Protokolümüz, son derece dinamik hücresel süreci ve ayrıntılı alt hücresel yapıları incelemek için görüntülenmiş hücreyi fizyolojik durumda tutan düzenli florofor probları ve basit numune hazırlama teknikleri kullanır. Bu teknik, hücresel süreçleri süper çözünürlükte ve fizyolojik koşullar altında, özel veya geçici çözünürlükten ödün vermeden uzun bir süre boyunca araştırmamızı sağlar. 12 ila 14 kilodalton moleküler ağırlık kesme diyaliz zarını küçük parçalara ayırarak ve parçaları yaklaşık beş dakika boyunca 100 mikrolitre canlı hücre ortamı ile ıslatarak başlayın.
Zarlar ıslanırken, 50 mililitrelik bir tüpün dış halkasını küçük parçalar halinde kesin ve parçaları% 70 etanolde sterilize edin. Testis diseksiyonu ve montajı için, on iki ila üç günlük uyuşturulma erkek sineklerini bir diseksiyon mikroskobu altında bir diseksiyon kabına aktarın ve testisleri çıkarmak için ince forseps kullanın. Tüm testisler toplandığında, testisleri canlı hücre ortamında iki kez yıkayın ve hazırlanan cam alt tabağa 100 ila 150 mikrolitre canlı hücre ortamı yaymak için bir pipet ucu kullanın.
Sinek testlerini yemeğin ortasına aktarmak ve ortamın yaklaşık 10 mikrolitresi hariç hepsini çıkarmak için ince tokalar kullanın. Hızlı bir şekilde, önceden ıslatılanmış membranı testislerin üzerine yerleştirin ve membranın üzerine iki ila üç küçük plastik ağırlık yerleştirin. Hemen, 100 ila 150 mikrolitre taze canlı hücre ortamı ekleyin ve halkayı yemeğin yükseltilmiş tarafına geri yerleştirin.
Kapak fişini halkaya geri yerleştirin ve kağıdı kapak fişine yerleştirmeden önce bir kağıt parçasını suda döndürün. Ardından, kabı bir kapakla örtün ve kabı süper çözünürlüklü bir mikroskop sahnesinde sabitleyin. Germline kök hücre görüntüleme için görüntüleme yazılımını açın ve iletilen ışığı açın.
Testis dokusuna odaklanmak ve lazerleri açmak için 63X hedefini kullanın. Germinal kök hücreleri bulmak için Live"ı tıklatın. Odağı ayarlayın ve kare boyutunu 512 x 512 ve 1024 arasında 1024 piksel olarak ayarlamak için Kare Boyutu"nu ve kare ortalamasını bir veya iki olarak ayarlamak için Ortalama"yı tıklatın.
Elektron çarpma kazancını 800'ün altına ayarlamak için Master Gain"i ve lazer gücünü ayarlamak için "görüntü alma süresini azaltmak ve fotoğraf ağartma süresini azaltmak için lazer gücünü bölgeye veya ilgi hücresine yakınlaştırmak ve zaman atlamalı görüntü yakalamayı başlatmak için Denemeyi Başlat'a tıklamadan önce görüntünün en iyi şekilde yapılandırıldığını onaylamak için" tıklayın. Airyscan Acquisition en iyi şekilde yapılandırılmamışsa" görüntülenirse, çerçeve boyutu, Z-Stack ve Tarama Alanı"bölümlerinde Optimal"i tıklatın ve deneysel tasarıma ve numune türüne göre zaman aralığını, Z dilimlerinin sayısını ve zaman atlamalı görüntüleme süresini optimize edin. Görüntülemeden sonra İşleme, Toplu İşleme ve Klima İşleme'yi seçin ve işlenecek görüntüleri seçin.
Ardından, süper çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için İşlemi Çalıştır"ı tıklayın. Dönen disk konfokal mikroskop kullanarak erken evre mikrop hücrelerinde alfa tübulin GFP'yi ifade eden drosophila testislerinin canlı hücre görüntülemesi, anne merkezli daha parlak bir sinyal ve kız santigomlarında nispeten daha zayıf bir sinyal olarak GFP sinyallerinin asimetrik yoğunluğunun iki centrosomes'ta görselleştirilmesini sağlar. Parlaklık farkı muhtemelen mikrotübül çekirdeğinin zamansal asimetrisi tarafından yansıtılır, ancak mikrotübüllerin ayrıntılı morfolojisi ve miktarı dönen disk konfokal mikroskopisi kullanılarak çözülemez.
Buna karşılık, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, mikrotübül morfolojisinin ve sayılarının görselleştirilmesine ve nicelleştirilmesine izin verir. Bu geliştirilmiş çözünürlük aynı zamanda asimetrik mikrotübül çekirdeklenme, uzama ve nükleer membranla artan etkileşim kalıplarını da ortaya koymaktadır. Canlı hücre görüntüleme ayrıca asimetrik nükleer membran invaginasyonunun görselleştirilmesine izin verir, ancak çekirdeğe doğrudan giren bireysel mikrotübüllerin görselleştirilmesine izin verir.
Buna karşılık, bu canlı hücre süper çözünürlük tekniği, hem mikrotübüllerin hem de nükleer laminanın eşzamanlı olarak görüntülenmesi ile bu olayların doğrudan gözlemlenmesine izin verir. Metafaz sırasında, her iki kardeş centromeres, dönen disk mikroskopisi kullanılarak tek bir sinyal olarak tespit edilebilir, ancak mikrotübül merkezi ataşmanı gözlenemez. Buna karşılık, süper çözünürlüklü canlı görüntüleme, mikrotübül santromer ataşmanının erken profazda görselleştirilmesini sağlar.
Görüntüleme sırasında hareket etmediklerinden veya yüzdüğünden emin olmak ve fotoğraf ağartma ve fotoğraf toksisitesini önlemek için mikroskop ayarlarını optimize etmek için testislerin üzerine bir zar yerleştirin. Protein dinamiklerini, doğrusal stresi veya hücresel savunma ve süreçleri araştırmak gibi bu yöntemin uygulanabileceği birçok yol vardır.
