MKK Birleşik Krallık&#39;ın Mühendislik ve kişisel Bursu için Fiziksel Bilimler Araştırma Konseyi (EPSRC) Yaşam Bilimleri Arayüz programı sayesinde. Ayrıca Birleşik Krallık&#39;ın Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) tarafından finansman kabul etmek istiyorum.

Flim numune hazırlama için protokoller konfokal veya geniş alan şiddeti tabanlı floresan mikroskobu için farklılık yok. Veri toplama yani ham verilerden floresans yaşam ayıklanması, veri analizi ana görevi takip eder. Bir kere bu elde edilmiştir, veri yorumlama hipotez doğrulamak veya çürütmek için yardımcı olur. 1. Moleküler rotorlar ile boyanarak hücre <ol><li> In boya yaklaşık 1 mg / ml eriterek bir stok çözelti (10 ml) hazırlamak uygun bir çözücü (BODIPY-C 12 örneğin metanol) 6,7 doğru denge ve bir pipet kullanılarak. </li><li> Lekeli olmak hücreleri (bizim durumumuzda bir model kanser hücre dizisi, HeLa) ~% 80 konfluent kadar% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C&#39;de küvözde, mikroskopi için coverslide alt bir multiwell plaka üzerinde yetiştirilen . </li><li> 10 Ekle - stok solüsyonu 20 ul çok wel büyüyen canlı hücreler içinOpti-MEM ortamı (GIBCO) başına de bir 6-kuyucuklu plak için 4 ml l plakası (SmartSlide 50 mikro-inkübasyon sistemi, Wafergen). Bu iyi bir mikro-molar boya konsantrasyonu verir. </li><li> Boyanması için 10-45 dakika için% 5 CO2 atmosfer ile 37 ° C &#39;de bir inkübatör için çok kuyucuklu plak döner. </li><li> Inkübatör gelen multiwell plaka çıkarın ve fazla boya kaldırmak için 4 ml optik olarak berrak hücreli kültür ortamı (örneğin Opti-MEM) ile hücreleri 3-4 kez yıkayın. </li><li> Mikroskop sahneye multiwell plaka aktarın ve gerektiği gibi görüntüleme için hazırlık, bir sıcaklık kontrolörü /% 5 CO 2 gaz girişine bağlayın. </li></ol> 2. Hücrelerdeki floresan moleküler rotorların flim <ol><li> Mikroskop sahnede örnek yerleştirin ve bir iletim ve floresan hücrelerini tanımlamak için floresan görüntü elde. Kurulum deneysel bir şematik diyagramıdır Şek. 1.Verify olduğu yerlerde Expe gelen floresans kaynaklanmaktadırcted (örneğin, hücre zarı, sitoplazma). Bir floresan emisyon spektrumunu elde edilir, bu durumda, molekül rotor tayfı beklenen boya veya proteinin bir olduğunu doğrulamak. Bir negatif kontrol olarak, resim, bir non-boyanmış ve bu örnek floresan olmadığını kontrol. Bu adım flim için özel olarak gerekli olmamasına rağmen, genel olarak iyi uygulama ve örnek Sence ne olduğunu doğrulamak için yardımcı olur. </li><li> Flim moduna geç - Bu kolayca flüoresan tespiti ışın yolu (Leica TCS SP2 devralma kontrolü yazılımı &quot;ışın yolu ayarı&quot; panelinde &quot;dedektör&quot; düğmesi) bir ayna hareket gerçekleştirilir. Dedektör ulaşan herhangi bir heyecan ışığı bloke etmek için uygun floresans emisyon filtresi floresan algılama beampath olmalıdır. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> Şekil 1. Ac kullanarak time-domain flim için deneysel düzenlemeonfocal lazer tarama mikroskobu. <ol start="3"><li> Örnek Tarama ve dedektör sayısı oranı (Becker &amp; Hickl SPC 830 kurulunun satın kontrol yazılımı CFD etiketli siyah bar) artık lazer tekrarlama oranı yaklaşık% 1 (daha olduğunu, Flim satın kontrol bilgisayarı kontrol yeşil çubuk) SYNC kazanım kontrol yazılımı etiketli. Eğer öyleyse, kazık kadar çarpık floresans bozunum eğrileri toplama önlemek için, lazer ışını yolu bir nötral yoğunluk filtresi koyarak örneğin lazer uyarılma yoğunluğu azaltın. </li><li> , Tipik olarak 3-5 dakika süreyle, bir flim görüntü elde tarama durdurmak ve ham veri (3D veri mekansal koordinatları x ve y oluşan &quot;küp&quot;, ve zamandan tasarruf). </li><li> Örneğin TRI-2 14 veya ticari yazılım, floresan görüntüyü göstermek için floresans bozunum analiz yazılımı paketi ham veri, açın. Bu basitçe entegre floresans çürümesi, her, floresans bozunum eğrisi altında kalan alan yanipiksel. </li><li> Üzerine imleci yerleştirerek tipik bir piksel seçin ve o piksel içinde floresans bozunum inceleyin. Pik sayısı 100&#39;ün altında ise, piksel mekansal binning kullanın. Bitişik piksel (örn. 3x3 veya 5x5) ile sayımları, bir yüksek tepe sayısı da elde edilir, böylece, merkezi bir piksel içine eklenir. Bu, bir sonraki aşama için daha yüksek bir istatistiksel doğruluk sağlar. Alternatif olarak, ölçme uzun edinimi süresi (5. adım) için tekrar edilebilir. 