המחברים מבקשים להודות מייקל צ&#39;ו, Bingbing דאי, וליאנג שיאו על תרומת הנתונים לכתב היד הזה. אנחנו גם מכירים ד&quot;ר ג&#39;ון גריי על המתנות הנדיבות של חומרים כימיים המשמשות במחקר זה. PB נתמך על ידי מלגת דוקטורט מהמרכז הלאומי לסרטן. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (R01AI68978, P01CA132681 וRCA170820A), מענק של ביל ומלינדה גייטס הקרן, מענק האצת translational מהמרכז המשותף לרפואת Translational ומענק מהאיידס / HIV קליפורניה תכנית מחקר.

תאי מפיק יציבים DC-LV בנויים על בסיס 11 שורת תאי אריזת GPR המכיל את הרכיבים הדרושים lentiviral מערכת ט את gagpol, מתניע ו. ראשית, הוא משמש התמרה retroviral כדי ליצור שורת תאי אריזת GPRS המקודדת גליקופרוטאין SVGmu ט תלוי. לאחר מכן, משמשת transfection מערך concatemer לtransfect קו הסלולרי GPRS עם transgene וקטור lentiviral כגון ה-GFP. הקו הזה יציב מפיק התא, המיועד כLV-MGFP, ניתן לבדוק במבחנה in vivo ליכולת שלה לייצר חיסון DC-LV כנגד ה-GFP. 1. יצירת שורת תאי SVGmu ט תלויה פלסמיד PRX-SVGmu הוא מבנה שבו SVGmu גליקופרוטאין DC הספציפי הוא משובט מורד הזרם של אמרגן TTA-המתקדם של retroviral פלסמיד pRetroX-ט-off 1 (איור 1 ג). 293T תרבות תאי D10 (המדיום השונה Dulbecco של הנשר עם10% בסרום שור עוברי, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין). קו תרבות GPR אריזה בתא D10 עם דוקסיציקלין (1 ng / ml) וpuromycin (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל). כל התאים בתרבית humidified 37 ° C חממה עם 5% CO 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16-18 שעות לפני transfection החולף, צלחת 2 x 10 6 תאים ב293T 4 מ&quot;ל של D10 בצלחת תרבית רקמה של 6 ס&quot;מ כך שהתאים מתקרבים 90% confluency בזמן של transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection של פלסמידים retroviral: לערבב 100 μl CaCl פתרון, מים 1.25 מ &#39;2 סטרילי מילי-Q ואת פלסמידים הבאים: 5 מיקרוגרם PRX-SVGmu, 2.5 מיקרוגרם pGag-Pol, 2.5 מיקרוגרם pVSV-G. הנפח הסופי הוא 500 μl. לצינור קלקר מסביב לתחתית 5 מ&quot;ל, להוסיף 500 2X בהרוורד μl (50 HEPES מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ KCl, 12 מ&quot;מ, 280 מ&quot;מ דקסטרוז NaCl, 1.5 מ&quot;מ Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH 7.05). הוסף dropwise תערובת פלסמיד לתוך מאגר HBS 2X תוך מבעבע החיץ נמרצות עם זכוכית פיפטה פסטר. לאחר הוספת מיילxture, ימשיך מבעבע לשנייה עוד 30. לאחר מכן, מוסיף את כל התערובת על גבי תאי 293T במנת התרבות של 6 ס&quot;מ, ולדגור על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 שעות לאחר transfection, להחליף בזהירות בינונית בצלחת התרבות עם 4 D10 מחומם מראש מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין זיהום: 48 שעות לאחר transfection, קציר SVGmu-קידוד חלקיקי retroviral בsupernatant על ​​ידי העברת supernatant דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. צלחת תאי אריזת GPR בצלחת 24 גם ב2 x 10 4 תאים / היטב. הוסף מסונן supernatant לתאי GPR אריזה בצלחת (2 מ&quot;ל גם /) ותאי צנטריפוגות במשך 90 דקות ב 1050 XG ו25 ° C. שנה בינונית לD10 הטרי עם דוקסיציקלין (1 ננוגרם / מ&quot;ל) אחרי ספין זיהום (2 מ&quot;ל גם /). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72 שעות לאחר transfection, להרחיב את התרבות של תאי transduced אריזה בD10 עם דוקסיציקלין (1 ng / ml) וpuromycin (2 ng / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר את הביטוי של SVGmu, תרבות התאים ללא דוקסיציקלין עבור 48 שעות. מדוד משטח לשעברpression של SVGmu עם cytometry הזרימה באמצעות סרום אנטי Sindbis. תאים אלה מיועדים כקו סלולרי GPRS אריזה. </li></ol> 2. לבנות תאי יצרן DC-LV על ידי Transfection מערך Concatemer Lentiviral ההעברה פלסמיד TL20-GFP הוא inactivating עצמי lentiviral העברת וקטור פלסמיד המבוסס על pCL20c-MSCV-GFP עם מערכת ויסות Dox-RNA נגיפי הגנום ביטוי והחלפה של ציטומגלווירוס (CMV) משפר עם 7 ט מפעילים (איור 1 ג) 11 , 12,15. פלסמיד PGK-ble הוא קלטת (ble) עמידה bleomycin מונעת על ידי אמרגן PGK חלש 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוגרם TL20-GFP דייג&#39;סט 20 פלסמיד עם הגבלת האנזים SfiI ב 50 ° C. מיקרוגרם PGK-ble דייג&#39;סט 20 פלסמיד עם PflMI על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את שברי ה-DNA (קלטת PGK-ble היא 1011 נ&quot;ב וקטורית TL20-GFP הוא 6861 נ&quot;ב) על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את וקטור TL20-GFP וPGK-קלטת ble ביחס טוחנת של 25:1 (אנזים T4 DNA חוד). דגירה הלילה בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קשירת הלילה, לטהר את ה-DNA מתערובת קשירה (דם Qiagen DNeasy וערכת רקמה). להבטיח את כמות ה-DNA המטוהר הוא בסביבות 5 מיקרוגרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16-18 שעות לפני transfection, תאי אריזת GPRS צלחת בצלחת תרבית רקמה של 6 ס&quot;מ כך שconfluency יהיה כ -90% בזמן של transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשיטת transfection סידן פוספט המתוארת בשלב 1.2 לtransfect 5 מיקרוגרם של ה-DNA concatemeric מטוהר לתוך תאי אריזת GPRS בצלחת תרבית הרקמה של 6 ס&quot;מ. 4 שעות לאחר transfection, להסיר בזהירות את המדיום ולהחליף עם D10 4 מ&quot;ל מחומם מראש עם דוקסיציקלין (1 ng / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר transfection, לשנות את המדיום לD10 עם דוקסיציקלין (1 ng / ml) וpuromycin (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל). בחר לשיבוטי transfected ידי הוספת Zeocin (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) במדיום לתרבות. תרבות התאים לכ -2 שבועות עד התא coloniניתן לראות es בתחתית את הכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית מושבות התאים בחלק התחתון של הכלים. קח את המנות בתרבית רקמת 24 גם, מספר הבארות ולהוסיף לכל אחד גם 2 מ&quot;ל D10 המכיל Zeocin (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל), דוקסיציקלין (1 ננוגרם / מ&quot;ל), וpuromycin (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל). לשאוב את המדיום של תאי transduced, ואז להוסיף טיפה אחת של טריפסין על כל אחת מהמושבות לפחות מדקה אחת. לאחר מכן, להוסיף אחד או יותר טיפות של D10 באותן מושבות. תרים מושבות בזה אחר זה עם טפטפת ולהעביר אותם לתוך בארות נפרדות של צלחת תרבית רקמת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ולהרחיב את כל השיבוטים תא D10 המכיל בZeocin (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל), דוקסיציקלין (1 ng / ml) וpuromycin (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לצורך ההערכה של יכולת ייצור נגיפית. </li></ol> 3. להעריך הפקת ויראלי של שיבוט כל סלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאי המפיק והצלחת סביב 4x10 6 תאים בתרבית רקמת מנה של 6 ס&quot;מ בD10 בלי דוקסיציקלין כזה שconfluencyעולה על 90%. החלף את המדיום עם D10 מחומם מראש טרי מדי יום ולאסוף את המדיום לשעת כייל assay 72 לאחר הסרת DOX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את supernatant הנגיפי על ידי סינון הבינוני עם מסנן 0.45 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי יעד פלייט מבטאים את הקולטן DC-Sign (293T.hDC-סימן או מח עצם עכבר נגזר תאים דנדריטים 16 למשל) ו293T כביקורת שלילית בתרבות מנות 96, גם, 1 x 10 4 תאים / היטב. הוסף דילולים סדרתי פי 2 supernatant ויראלי לבארות (100 μl / טוב). בדרך כלל, 6-8 דילולים מספיקים כדי להגיע לטווח שבו transduced GFP חיובי תאים נמצאים במערכת יחסים ליניארי לכמות הנגיף הוסיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ולהחליף את המדיום כמתואר בשלב 1.4. BMDCs צריך להיות תרבותי במדיום RPMI עם FBS 10% ו-GM-CSF (01:20 בינונית מותנה J558L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הביטוי של GFP בtransduced תאים על ידי זרימת cytometry 4-6 ימים לאחר תמרה. Vecto lentiviralr כייל מחושב בטווח דילול הווקטור כאשר אחוז תאי GFP החיוביים ואת סכום וקטור נמצא במערכת יחסים ליניארי. בחר את התא עם שיבוט הייצור הנגיפי הגבוה ביותר עבור יישומים שלאחר מכן. </li></ol> 4. לייצר ותתרכז וקטורי lentiviral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות שורת תאי המפיק (LV-MGFP) במנות בתרבית רקמת 15 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאי המפיק ופלייט התאים בצלחות תרבית רקמת 15 סנטימטר בגדול יותר מ -90% בconfluency D10 הטרי ללא דוקסיציקלין. שנה בינונית עם D10 טרי, מחומם מראש יומית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ייצור נגיפי שיא (כפי שנקבע על ידי המשתמש), למסוק את supernatant ויראלי ולסנן אותו באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. טען את supernatant המסונן לתוך צינורות ultracentrifuge 32.5 מ&quot;ל קיר עבה, לאטום עם parafilm צנטריפוגות ב 50,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. יסודיות resuspend גלולה ב50 μl או נפח מתאים של PBS או HBSS בהתאם ליישום. &lt;/ P&gt; </ol> 5. לחסן עכברים in vivo וניתוח תגובה חיסונית אנטיגן ספציפית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר וירוס כייל גבוה כאמור בסעיף 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק BALB / C (6-8 בשבוע ישן, נקבה) דרך מסלול שודד עם ההשעיה הווקטור (25 μl לשודד דרכים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 שבועות לאחר חיסון, לבודד טחול וsplenocytes קציר. splenocytes תרבות עם פפטידים epitope GFP ולנתח את נוכחותו של ה-GFP-CD8 + T התאים ספציפי באמצעות מכתים ציטוקינים תאי, כפי שתואר 17 (איור 3) בעבר. </li></ol>

