Yazarlar bu yazının verileri katkıda Michael Chou, Bingbing Dai ve Liang Xiao kabul etmek istiyorum. Biz de bu çalışmada kullanılan reaktiflerin cömert hediyeler için Dr John Gray kabul. PB Ulusal Kanser Merkezi&#39;nden bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmektedir. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüsü (R01AI68978, P01CA132681 ve RCA170820A), Bill ve Melinda Gates Vakfı, Translational Medicine için Ortak Merkezi&#39;nden bir öteleme ivme hibe ve Kaliforniya HIV / AIDS bir hibe bir hibe hibe tarafından desteklenmiştir Araştırma Programı.

DC-LV istikrarlı üretici hücreleri gerekli lentiviral bileşenleri gagpol, devir ve tet-off sistemi içeren GPR ambalaj hücre hattı 11 temel inşa edilir. İlk olarak, bir retroviral transdüksiyon tet-bağımlı SVGmu glikoprotein kodlayan bir GPRS paketleme hücre hattı üretmek için kullanılır. Daha sonra, bir dizi concatemer transfeksiyon gibi GFP gibi bir lentiviral vektör transgen ile GPRS hücre hattı transfekte etmek için kullanılır. AG-MGFP olarak tanımlanan bu stabil üretici hücre hattı, GFP karşı, bir DC-AG aşı üretme kabiliyetini için in vitro ve in vivo olarak test edilebilir. 1. Bir Tet bağımlı SVGmu Hücre Hattı oluşturma Plazmid PrX-SVGmu DC-özgü glikoproteini SVGmu alt retroviral plazmid pRetroX-Tet fiyatına 1 (Şekil 1C) tTA-gelişmiş promotör klonlanmış olduğu bir yapıdır. D10 Kültür 293T hücreleri (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı ile% 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin). Doksisiklin (1 ng / ml) ve puromisin (2 ug / ml) ile D10 Kültür GPR paketleme hücre hattı. Tüm hücreler% 5 CO2 ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör içinde kültürlendi. <ol><li> 16-18 saat önce, geçici transfeksiyon, levha 2 x 10 hücre transfeksiyon zaman az% 90 konfluent yaklaşım, böyle bir 6-cm doku kültürü çanağı içinde D10 4 ml 6 293T hücreleri. </li><li> Retroviral plasmidlerin transfeksiyonu: karışım 100 ul 1.25 M CaCI2 çözeltisi steril Milli-Q su ve aşağıdaki plazmid: 5 ug PrX-SVGmu, 2.5 ug pGag-Pol, 2.5 ug pVSV-G. Son hacim 500 ul. 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüp, 500 ul 2X HBS (50 mM HEPES, 10 mM KCI, 12 mM Dekstroz, 280 mM NaCI, 2 HPO 4 * 7H 2, O, pH 7.05, 1.5 mM Na) ekleyin. Bir cam Pasteur pipeti ile şiddetli bir şekilde tampon köpüren ise 2X HBS tampon plazmid karışımı damla damla ilave edin. Mi ekledikten sonraxture, bir 30 saniye boyunca köpüren devam. Daha sonra, 6 cm kültür tabağına 293T hücreleri üzerine bütün karışımı eklenir, ve 37 ° C de inkübe </li><li> 4 saat transfeksiyon sonra, dikkatli bir şekilde 4 ml önceden ısıtılmış D10 ile kültür çanak orta yerine. </li><li> Enfeksiyon Spin: Transfeksiyondan 48 saat sonra hasat SVGmu-kodlayan bir 0.45 mikron filtre içinden geçen süpernatant ile süpernatantı retroviral parçacıklar. / Iyi 2 x 10 4 hücre bir 24-iyi çanak plaka GPR ambalaj hücreleri. 1,050 x g&#39;de 90 dakika ve 25 ° C için çanak GPR paket hücreleri (2 ml / oyuk) ve santrifüj hücrelere Süpernatan süzülmüş ekleme (2 ml / oyuk) Spin-enfeksiyon sonrası doksisiklin (1 ng / ml) ile taze D10 içine orta değiştirin. </li><li> Paket hücreleri doksisiklin (1 ng / ml) ve puromisin (2 ng / ml) ile D10 transduse 72 saat post-transfeksiyon, kültür genişletmek. </li><li> 48 saat doksisiklin olmadan SVGmu, kültür hücrelerin ifade onaylamak için. Yüzey eski ölçünAnti-Sindbis serum kullanılarak akım sitometri ile SVGmu bir depresyon. Bu hücreler, GPRS, paketleme hücre olarak adlandırılır. </li></ol> 2. Concatemer Dizi Transfeksiyon tarafından DC-LV Üretici Hücreler Construct Lentiviral transferi TL20 plazmid GFP bir kendi kendine inaktif lentiviral transfer vektörü bir plazmiddir Dox-regüle viral bir RNA genomu ekspresyon sistemi ve 7 tet operatör (Şekil 1C) 11, sitomegalovirüs (CMV) güçlendirici yer değiştirmesi ile pCL20c-MSCV-GFP dayalı , 12,15. Plazmid PGK-ble zayıf bir PGK organizatörü 2 tarafından yönlendirilen bir bleomisin dayanıklı (dür) kaset olduğunu. <ol><li> 50 kısıtlama enzimi sindirimi Sfil ile 20 ug plazmid TL20-GFP ° C 37 PflMI ile Digest 20 mg plazmid PGK-ble ° C </li><li> Agaroz jel elektroforezi ile DNA fragmanları (PGK-labilir kaseti 1011 bp ve vektör TL20-GFP 6861 bp) arıtınız. </li><li> TL20-GFP vektör ve PGK-Arter25:1 &#39;lik bir molar oranda (NEB, T4 DNA ligaz) de ble kaseti. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Gece boyunca ligasyon sonra ligasyon karışımı (Qiagen DNeasy Kan ve doku Kiti) DNA arındırmak. Arıtılmış DNA miktarını sağlamak 5 mg civarındadır. </li><li> Transfeksiyondan 16-18 saat önce, konfluent transfeksiyon zaman yaklaşık olarak% 90 olacak şekilde, 6 cm doku kültürü çanağı içinde plaka GPRS paket hücreleri. </li><li> 6 cm doku kültürü çanağı içinde GPRS paket hücreleri içine concatemeric saflaştırılmış DNA 5 ug transfekte etmek için aşama 1.2 &#39;de tarif edilen kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi. Transfeksiyon, 4 saat sonra, dikkatli bir şekilde orta kaldırmak ve doksisiklin (1 ng / ml) ile 4 ml önceden ısıtılmış D10 ile değiştirin. </li><li> Transfeksiyondan 48 saat sonra, doksisiklin (1 ng / ml) ve puromisin (2 ug / ml) ile D10 içine orta değiştirmek. Kültür ortamı içinde zeosin (50 mg / ml) eklenerek transfekte klonlar için seçin. Hücre koloni kadar yaklaşık 2 hafta boyunca kültür hücreleries yemekleri altındaki görülebilir. </li><li> Yemeklerin altındaki hücre kolonileri etiketleyin. , 24 oyuklu doku kültürü tabaklarında al sayıda kuyu ve her biri de 2 ml zeosin D10 içeren (50 ug / ml), doksisiklin (1 ng / ml) ve puromisin (2 ug / ml) ekleyin. Transduse edilmiş hücrelerin medyumu aspire, o zaman en az bir dakika süre ile kolonilerin her birisi üzerine tripsin bir damla ilave edin. Daha sonra, aynı koloniler D10, bir ya da daha fazla damla ilave edin. Bir pipet yardımıyla tek koloniler bir pick up ve 24-iyi doku kültürü plakası ayrı kuyu içine aktarın. </li><li> Kültür ve viral üreten yeteneğinin değerlendirilmesi için zeosin D10 içeren (50 ug / ml), doksisiklin (1 ng / ml) ve puromisin (2 ug / ml) içindeki tüm hücre klonları genişletebilir. </li></ol> 3. Her Hücre Clone Viral Üretim değerlendirin <ol><li> Doksisiklin olmadan birbirine karışmış gibi D10, 6 cm doku kültürü çanağı içinde 4x10 6 hücre etrafındaki üretici hücreler ve levha Trypsinize% 90 aşıyor. Günlük taze önceden ısıtılmış D10 ile orta değiştirin ve dox çıkardıktan sonra titre testi 72 saat için orta toplamak. </li><li> Bir 0.45 mikron filtre ile filtreleme ortamı ile viral süpernatan hasat. </li><li> Plaka hedef hücreler 4 x 10 hücre / 1, 96-çukurlu kültür tabaklarında bir negatif kontrol olarak, DC-SIGN reseptörü (örneğin, elde edilen 293T.hDC-SIGN veya fare kemik iliği dendritik hücreler 16) ve 293T ifade. Kuyu (göz başına 100 ul /) için viral üstte yüzen 2-kat seri dilüsyonları ekleyin. Genellikle, 6-8 seyreltileri GFP pozitif hücreleri ilave virüs miktarı için doğrusal bir ilişki içinde olan transduse hangi aralığı ulaşmak için yeterlidir. </li><li> Hücreler santrifüj ve benzeri gibi Adım 1.4 &#39;de tarif edilen orta yerine. BMDCs% 10 FBS ve GM-CSF (1:20 J558L koşullandırılmış ortam) ile RPMI ortamında edilmelidir. </li><li> Akım sitometri 4-6 gün sonrası transdüksiyon hücreleri transduced en GFP ifade ölçün. Lentiviral vectoGFP-pozitif hücreler ve vektör miktarının yüzde doğrusal bir ilişki içinde olduğunda R titresi vektör seyreltme aralığında hesaplanır. Sonraki uygulamalar için en yüksek virüs üretimi ile hücre klonu seç. </li></ol> 4. Lentiviral Vektörler üretmek ve Konsantre <ol><li> Kültür 15 cm doku kültür tabaklarında üretici hücre hattı (AG-MGFP). </li><li> Doksisiklin olmadan taze D10 konfluense% 90 daha az 15 cm doku kültürü yemekleri üretici hücreleri ve plaka hücreleri Trypsinize. Günlük taze, önceden ısıtılmış D10 orta değiştirin. </li><li> Pik viral üretimi (kullanıcı tarafından tanımlanır) bir zamanda, viral süpernatan hasat ve bir 0.45 mikron filtre kullanılarak filtre. 90 dakika boyunca 50,000 x g&#39;de santrifüj parafin ve, 4 ° C mühür, kalın duvar 32.5 ml&#39;lik bir ultra santrifüj tüpleri içine süzüldü süpernatant yerleştirin. İyice 50 ul veya uygulamaya bağlı olarak, PBS veya HBSS uygun bir hacmi pelletini. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. In vivo farelerine bağışıklık ve antijen-spesifik bir bağışıklık tepkisi Analiz <ol><li> Bölüm 4&#39;te açıklandığı gibi yüksek titre virüs üretin. </li><li> Vektör süspansiyon (ayak yastığı başına 25 ul) ile bir haydut yolla BALB / c farelerde (eski, kadın 6-8 hafta) enjekte edilir. </li><li> 2 hafta aşılama sonra, dalak ve hasat dalak izole. GFP epitop peptitleri ile ve GFP-özgül CD8 + varlığında, hücre içi sitokin boyaması kullanılarak bir T-hücrelerinde analiz Kültür splenositler, daha önce 17 (Şekil 3B) tanımlamışlardır. </li></ol>