30-50dakika için, yaklaşık 10 kat daha yüksek pik sayımı (ve toplam sayıları) elde edilir, ama bu çok uzun far, çünkü örnek hareketi nedeniyle eserler, mikroskop sürüklenme, fototoksisite ve tanıtma tehlikesi çoğu biyolojik örnekler için bir kazanım zamanı olarak photobleaching. </li><li> Küresel bir piksel eşik değerini (piksel çürüme takıldığı üstte) seçin ve görüntüyü tek bir üstel bozulma uygun geçerlidir. Sonuç sonra kodlanmıştır eşiğinin üzerinde her piksel için bir floresan ömrü verirrenk. Her piksel oturması sonucu ile renklendirilir ve bir flim haritası elde edilir. Çeşitli piksel için azaltılmış ki-kare değerleri kontrol edin - 1 civarında (ve yukarı 1.3) iyi bir uyum gösterir. Rastgele sıfır etrafında dağıtılması gerekmektedir gelen artıklar, inceleyin. </li><li> Floresans ömrü histogram belli floresans ömürleri floresans ömrü kendisini karşı ortaya ne sıklıkta araziler. Floresans ömrü dağıtım renk aralığına uyan renk yelpazesi gibi ayarlayın. </li><li> Bir monoexponential uyum yaklaşık 1 bir ki-kare değeri (ve yukarı 1.3) vermezse, ve sıfırdan artıklar sistematik bir sapma olursa, daha gelişmiş bir modeli gereklidir. Örneğin, sonda uygun biri ile de boya miktarı göreceli bir göstergesidir ön-üstel faktörleri veya genlikleri verecektir inç olabilecek iki farklı ortamlar için hesaba, floresans bozunumları bir çift üstel modeli uydurma deneyin çevreMent veya diğer. Alternatif olarak, bir gerilmiş üstel fonksiyonu floresans yaşamların bir dağıtım hesabını vermek uygun olabilir. </li><li> Her bir piksel için floresans ömürleri, pre-üstel faktörleri ve ömrü oranı ve pre-üstel faktörü oranı sonuçları daha sonra renkli kodlanabilir. Her bir piksel ile bir değere göre renkli, ve floresans ömürleri, pre-üstel faktörleri ve bunların oranları nedeniyle kontrast elde edilir. Iyi bir uyum gösterir yaklaşık 1 (en fazla 1.3) - Yine, azaltılmış ki-kare değerleri (renkli kodlanmış ve görüntü haline edilebilir) kontrol edin. Rastgele sıfır etrafında dağıtılması gerekmektedir artıklar, inceleyin. </li><li> Floresans ömrü histogramlar ortalama floresans ömrü değerlerin kolay görselleştirme ve floresans ömrü dağıtımı için tüm görüntüleri eşlik etmelidir. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Floresans bozunumu için ölçülenMetanol / gliserol karışımlarında viskozite arttırıcı olarak floresan moleküler rotor Şekil &#39;de gösterilmiştir. 2. Floresans bozunur monoexponential, ve floresans ömrü viskozitesi bir fonksiyonu olarak belirgin bir şekilde değişir. Bu metanol içinde yaklaşık 300 ps (viskozite 0.6 cP) den% 95 gliserol (viskozite 950 cP) 3.4 ns artırır. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> BODIPY-C için Şekil 2. Floresans çürümesi profilleri değişen viskozite metanol / gliserol karışımları 12. 6 Floresans ömür boyu logaritmik kalibrasyon arsa τ karşı floresan moleküler rotor için viskozitesi η Şek. 3. Förster Hoffman denklemi 9 talep olarak düz bir çizgi <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> k 0 radiativ olduğue sabit bir oranda ve z, x 0 &lt;x &lt;1 ile, sabittir. Iki verimleri hem Serinin <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="Denklem 2" /> x yerde doğrunun degrade olduğunu. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> Şekil 3. Förster-Hoffmann denklemine uygun BODIPY-C 12 verim düz bir hat için günlük floresans ömrü vs günlük viskoziteli bir arsa. 6 Floresan moleküler rotor ile yaşayan hücrelerin inkübasyonu takiben bir punktat boya dağıtım floresans görüntüleri görülmektedir. Bir meso-sübstitüe BODIPY boya ile inkübe HeLa hücrelerinin Flim görüntü şekil gösterilmektedir. 