<ol>
	<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Kootstra, N. A., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+with+viral+vectors.">Gene therapy with viral vectors.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration.">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genotoxic+potential+of+retroviral+vectors+is+strongly+modulated+by+vector+design+and+integration+site+selection+in+a+mouse+model+of+HSC+gene+therapy.">The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).</li><li>Hu, B., Tai, A., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+delivered+by+lentiviral+vectors+for+cancer+and+infectious+diseases.">Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases.</a> Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).</li><li>Broussau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+packaging+cells+for+large-scale+production+of+lentiviral+vectors+in+serum-free+suspension+culture.">Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).</li><li>Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trans-lentiviral+packaging+cell+line+for+high-titer+conditional+self-inactivating+HIV-1+vectors.">A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+high-titer+HIV-1+vector+production.">Continuous high-titer HIV-1 vector production.</a> Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).</li><li>Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+packaging+cell+line+for+lentivirus+vectors.">A packaging cell line for lentivirus vectors.</a> Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).</li><li>Strang, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+vectors+with+alphavirus+envelope+glycoproteins+produced+from+stable+packaging+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells.</a> Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).</li><li>Throm, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+construction+of+producer+cell+lines+for+a+SIN+lentiviral+vector+for+SCID-X1+gene+therapy+by+concatemeric+array+transfection.">Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection.</a> Blood. 113, 5104-5110 (2009).</li><li>Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+stable+producer+cells+to+make+high-titer+lentiviral+vectors+for+dendritic+cell-based+vaccination.">Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).</li><li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+dendritic+cells+into+medicine.">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449, 419-426 (2007).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+lentivector+targeting+of+dendritic+cells+for+in+vivo+immunization.">Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization.</a> Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).</li><li>Hanawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+rhesus+repopulating+hematopoietic+stem+cells+using+a+simian+immunodeficiency+virus-based+lentiviral+vector+system.">Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system.</a> Blood. 103, 4062-4069 (2004).</li><li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells.">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).</li><li>Dai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Gag-specific+immunity+induced+by+a+lentivector-based+vaccine+directed+to+dendritic+cells.">HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Grade+Lentiviral+Vectors.">Clinical Grade Lentiviral Vectors.</a> Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).</li><li>Loew, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+PG13-based+packaging+cell+line+for+stable+production+of+clinical-grade+self-inactivating+gamma-retroviral+vectors+using+targeted+integration.">A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration.</a> Gene Ther. 17, 272-280 (2010).</li><li>Gaspar, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+use+of+a+pseudotyped+gammaretroviral+vector.">Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector.</a> Lancet. 364, 2181-2187 (2004).</li><li>Cornetta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+lentivirus+analysis+of+clinical+grade+vector+products.">Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).</li><li>Stewart, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+producer+cell+line+for+the+manufacture+of+a+lentiviral+vector+for+gene+therapy+of+Parkinson's+disease.">A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease.</a> Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).</li><li>Coroadinha, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+producer+cell+line+metabolism:+implications+on+viral+productivity.">Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.</p

