve ifade postnatal günde 2 (P2) tarafından tespit edilebilir. Retina hücrelerinin önemli bir yanal göç olmaması nedeniyle, electroporated ve olmayan electroporated bölgelerde üretilir. Sigara electroporated bölgelerde uygun olan yerlerde iç histolojik kontrolleri olarak hizmet verebilir. Retina elektroporasyon gibi CAG gibi, her yerde bulunan bir organizatörü altında bir genin, ifade etmek, ya da shRNA yapıları veya Cre-recombinase kullanarak gen fonksiyonunu bozabilir kullanılabilir. Spesifik gen sahipleri ile hücre yapıları tasarlarken daha hedefli ifadesi elde edilebilir. Electroporated hücrelerinin Görselleştirme GFP ifade bicistronic yapıları kullanılarak elde ya da eş-electroporating GFP ifadesini oluşturmak. Ayrıca, çoğul yapıları Kombinatoryal gen etkileri ya da farklı genlerin işlevi eş zamanlı olarak kazanç ve kayıp çalışması için electroporated olabilir. Retina elektroporasyon uygun ifade yapıları ve silme mutantlar üreterek genomik cis-düzenleyici elemanlar analizi için kullanılabilir. Bu tür deneylerde hücre belirli bir gen ekspresyonu 11 için yeterli veya gerekli cis-düzenleyici bölgeleri tanımlamak için kullanılır . Potansiyel deneyler sadece yapı kullanılabilirlik ile sınırlıdır.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina at JoVE.com

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir yöntem<em&gt; In vivo</em&gt; Sundu. Bu yöntem harici bir elektrik alanı uygulama tarafından oluşturulan hücre plazma membranlar geçirgenliği geçici bir artışa yararlanır.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

in-vivo-electroporation-of-developing-mouse-retina

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

20.7K Görüntüleme.  Johns Hopkins School of Medicine. Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir yöntem In vivo Sundu. Bu yöntem harici bir elektrik alanı uygulama tarafından oluşturulan hücre plazma membranlar geçirgenliği geçici bir artışa yararlanır.

Video: In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Nörobilim

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

Aktivitesi miktarının Cis</emEksplant Elektroporasyon Fare Retina> Düzenleme Elemanları

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Fare Retina kullanma CNS&#39;deki Vasküler Rejenerasyon Değerlendirilmesi

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...