Os autores gostariam de agradecer Michael Chou, Bingbing Dai, e Liang Xiao para contribuir com dados para este manuscrito. Também reconhecemos Dr. John Gray para os generosos presentes de reagentes utilizados neste estudo. PB é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Centro Nacional do Câncer. Esta pesquisa foi suportada por concessões do National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 e RCA170820A), uma bolsa da Fundação Bill e Melinda Gates, uma bolsa de aceleração translacional do Centro Conjunto de Medicina Translacional e uma bolsa da Califórnia HIV / AIDS Programa de Pesquisa.

Células produtoras estáveis ​​DC-LV são construídos com base na GPR embalagens da linha 11 célula que contém o necessário lentiviral componentes gagpol, rev e do sistema tet-off. Em primeiro lugar, a transdução retroviral, é utilizado para gerar uma linha celular de empacotamento GPRS, que codifica uma glicoproteína SVGmu tet-dependente. Em seguida, concatemer transfecção matriz é utilizado para transfectar a linha celular com um transgene GPRS vetor lentiviral como GFP. Esta linha celular estável produtora, designado como LV-mGFP, pode ser testado in vitro e in vivo pela sua capacidade para produzir uma vacina contra DC-LV GFP. 1. Geração de uma linhagem de células dependente de SVGmu Tet O plasmídeo PRX-SVGmu é uma construção na qual a glicoproteína específica SVGmu-DC é clonado a jusante do promotor tTA avançado de plasmídeo retroviral pRetroX-Tet-off 1 (Figura 1C). Culturas de células 293T em D10 (meio de Eagle modificado por Dulbecco com10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina). Cultura GPR linha celular de empacotamento em D10 com doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ug / ml). Todas as células são cultivadas num humidif 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. <ol><li> 16-18 h antes da transfecção transiente, placa de 2 x 10 6 células 293T em 4 ml de D10 em um prato de cultura de tecidos de 6 cm de tal modo que as células se aproximam de 90% de confluência no momento da transfecção. </li><li> Transfecção de plasmídeos retrovirais: misture 100 mL de 1,25 M de CaCl2 solução estéril de água Milli-Q e os seguintes plasmídeos: 5 mg PRX-SVGmu, 2,5 mg pGag-Pol, 2,5 mg pVSV-G. O volume final é de 500 uL. Para um tubo de poliestireno ml de fundo redondo de 5, adicionar 500 ul de 2X HBS (HEPES 50 mM, KCl 10 mM, dextrose 12 mM, NaCl 280 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH 7,05). Adicionar gota a gota, a mistura de plasmídeo em tampão HBS a 2X do tampão enquanto se faz borbulhar vigorosamente com uma pipeta Pasteur de vidro. Depois de adicionar o mixture, continuam borbulhando por mais 30 segundos. Em seguida, adicione a mistura total sobre as células 293T em placas de cultura de 6 cm, e incubar a 37 ° C. </li><li> 4 h após a transfecção, substitua cuidadosamente o meio em placas de cultura com 4 ml D10 pré-aquecido. </li><li> Girar infecção: 48 h após a transfecção, a colheita SVGmu codifica partículas retrovirais no sobrenadante por passagem do sobrenadante através de um filtro de 0,45 mícrons. Placa de células de empacotamento de GPR em um prato de 24 poços a 2 x 4 10 células / poço. Adicionar sobrenadante filtrado para células de empacotamento GPR no prato (2 ml / poço) e as células de centrifugação durante 90 min a 1050 xg e 25 ° C. Mudar médio em D10 fresco com doxiciclina (1 ng / ml) após spin-infecção (2 mL / poço). </li><li> 72 horas após a transfecção, a expansão da cultura de células de empacotamento transduzidas com doxiciclina em D10 (1 ng / ml) e puromicina (2 ng / ml). </li><li> Para confirmar a expressão da SVGmu, a cultura das células sem doxiciclina