הנה, יש לנו התווינו שיטה להפקת כמויות גדולות של וקטורי lentiviral באמצעות 293T תאים ביציבות transduced עם כל רכיבי lentiviral תחת ט &#39;את המערכת הרגולטורית. נכון להיום, רוב הפרוטוקולים לייצר וקטורי lentiviral להסתמך על transfection פוספט סידן חולפת הסטנדרטית (ראה 18, לדוגמה). גישה זו הייתה מ?...

מערכות וקטור רבות פותחו למסירת גן. וקטורים המבוססים על lentiviruses היו בין המערכת נגיפית למדה הנפוץ ביותר. וקטורים אלה הם יתרון משום שהם יכולים ביעילות transduce גם החלוקה ולא חלוקת תאי 1, להשיג ביטוי לטווח ארוך בשל אינטגרציה לתוך הגנום המארח, מפגין חסינות נגד וקטור טבעי נמוכה ברוב האוכלוסיות אנושיות 2, ויש להם פוטנציאל נמוך ל genotoxicity מmutagenesis insertional 3,4. ייצור של lentiviruses מאז ומתמיד שנצבעה על ידי חששות בטיחות. וקטורי lentiviral בדרך כלל נגזרים מHIV-1, הסוכן האטיולוגי של איידס. transfection חולף של רכיבים בודדים של Lentivector (העברה, מעטפה, ופלסמידים אריזה) הוא אמצעי נפוץ וגמיש להעברת חומר גנטי בהגדרות מעבדה. עם זאת, דרוג-up transfections חולף ליישומים קליניים הוא מסורבל ואמאy להוביל להתפתחות של lentivirus שכפול מוסמך 5,6. כדי להתגבר על המכשולים הללו, שורות תאים המפיקים כמה אריזות ויציבים פותחו 6-11. יש לאחד את השורות האלה, קו אריזת GPR 11, היתרון האטרקטיבי של להיות מוסדר על ידי טטרציקלין. במאמר זה, אנו מדגימים כיצד להתאים את המערכת הזו כדי לייצר וקטורי inactivating עצמי lentiviral המיועדים באופן ספציפי לתאים דנדריטים (DC-LVS) 12. תאים דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן החזקים ביותר של המערכת החיסונית. הם היו הנושא של עניין רב בפיתוח חיסון לסרטן משום שהם מפעילים ישירות, תכנית, ולווסת תגובות חיסוניות ספציפיות לגידול 13. שילוב פרוטוקול חיסון לכלול DCs יש פוטנציאל לעורר תגובה חיסונית חזקה יותר מאשר חיסוני antitumor פפטיד או ה-DNA. לאחרונה, פיתחנו וקטור lentiviral שspecifically מטרות תאים דנדריטיים באמצעות שינוי גליקופרוטאין וירוס sindbis, SVGmu 14. וקטורים אלה הם ייחודיים בכך שהם מראים סגוליות גבוהים לתאים דנדריטים ולייצר תגובה חיסונית חזקה יותר מאשר וקטורים ספציפיים, VSVg-Pseudotyped. כאן, אנו מדווחים על שיטה להפקת כמויות גדולות של וקטורי lentiviral DC במיקוד אלה. אנו מראים כי אלה DC-LVS יכול להדביק DCs וליצור CD8 + T תגובות תא חיסוניים חזקות. כל ההליכים כרוכים בבעלי חיים בוצעו אנושי, תחת האישור של הטיפול בבעלי חי Intitutional USC ועדת שימוש. על מנת לבצע בניסויי vivo וקליניים, זה קריטי כדי ליצור שורת תאים שיכולים לייצר נגיף בכייל גבוה. ביצוע ההתמרה וtransfection הצעדים בדיוק כפי שתוארו יהיה למקסם את הסיכויים ליצירת שיבוט כזה.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Clontech Laboratories, Inc.</td>
			<td>631311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R250-01</td>
			<td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells

וקטורי lentiviral (LVS) הם אמצעי רב עוצמה להעברת חומר גנטי לסוגים רבים של תאים. בגלל חששות בטיחות הקשורות לוקטורי HIV-1 הנגזרים אלה, מפרישים כמויות גדולות של LVS הוא מאתגר. במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה לייצור titers גבוהה של LVS עצמי inactivating. אנו retrovirally transduce ט פעמי היציב מפיק תא הקו GPR כדי ליצור שורת תאים, GPRS, שיכול לבטא את כל המרכיבים הנגיפיים, כולל גליקופרוטאין תא ספציפי הדנדריטים, SVGmu. לאחר מכן, אנו משתמשים transfection DNA concatemeric לtransfect קידוד פלסמיד העברת LV GFP גן כתב בשילוב עם סמן לבחירה. כמה משיבוטי כתוצאה מכך יכול לייצר LV בכייל פי 10 יותר ממה שנשיג עם transfection חולף. בנוסף, וירוסים אלה ביעילות transduce תאים דנדריטים במבחנה וליצור תגובה חיסונית חזקה תא T לאנטיגן הכתב שלנו. שיטה זו עשויה להיות אפשרות טובה עבורr ייצור חיסונים מבוססי LV חזקים למחקרים קליניים של סרטן או מחלות זיהומיות.

שורת התאים היציבה שתוארה בשיטה זו ניתן לייצר כמויות גדולות של וקטורי lentiviral המיועדים באופן ספציפי לתאים דנדריטים. כפי שניתן לראות באיור 1, בידוד של שיבוטים בודדים הניב שורות תאי יציבות באיכות משתנה 12. בין 26 שיבוטים שנבדקו, 8 מיוצרים חלקיקי lentiviral בכייל של...

Watch this Scientific Journal Video about A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells at JoVE.com

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

כאן, אנו משתמשים התמרה retroviral וtransfection concatemeric כדי ליצור שורת תאים שיכולים לבטא את הרכיבים של וקטור lentiviral (LV) בהיעדר טטרציקלין. זה LV מקודד GFP וPseudotyped עם גליקופרוטאין, SVGmu, שהוא ספציפי לקולטן על תאים דנדריטים.

שורת תאי טטרציקלין מוסדר מייצרת וקטורי lentiviral גבוה כייל שמתמקדים תאי דנדריטים

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

a-tetracycline-regulated-cell-line-produces-high-titer-lentiviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.4K Views.  University of Southern California, Los Angeles. כאן, אנו משתמשים התמרה retroviral וtransfection concatemeric כדי ליצור שורת תאים שיכולים לבטא את הרכיבים של וקטור lentiviral (LV) בהיעדר טטרציקלין. זה LV מקודד GFP וPseudotyped עם גליקופרוטאין, SVGmu, שהוא ספציפי לקולטן על תאים דנדריטים.

Video: A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H דימות תהודה מגנטית

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

יצירת חיסון חדשני לתאים דנדריטיים באמצעות מלנומה ותאי גזע סרטניים קשקשיים

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

הדור של בוגר, בוגרת Tolerogenic דנדריטים תאים, עם שינוי פנוטיפים מטבולית

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים Site-Specifically Acetylated Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...