<ol>
	<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Kootstra, N. A., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+with+viral+vectors.">Gene therapy with viral vectors.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration.">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genotoxic+potential+of+retroviral+vectors+is+strongly+modulated+by+vector+design+and+integration+site+selection+in+a+mouse+model+of+HSC+gene+therapy.">The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).</li><li>Hu, B., Tai, A., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+delivered+by+lentiviral+vectors+for+cancer+and+infectious+diseases.">Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases.</a> Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).</li><li>Broussau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+packaging+cells+for+large-scale+production+of+lentiviral+vectors+in+serum-free+suspension+culture.">Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).</li><li>Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trans-lentiviral+packaging+cell+line+for+high-titer+conditional+self-inactivating+HIV-1+vectors.">A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+high-titer+HIV-1+vector+production.">Continuous high-titer HIV-1 vector production.</a> Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).</li><li>Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+packaging+cell+line+for+lentivirus+vectors.">A packaging cell line for lentivirus vectors.</a> Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).</li><li>Strang, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+vectors+with+alphavirus+envelope+glycoproteins+produced+from+stable+packaging+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells.</a> Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).</li><li>Throm, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+construction+of+producer+cell+lines+for+a+SIN+lentiviral+vector+for+SCID-X1+gene+therapy+by+concatemeric+array+transfection.">Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection.</a> Blood. 113, 5104-5110 (2009).</li><li>Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+stable+producer+cells+to+make+high-titer+lentiviral+vectors+for+dendritic+cell-based+vaccination.">Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).</li><li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+dendritic+cells+into+medicine.">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449, 419-426 (2007).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+lentivector+targeting+of+dendritic+cells+for+in+vivo+immunization.">Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization.</a> Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).</li><li>Hanawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+rhesus+repopulating+hematopoietic+stem+cells+using+a+simian+immunodeficiency+virus-based+lentiviral+vector+system.">Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system.</a> Blood. 103, 4062-4069 (2004).</li><li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells.">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).</li><li>Dai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Gag-specific+immunity+induced+by+a+lentivector-based+vaccine+directed+to+dendritic+cells.">HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Grade+Lentiviral+Vectors.">Clinical Grade Lentiviral Vectors.</a> Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).</li><li>Loew, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+PG13-based+packaging+cell+line+for+stable+production+of+clinical-grade+self-inactivating+gamma-retroviral+vectors+using+targeted+integration.">A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration.</a> Gene Ther. 17, 272-280 (2010).</li><li>Gaspar, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+use+of+a+pseudotyped+gammaretroviral+vector.">Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector.</a> Lancet. 364, 2181-2187 (2004).</li><li>Cornetta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+lentivirus+analysis+of+clinical+grade+vector+products.">Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).</li><li>Stewart, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+producer+cell+line+for+the+manufacture+of+a+lentiviral+vector+for+gene+therapy+of+Parkinson's+disease.">A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease.</a> Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).</li><li>Coroadinha, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+producer+cell+line+metabolism:+implications+on+viral+productivity.">Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.</p