durante 48 h. Meça ex superfíciepressão de SVGmu com a citometria de fluxo, utilizando soro anti-Sindbis. Estas células são designadas como GPRS linha celular de empacotamento. </li></ol> 2. Construir DC-LV células produtoras de matriz Concatemer transfecção Lentivirus plasmídeo de transferência TL20-GFP é uma auto-inactivação lentiviral vector de transferência de plasmídeo baseado em pCL20c-MSCV-GFP com um sistema de Dox regulável genoma de ARN viral e expressão substituição do citomegalovírus (CMV) com o intensificador de operadores tet 7 (Figura 1C) 11 , 12,15. O plasmídeo PGK-vel é resistente (ble) cassete bleomicina conduzido por um promotor PGK fraco 2. <ol><li> Digest 20 ug de plasmídeo TL20-GFP com a enzima de restrição Sfil, a 50 ° C. Digest 20 ug de plasmídeo PGK-vel com PflMI a 37 ° C. </li><li> Purifica-se os fragmentos de ADN (a cassete PGK-vel é 1011 pb e o vector TL20-GFP é 6861 pb) por electroforese em gel de agarose. </li><li> Ligar o vector TL20-GFP e PGK-cassete vel a uma razão molar de 25:1 (NEB ligase do DNA de T4). Incubar durante a noite à temperatura ambiente. </li><li> Após a ligação durante a noite, purificar DNA a partir da mistura de ligação (Qiagen DNeasy Blood and Tissue kit). Assegurar a quantidade de ADN purificado é de cerca de 5 jig. </li><li> 16-18 horas antes da transfecção, as células da placa de embalagem de GPRS em um prato de cultura de tecidos de 6 cm de tal modo que a confluência será de cerca de 90% no momento da transfecção. </li><li> Usar o método de transfecção com fosfato de cálcio descrito na etapa 1.2 para transfectar 5 ug do ADN concatemeric purificada em células de empacotamento do GPRS 6 cm de prato de cultura de tecidos. 4 h após a transfecção, o meio cuidadosamente remover e substituir com 4 ml D10 pré-aquecida com doxiciclina (1 ng / mL). </li><li> 48 horas após a transfecção, mudar o meio em D10 com doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ug / ml). Escolha de clones transfectados adicionando zeocina (50 ug / ml) no meio de cultura. Cultura de células para cerca de 2 semanas até pilha colonizaçãoes pode ser visto, na parte inferior dos pratos. </li><li> Rotular as colônias de células na parte inferior dos pratos. Aqui pratos de cultura de tecidos de 24 poços, o número de cavidades e adicionar a cada poço 2 ml de D10 contendo zeocina (50 ug / ml) e doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ug / ml). Aspirar o meio das células transduzidas, em seguida, adicionar uma gota de tripsina em cada uma das colónias durante menos de um minuto. Em seguida, adicionar uma ou mais gotas de D10 no mesmo colónias. Pegar colónias, um por um, com uma pipeta, e transferi-los para diferentes poços da placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. </li><li> Cultura e expandir em todos os clones de células D10 contendo zeocina (50 ug / ml) e doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ug / ml) para a avaliação da capacidade de produção viral. </li></ol> 3. Avaliar a produção viral de cada clone celular <ol><li> Tripsinizar as células produtoras e prato em torno de 4x10 6 células em 6 cm de prato de cultura de tecido em D10 sem doxiciclina tal que a confluênciasuperior a 90%. Substituir o meio fresco com D10 pré-aquecido diariamente e recolher o meio para o ensaio de titulação de 72 horas após a remoção dox. </li><li> Colheita do sobrenadante virai por filtragem por meio de um filtro de 0,45 ^ m. </li><li> As células alvo placa que expressa o receptor DC-SIGN (por exemplo 293T.hDC-SIGN ou na medula óssea do rato derivadas de células dendríticas, 16) e 293T como um controlo negativo em pratos de cultura de 96 poços, 1 x 4 10 células / poço. Adicionar duas