4. Görüntünün her piksel floresans çürükleri yeterli tek bir üstel bozulma modeli kullanılarak monte edilebilir. Şekil 4. (A) floresans yoğunluğunu ve BODIPY-C 12 ile boyanmış HeLa hücreleri (b) flim görüntüler. Parlak, noktasal bölgelerde diğer bölgelere göre daha kısa bir ömür boyu sergiler. Bu, daha kısa liftime Förster-Hoffmann denkleme göre, punktumlarda daha düşük bir viskoziteye, muhtemelen lipid damlacıkları karşılık gelir. Her bir piksel ile ekstre ömürleri çizdirme ederek, Şek tüm görüntünün bir floresans ömrü çubuk elde edilir. 5. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> Şekil 5. Meso-sübstitüe BODIPY moleküler rotorlar ile boyanmış HeLa hücrelerinin flim görüntüleri floresans yaşamların Histogramlar.

<ol>
	<li>Luby-Phelps, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+and+physical+properties+of+cytoplasm:+Volume,+viscosity.+diffusion,+intracellular+surface+area.">Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area.</a> International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).</li><li>Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+as+a+CAMP-dependent+regulator+of+sodium+channels.">CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels.</a> Science. 269, 847-850 (1995).</li><li>Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+reduced+red+blood+cell+deformability+in+severe+falciparum+malaria.">Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).</li><li>Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A., Demchenko, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. 8, 267-308 (2010).</li><li>Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-sensitive+behavior+of+fluorescent+molecular+rotors.">Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors.</a> J. Biol. Eng. 4, (2010).</li><li>Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Rotor+Measures+Viscosity+of+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).</li><li>Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Bound+Molecular+Rotors+Measure+Viscosity+in+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).</li><li>Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Sol-to-Gel+Transitions+via+Fluorescence+Lifetime+Determination+Using+Viscosity+Sensitive+Fluorescent+Probes.">Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes.</a> J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).</li><li>Förster, T., Hoffmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Viskosit&#228;tsabh&#228;ngigkeit+der+Fluoreszenzquantenausbeuten+einiger+Farbstoffsysteme.">Die Viskosit&#228;tsabh&#228;ngigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme.</a> Zeitschrift f&#252;r Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).</li><li>vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+and+Their+Remedies+in+Time-Resolved+Fluorescence+Spectroscopy+and+Microscopy.">Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy.</a> J. Fluores. 15, 377-413 (2005).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , (2005).</li><li>O'Connor, D. V., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-correlated single-photon counting. , (1984).</li><li>Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).</li><li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Flim yoğunluğu tabanlı floresan görüntüleme üzerinden bazı önemli avantajlar sunuyor. Bu fluorofor konsantrasyon etkileri onları ayırabilirsiniz, çünkü floresan görüntüleme ile gözlemlemek zor veya imkansızdır fotofiziksel olayları rapor edebilirsiniz. Bu görüntüleme flüoresan moleküler rotorlar tarafından intraselüler viskozitesi haritalanması için özellikle yararlıdır. Şek floresans boyunca kolaylıkla, bir kalibrasyon grafiği kullanılarak bir viskoziteye dönüştürülebilir. 3, floresan moleküler rotorların konsantrasyonu bağımsızdır. Flim verileri yorumlamayı güçleştirebilir eserler olabilir. 