Fotobeyaztma sonrası mevcut floresan kurtarma, FRAP protokolleri, ya eksik ya da aşırı karmaşıktır. Bu videoda sunulan protokol kapsamlı, pratik ve basit olması açısından önemlidir. Bu FRAP tekniğinin en büyük avantajı, canlı hücrelerde hücre altı bölmeleri içinde ve arasında protein hareketliliğinin ölçülmesine olanak sağlamasıdır.
FRAP hem tedavi amaçlı hem de tanısal olarak çalışılmaktadır. Bu kullanımlardan biri, vivo'da farklı dokularda ilaç dağıtım sistemleri içinde difüzyonu ölçmektir. Bu bilgiler bir ilaç yapısını ve bileşimini optimize etmek için kullanılabilir.
FRAP mikroskopi tekniği, difüzyon olgusunu anlamanın ilgi çekici olduğu geniş bir alanda öngörüler sağlamıştır. Bunlar arasında hücre ve moleküler biyoloji, gelişim biyolojisi, nörobilim, malzeme bilimi, ileri biyomalzemeler ve ilaç keşfi sayılabilir. Açıklanan protokol memeli hücreleri ile kullanılmak üzere olmasına rağmen, kavramlar bitki hücreleri, maya hücreleri ve bakteriler gibi diğer sistemlere uygulanabilir.
Bu tekniği hiç gerçekleştirmemiş bir birey, en uygun görüntü edinme parametrelerini belirlemede, deneylerine uygun bir kazanım bölgesi oluşturmada ve mobil fraksiyonu ve kurtarma devre sini hesaplamada mücadele edebilir. Bu yordamı ilk kez denerken, denemenizin amaçları bağlamında protokolü optimize etmek için birkaç pilot deneme gerçekleştirdiğinizden emin olun. Prosedürü gösteren maleen Cabe, benim laboratuvar bir teknisyen ve David Rademacher, çekirdek görüntüleme tesisi yöneticisi olacaktır.
Başlamak için, YFP-p62 transfected RAW264.7 makrofajlar bir tabak hazırlamak ve eşlik eden metin protokolü açıklandığı gibi Lipopolysaccharide ile tedavi. Sonra, buz gibi Tyrode tampon bir kez tedavi hücreleri durulamak. Daha sonra, plakaya Nocodazol takviyeli Tyrode's tampon iki mililitre ekleyin ve plakalar FRAP görüntüleme ve analiz önce 15 ila 20 dakika için dört derece santigrat kuluçka sağlar.
Plakaların FRAP görüntüleme ve analizinden önce 15 ila 20 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatmasını bekleyin. Görüntüleme kurulumunda, Floresan belirteci 512 nanometrede en yüksek uyarıma ve 527 nanometrede en yüksek emisyona sahip olduğu için Argon/2 lazerin 514 nanometre çizgisini seçin. Ardından, Lazer Kontrolü penceresinde Argon/2, 458, 477, 488, 514'ü tıklatın ve ardından Standby düğmesini tıklatın.
Lazerin ısınması için yaklaşık üç dakika bekledikten sonra Aç düğmesine tıklayın. Daha sonra lazerin lazer gücünü %100'e ayarlayın ve Enter tuşuna basın. Daha sonra lazer hattının iletimini mikroskopta %5'e ayarlayın, Plan-Apochromat 63x büyütme 1.40 sayısal diyafram yağı hedefine dönün.
Numuneyi mikroskop merceği aracılığıyla görüntüleyin ve görüş alanının ortasına agrega benzeri bir indüklenen yapı yerleştirin. Daha sonra, satın alma yazılımında, kare boyutunu 512 piksele, tazyik hızını sekize ve veri derinliğini 12 Bit'e ayarlayın. Ayrıca tbmm ortalamasını bire, optik zum'u üçe ayarlayın ve Enter tuşuna basın.
Ardından, iğne deliğini 1,95 hata birimine ve dedektör kazancını 582'ye, doygunluk hemen altında niçin elde edin. 150'ye 150 piksel boyutlarına sahip görüntü edinimi için kare şeklinde bir ilgi alanı oluşturun. İlgi alanının 30 saniyede bir 35 kez tarandığı zaman serisini ayarlayın.
Daha sonra, ilgi bölgesinin beş prebleach görüntüleri toplamak için, fotobeyazrlama beş numaralı taranan sonra oluşacak şekilde ağartıcı kontrol ayarlayın. Onaylamak için Enter tuşuna basın. Ardından, Bleach Regions penceresine gidin ve 10 piksel çapında olan saldırgan benzeri indüklenen yapı alanı içinde dairesel şekilli bir çamaşır suyu alanı oluşturun.
Şimdi, yineleme sayısını 300'e ayarlayın ve tekrar Enter tuşuna basın. Daha sonra lazer hattını %100 güç olarak ayarlayın ve lazer için iletim yüzdesi alanına 100 girin ve Enter tuşuna basın. Son olarak, yaklaşık üç mikrondan daha az sürüklenme ile 10 hücrede 10 agresome benzeri indüklenen yapılarDAN FRAP verileri toplamak için görüntü toplama programını çalıştırın.
Veri analizine başlamak için, önce AIM lsm dosyalarını veri analizi için kişisel bir bilgisayara aktarın. Her AIM lsm dosyasını bir görüntü işleme programıyla açarak, satın alma bölgesinin zaman serisi görüntülerini hizalayarak veya eşleştirerek görüntü kayması için düzeltme. Ardından Eklentiler, Kayıt, StackReg ve Çeviri'yi seçin ve ardından Eklentiler, Kayıt, StackReg ve ardından Rijit Gövde'yi seçin.