diluições em série do sobrenadante viral aos poços (100 ul / poço). Geralmente, 6-8 diluições são suficientes para atingir a gama em que as células transduzidas GFP positivas estão em uma relação linear com a quantidade de vírus adicionado. </li><li> Centrifugar as células e substituir o meio, tal como descrito na etapa 1.4. BMDCs devem ser cultivadas em meio RPMI com 10% de FBS e GM-CSF (1:20 J558L meio condicionado). </li><li> Medir a expressão da GFP em células transduzidas por citometria de fluxo de 4-6 dias pós-transdução. A vecto lentiviralr título é calculado na gama de diluição vector quando a percentagem de células GFP positivas e quantidade do vetor estão em uma relação linear. Escolha o clone celular com a maior produção viral para aplicações subseqüentes. </li></ol> 4. Produzir e concentrado Vetores Lentivirus <ol><li> Culturas da linha de célula produtora (LV-mGFP) em 15 cm de pratos de cultura de tecidos. </li><li> Tripsinizar as células produtoras e de células em pratos de placas de cultura de tecidos de 15 cm a mais do que 90% de confluência em D10 fresco sem doxiciclina. Alterar médio com frescos, D10 pré-aquecido por dia. </li><li> No momento da produção de pico viral (conforme determinado pelo utilizador), a colheita do sobrenadante viral e filtrá-la utilizando um filtro de 0,45 mícrons. Carrega-se o sobrenadante filtrado para 32,5 ml de tubos de parede grossa ultracentrífuga, selar com parafilme e centrifugar a 50.000 xg, a 4 ° C durante 90 min. Ressuspender cuidadosamente o sedimento em 50 mL ou um volume adequado de PBS ou HBSS, dependendo da aplicação. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. Imunização de camundongos in vivo e análise da resposta imune antígeno-específica <ol><li> Produzir vírus de alto título, conforme descrito na seção 4. </li><li> Injectar ratinhos BALB / c (6-8 semanas de idade, fêmea) através de uma via da almofada da pata com a suspensão do vetor (25 ul por pata). </li><li> 2 semanas após a imunização, o baço e isolar os esplenócitos de colheita. Culturas esplenócitos com GFP epitopos peptídeos e análise da presença da GFP específica de células T CD8 +, utilizando a coloração de citocinas intracelulares, conforme descrito anteriormente 17 (Figura 3B). </li></ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+construction+of+producer+cell+lines+for+a+SIN+lentiviral+vector+for+SCID-X1+gene+therapy+by+concatemeric+array+transfection.">Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection.</a> Blood. 113, 5104-5110 (2009).</li><li>Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+stable+producer+cells+to+make+high-titer+lentiviral+vectors+for+dendritic+cell-based+vaccination.">Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).</li><li>Steinman, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J. Vis. Exp. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+use+of+a+pseudotyped+gammaretroviral+vector.">Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector.</a> Lancet. 364, 2181-2187 (2004).</li><li>Cornetta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+lentivirus+analysis+of+clinical+grade+vector+products.">Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).</li><li>Stewart, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+producer+cell+line+for+the+manufacture+of+a+lentiviral+vector+for+gene+therapy+of+Parkinson's+disease.">A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease.</a> Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).</li><li>Coroadinha, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+producer+cell+line+metabolism:+implications+on+viral+productivity.">Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.</p