Burada, stabil olarak düzenleyici sistem kapalı Tet altında lentiviral bileşenleri ile transduse 293T hücreleri kullanılarak lentiviral vektörleri büyük miktarlarda üretilmesi için bir yöntem, ana hatlarıyla. Bugüne kadar, lentiviral vektörleri üretmek için en çok kullanılan protokol (örneğin, 18), standart kalsiyum fosfat geçici transfeksiyon dayanmaktadır. Bu yaklaşım bir klinik ölçekte başarılı olmuştur, ama istikrarlı hücre hatları üretimi ölçeklendirme mevcut olması ...

Birçok vektör sistemleri gen aktarımı için geliştirilmiştir. Lentivirüsler dayalı vektörler en sık çalışılan viral sistemi arasında yer almıştır. Verimli bir şekilde, hücreleri 1 bölme ve olmayan bölünmesi hem transduce nedeniyle ev sahibi genomuna entegrasyonu için uzun vadeli ifade elde, en insan nüfusu 2 düşük doğal anti-vektör bağışıklık sergi ve için düşük potansiyeline sahip, çünkü bu vektörler avantajlıdır girmeyle mutagenez 3,4 ikinci genotoksisite. Lentivirüsler üretimi her zaman güvenlik kaygıları ile renklendi. Lentiviral vektörleri, genellikle, HİV-1, AIDS etken ajan elde edilmektedir. Lentivector tek tek bileşenleri (transfer, zarf ve ambalaj plazmid) geçici transfeksiyon laboratuvar ortamlarında genetik materyal sunma ortak ve esnek bir araçtır. Ancak, klinik uygulamalar için ölçekleme-up geçici transfections hantal ve may çoğaltma yetkili lentivirüs 5,6 gelişmesine yol açar. Bu engellerin üstesinden gelmek için, çeşitli kararlı ambalaj ve üretici hücre çizgileri 6-11 geliştirilmiştir. Bu hatlarından biri, GPR paketleme hattı 11, tetrasiklin tarafından düzenlenen olma cazip bir avantaja sahiptir. Bu yazıda, özellikle dendritik hücreler (DC-LVs) 12 doğru hedeflenmektedir kendini inaktive lentiviral vektörler üretmek için bu sistem uyum nasıl gösterilmektedir. Dendritik hücreler (DC) bağışıklık sisteminin en güçlü antijen sunan hücrelerdir. Doğrudan, programı başlatmak ve tümör spesifik immün yanıtları 13 düzenleyen çünkü kanser aşısı geliştirilmesi büyük ilgi konusu olmuştur. DC peptid veya DNA aşıları daha güçlü bir anti-tümör immün yanıt ortaya çıkarmak potansiyeline sahip dahil etmek için bir aşı protokolü içeren. Son zamanlarda, bir lentiviral vektör geliştirdiğimiz specifically, bir modifiye sindbis virüsü glikoprotein, SVGmu 14 boyunca dendritik hücreler hedeflemektedir. Onlar dendritik hücreler için yüksek özgüllük göstermek ve spesifik olmayan, VSVg-pseudotyped vektörler daha güçlü bağışıklık yanıtları üreten bu vektörler benzersizdir. Burada, bu DC-hedefli lentiviral vektörleri büyük miktarlarda üretilmesi için bir yöntem sunulmuştur. Biz bu DC-DC LVs bulaştırmak ve güçlü CD8 + T hücre bağışıklık yanıtı oluşturabilir göstermektedir. Hayvanlar ile ilgili tüm işlemler USC Intitutional Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayı altında, insanca yapıldı. In vivo ve klinik deneylerde gerçekleştirmek için, bu yüksek bir titresi virüs üretebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için çok önemlidir. Aynen anlatıldığı gibi iletimi ve transfeksiyon adımları uygulayarak böyle bir klon üretme şansını maksimize edecek.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Clontech Laboratories, Inc.</td>
			<td>631311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R250-01</td>
			<td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells

Lentiviral vektörleri (karaciğer hacimleri) hücrelerin birçok çeşit genetik materyal teslim güçlü araçlardır. LVS büyük miktarlarda üretim, bu, HIV-1 ile ilişkili elde edilen vektörler, güvenlik kaygıları nedeniyle zordur. Bu yazıda, kendi kendini inaktive karaciğer hacimleri yüksek titreleri üretmek için bir yöntem rapor. Bu retroviral olarak bir dendritik hücre-özgü glikoproteini, SVGmu de dahil olmak üzere, tüm viral bileşenler ifade edebilen bir hücre hattı, GPRS oluşturmak için tet fiyatına stabil üretici hücre hattı GPR iletmektedir. Daha sonra, sol ventrikül aktarım plazmid kodlayan bir seçilebilir marker ile bir arada bir GFP raportör gen transfekte etmek için concatemeric DNA transfeksiyon kullanın. Sonuçta elde edilen klonlar çeşitli biz geçici transfeksiyon ile elde olandan 10 kat daha fazla bir titre de LV üretebilir. Ayrıca, bu virüsler, in vitro olarak verimli bir şekilde dendritik hücrelerin transdüksiyonu ve muhabir antijene karşı güçlü bir T hücresi bağışıklık tepkisi oluşturur. Bu yöntem iyi bir seçenek olabilir for kanser veya bulaşıcı hastalıkların klinik çalışmalar için güçlü LV-tabanlı aşısı üreten.

Bu yöntem, anlatılan stabil hücre hattı, özellikle dendritik hücreler için hedeflenen lentiviral vektörleri büyük miktarda üretebilir. Şekil 1B &#39;de gösterildiği üzere, bireysel klonların izolasyonu kaliteli 12 arasında değişen stabil hücre hatları elde edilmiştir. Test edilmiş 26 klon içinde, 8 geçici transfeksiyon tarafından üretilen SVG pseudotyped lentiviral vektörleri için tipik bir ölçüttür ml (TU / ml) başına 10&#39;dan daha fazla 6 biri...

Watch this Scientific Journal Video about A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells at JoVE.com

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Burada, retroviral transdüksiyon ve tetrasiklin yokluğunda bir lentiviral vektör (IV) bileşenleri ifade edebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için concatemeric transfeksiyon kullanın. Bu AG GFP kodlar ve dendritik hücreler üzerinde reseptörü için spesifik olan bir glikoprotein, SVGmu ile pseudotyped edilir.

Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

a-tetracycline-regulated-cell-line-produces-high-titer-lentiviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.4K Görüntüleme.  University of Southern California, Los Angeles. Burada, retroviral transdüksiyon ve tetrasiklin yokluğunda bir lentiviral vektör (IV) bileşenleri ifade edebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için concatemeric transfeksiyon kullanın. Bu AG GFP kodlar ve dendritik hücreler üzerinde reseptörü için spesifik olan bir glikoprotein, SVGmu ile pseudotyped edilir.