Daha sonra, ilgi alanı nın ağartıcı bölgesindeki sinyal yoğunluğunu ölçmek için ilgi alanı yöneticisini ayarlayın. Bunun için oval aracı seçin, ardından 10 piksel çapında ilgi alanı nın ağartıcı bölgesinde bir daire çizin ve sonra Ekle düğmesini tıklatın. Bir kez eklendikten sonra, ilgi kontrol bölgesinde sinyal yoğunluğunu ölçmek için programı ayarlayın.
Dikdörtgen aracını seçin, ardından denetim bölgesinde 20'ye 20 piksel kare çizin ve Ekle düğmesini tıklatın. Son olarak, ilgi arka planda sinyal yoğunluğuölçmek için ilgi yöneticisi bölge ayarlayın. Dikdörtgen aracını seçin, arka plan bölgesinde 20'ye 20 piksel kare çizin ve sonra Ekle düğmesini tıklatın.
YG Yöneticisi'nde analiz edilecek bölgeleri ekledikten sonra, bunları Bleach RoI, Control ROI ve Background ROI olarak yeniden adlandırın. Her bölgedeki sinyal yoğunluğunu ölçün. Bunu başarmak için Bleach RoI, Control ROI ve Arka Plan Yatırım Getirisi'ni seçin ve ardından Daha Fazla'ya gidin ve Çoklu Ölçü'yi seçin.
Sonuçları, sırasıyla Bleach YG, Denetim YG ve Arka Plan YG etiketli sütunlara bir elektronik tabloya yapıştırın. Bleach RoI ve Control ROI'daki sinyal yoğunluğunu, Bleach ROI etiketli sütundaki değerlerden ve Control ROI etiketli sütundaki arka plandaki arka plandaki değerleri çıkararak başlatın. Etiket bu yeni sütunlar Düzeltilmiş Bleach RoI ve Düzeltilmiş Denetim RoI.
Ardından, Bleach RoI'daki sinyali Kontrol Yatırım Getirisi'ndeki arka plan düzeltilmiş sinyale normalleştirin. Düzeltilmiş Ağartıcı Yatırım Getirisi etiketli sütundaki değerleri Düzeltilmiş Denetim YG etiketli sütundaki değerlere bölün. Etiket bu yeni sütun, Normalleştirilmiş Düzeltilmiş Bleach RoI.
Ardından, Normalleştirilmiş Düzeltilmiş Ağartıcı Yatırım Getirisi sütunundaki sinyali Bleach RoI'daki beş bleach öncesi değerin ortalamasına göre normalleştirin. Normalleştirilmiş Düzeltilmiş Ağartıcı Yatırım Getirisi etiketli sütundaki değerleri Bleach RoI'daki beş bleach öncesi değerin ortalamasına bölün. Etiket bu yeni sütun, Normalleştirilmiş Düzeltilmiş Prebleach Ortalama Bleach RoI.
Son olarak, görüntü işleme için bir program açın. Eğri, normalleştirilmiş çamaşır suyu düzeltilmiş ağartıcı yatırım getirisi değerlerini ve buna karşılık gelen zaman değerlerini kopyalayarak normalleştirilmiş ve düzeltilmiş çamaşır suyu Yatırım Getirisi verilerine uyar. Eğri Aşındıran penceresine yapıştırın, Eğri Aşındıran açılır menüden üstel kurtarma yı seçin ve Sığdır'ı seçin.
Burada gösterilen RAW264.7 hücreleri LPS ile tedavi için fotobeyazrlama sonra floresan kurtarma tipik bir video. Aggresome benzeri indüklenen yapı bölgesinde floresan toparlanma, yavaştır. Bu deney, p62'nin hareket kabiliyetini incelemek için fotobeyaztlandırma kullanır.
agresome benzeri indüklenen yapılarda p62 floresan, prebleach ve postbleach, burada gösterilmiştir. Bu videoda açıklandığı gibi, floresan yoğunluğu zaman içinde izlenebilir. Arka plan düzeltme ve normalleştirme sonrasında, p62 floresan%78 olarak mobil fraksiyonu tanımlamak için hesaplanabilir ve agresome benzeri indüklenen yapılar içinde kurtarma devre zaman açıklar, olarak 2.14 dakika.
Unutmayın, özellikle ilgi alanı edinme bölgesini doğru bir şekilde tanımlamak önemlidir, böylece bir ALIS ilgi alanı, bir kontrol bölgesi ve bir arka plan alanı içerir. Bu prosedürü takiben fotobeyazrlamada floresan kaybı, FLIP ve seçici fotobeyaztçılama gibi diğer kantitatif floresan mikroskopi teknikleri de uygulanabilir. FLIP hücre altı bölmeleri arasındaki süreklilik ve iletişim derecesini ölçerken, seçici fotobeyaztma proteinlerin organellere veya protein açısından zengin alanlar alabildiği aktif ve pasif taşıma hakkında kinetik bilgi sağlar.
FRAP başlangıçta hücre zarlarında proteinlerin lateral hareketini ölçmek için geliştirilmiştir. Daha sonra, hücre içi ve moleküler biyoloji, gelişim biyolojisi, nöroloji, malzeme bilimi, ileri biyomalzemeler ve ilaç keşfi gibi çeşitli alanlarda ki soruları yanıtlamalarının önünü açan çeşitli hücre altı bölmeleri içinde ve arasında protein hareketliliğini ölçmek için kullanılmıştır.