Aqui, nós descrevemos um processo para a produção de grandes quantidades de vectores lentivirais que utilizam células 293T transduzidas estavelmente com todos os componentes sob a lentivirais tet off sistema regulador. Até à data, a maioria dos protocolos para a produção de vectores lentivirais dependem de fosfato de cálcio padrão de transfecção transiente (ver 18, por exemplo). Esta abordagem tem sido bem sucedida em escala clínica, mas pode sofrer de algumas limitações que não possam estar p...

Muitos sistemas de vectores têm sido desenvolvidos para entrega de genes. Vetores baseados em lentivírus têm estado entre o sistema viral mais comumente estudada. Estes vetores são vantajosos porque podem eficientemente transdução tanto dividindo e não dividindo células 1, alcançar expressão a longo prazo, devido à integração no genoma do hospedeiro, apresentam baixa imunidade natural anti-vector na maioria das populações humanas 2, e têm um baixo potencial de genotoxicidade de mutagénese insercional 3,4. Produção de lentivírus sempre foi colorida por questões de segurança. Lentivirais são geralmente derivados de HIV-1, o agente etiológico da AIDS. Transfecção transiente de componentes individuais do lentivector (transferência, o envelope, e os plasmídeos de empacotamento) é um meio comum e flexível de fornecimento de material genético em laboratório. No entanto, a ampliação dos transfections transitórios para aplicações clínicas é pesado e may levar ao desenvolvimento de lentivírus replicação competente 5,6. Para ultrapassar estas dificuldades, várias embalagens estáveis ​​e linhas celulares produtoras foram desenvolvidos 6-11. Uma destas linhas, a linha de embalagem de GPR 11, tem a vantagem de ser atraente regulada por tetraciclina. Neste artigo, vamos demonstrar como adaptar este sistema para produzir auto-inativando lentivirais que são especificamente voltados para as células dendríticas (DC-VEs) 12. As células dendríticas (CDs) são o antigene mais robustas que apresentam as células do sistema imunitário. Eles têm sido objecto de grande interesse no desenvolvimento de vacinas contra o cancro, porque eles iniciam directamente, programa e regular as respostas imunológicas específicas do tumor 13. A incorporação de um protocolo de vacinação de incluir DCs tem o potencial para provocar uma resposta imune antitumoral mais forte do que as vacinas de ADN ou de péptidos. Recentemente, desenvolvemos um vetor lentivírus que specifically como alvo as células dendríticas através de uma glicoproteína do vírus Sindbis modificado, SVGmu 14. Estes vetores são os únicos que mostram alta especificidade para as células dendríticas e gerar respostas imunes mais fortes do que inespecíficos, vetores VSVG-pseudotipado. Aqui, apresentamos um método para a produção de grandes quantidades desses lentivirais DC-alvo. Nós demonstramos que estas DC-VEs podem infectar DC e gerar fortes de células T CD8 + respostas imunes. Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de forma humana, sob a aprovação do USC Intitutional Animal Care e do Comitê Use. A fim de realizar experiências in vivo e clínica, que é crítico para criar uma linha de células que podem produzir o vírus a um título elevado. Executar as etapas de transdução e transfecção exatamente como descrito irá maximizar as chances de gerar um tal clone.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Clontech Laboratories, Inc.</td>
			<td>631311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R250-01</td>
			<td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells

Lentivirais (VEs) são um poderoso meio de entrega de material genético para muitos tipos de células. Devido a questões de segurança associadas a esses HIV-1 vetores derivados, produzindo grandes quantidades de VEs é um desafio. Neste artigo, apresentamos um método para a produção de altos títulos de LVs auto-inativação. Nós retroviralmente transduzir o produtor estável tet-off linha celular de GPR para gerar uma linha celular, GPRS, que pode expressar todos os componentes virais, incluindo uma glicoproteína específica de células dendríticas, SVGmu. Então, usamos concatemeric transfecção de ADN para transfectar o LV transferência plasmídeo que codifica um gene repórter GFP, em combinação com um marcador seleccionável. Vários dos clones resultantes podem produzir LV com um título de 10 vezes maior do que aquilo que conseguir com transfecção transitória. Além disso, estes vírus eficiente transduzir células dendríticas in vitro e geração de uma forte resposta imunitária das células T ao antigénio a repórter. Este método pode ser uma boa opção for produção de vacinas fortes baseados em LV para os estudos clínicos de câncer ou doenças infecciosas.

A linha celular estável descrito no presente método pode produzir grandes quantidades de vectores lentivirais que são especificamente orientadas para as células dendríticas. Como mostrado na Figura 1B, o isolamento de clones individuais proporcionou linhas de qualidade variável 12 celulares estáveis. Dos 26 clones testados, 8 produzida partículas lentivirais com um título superior a 10 6 unidades de transdução por ml (TU / ml), que é um ponto de referência comum para l...

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A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Aqui, nós utilizamos a transdução retroviral e transfecção concatemeric para criar uma linha celular que possa expressar os componentes de um vector lentiviral (LV) na ausência de tetraciclina. Este LV codifica GFP e é pseudotipado com glicoproteína, SVGmu, que é específico para um receptor em células dendríticas.

Uma linha de células Tetraciclina-regulado Produz Vetores Lentivirus alta titulação que visam especificamente as células dendríticas

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

a-tetracycline-regulated-cell-line-produces-high-titer-lentiviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.4K visualizações.  University of Southern California, Los Angeles. Aqui, nós utilizamos a transdução retroviral e transfecção concatemeric para criar uma linha celular que possa expressar os componentes de um vector lentiviral (LV) na ausência de tetraciclina. Este LV codifica GFP e é pseudotipado com glicoproteína, SVGmu, que é específico para um receptor em células dendríticas.