10 Enstrümantal eserler floresans çürüme başlangıcı üstüne bir zirve olarak görünecek ve kısa bir yıkım zamanı ile karışabilir saçılan ışık, ya sonra küçük bir tepe vardır IRF hangi mikroskop içindeki yansımaları neden olabilir. Bu dağınık ışık eserler gibi tespit edilebilironlar spektral ayrımcılık ile ayırt edilebilir çünkü - onlar heyecan verici ışık ile aynı dalga boyunda her zaman vardır. Hava, ışık 1 nanosaniye 30 cm seyahat eden Hatırlama yansımaları kökeni kesin olarak belirlemek için yardımcı olur. Filtre veya cam floresan de özellikle düşük örnek floresans at, bir dışlayıcı neden olabilir, ancak bu kolay örnek olmadan bir ölçü alınarak tespit edilebilir: Bir çürüme, bu koşullar altında elde edilir, eğer araç nedeniyle ve hiçbir ilgisi yoktur Örnek ile! Diğer taraftan, örnek otofloresans da floresan çürümesine neden olabileceğini unutmayın. Zaman ilişkili tek foton sayımında (TCSPC), süre-genlik çevirici (TAC) Lineer olmayan yoksul nöbete neden olabilir, ancak uyarma engelleme ve örnek üzerine iletilen ışık kaynağından örneğin ortam ışığı, parlayan tarafından tespit edilebilir ve zamanlaması ölçülmesi. Sabit bir arka olmalıdırgörüntünün her pikseline elde edilen. Sabit bir arka plan sapmalar meydana Bölgeler, iyi bir uyum verim asla ve TCSPC kartı parametrelerini ayarlayarak önlenememesi durumunda ölçüm için kaçınılmalıdır. TCSPC biri rezil artifact çok yüksek bir foton yakalama oranı neden olan kazık-up fotondur. 11,12 Bu elektronik zamanlama meşgul olduğu için herhangi bir sonraki fotonlar yok sayarak ve ilk foton işleme, zamanlanmış olan sadece ilk foton yol açar. Floresans ömrü bir kısalma, ve bunu önlemek için en iyi yolu, Pile-up uçları lazer tekrarlama oranı yaklaşık% 1&#39;ini de foton sayısı oranı tutmaktır. Görünüm Uygulamaya bağlı olarak, var flim çeşitli uygulamaları vardır ve her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır. 13 ideal bir floresan mikroskop sahip olacağı tüm boyutlu floresans emissiotek foton hassasiyet, maksimum uzamsal çözünürlük ve minimum alma süresi ile tek bir ölçüm yoğunluğu, konum, kullanım ömrü, dalga boyu ve polarizasyon, n kontur. Orada özellikleri bu eşsiz kombinasyonu ile hiçbir teknoloji şu anda, ve bir inşa etmek enstrümantasyon geliştiriciler için bir sorun olmaya devam etmektedir. Hücre biyolojisinde önemli sorunlara yeni fiziksel tekniklerin uygulanması çoğu zaman beklenmeyen buluşları yolu olduğunu ve hücre biyolojisi için floresans görüntüleme doyurarak yetenekleri yakın olan önce gitmek için uzun bir yol var. Aslında, böyle ömür boyu, spektrum ve polarizasyon gibi yüksek uzaysal çözünürlükte 3D daha hızlı görüntüleme gibi görüntüleme floresan parametrelerini, hücre biyolojisinde yeni yönlerini açığa kesindir.

Floresan moleküler rotorlar ile Örnek Donanım: Ters Leica TCS SP2 konfokal tarama mikroskobu Tutarlı Mira 900 Ti: Bir Verdi V6 pompa lazer veya Hamamatsu PLP-10 470 pikosaniye pulsed diode lazer uyarma kaynağı ile Sapphire femtosecond laser Becker &amp; Hickl SPC 3GHz 830 pansiyon, Pentium IV, Windows XP ile 1GB RAM bilgisayar soğutmalı Becker &amp; Hickl PMC100-01 dedektör kafası Hamamatsu H5773P-01 mikroskop nin X1 noktası üzerine monte photomultipliers, ya da hibrid dedektörler dayalı DCC 100 dedektör kontrol modülü Yazılım: TRI-2 14 veya Becker &amp; Hickl tarafından SPCImage 2.8

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

Difüzyon genellikle kimyasal tepkimeler veya biyolojik proseslerle önemli bir oran-belirleyen bir adım ve intraselüler olaylar, geniş bir aralıktaki bir rol oynar. Viskozite moleküllerin ve proteinlerin difüzyon etkileyen temel parametrelerden biridir, ve viskozite değişiklikleri hücresel düzeyde hastalık ve arıza bağlantılı olmuştur. 1-3 toplu viskozitesini ölçmek için yöntemler de geliştirilmiş olmakla birlikte, görüntüleme microviscosity bir sorun olmaya devam . Son zamanlarda elde etmek zor oldu kadar bu tek hücre gibi mikroskobik nesnelerin Viskozite haritalar, var. Diğer optik teknikler benzer, bu tahribatsız, minimal invaziv ve canlı hücrelere ve dokulara uygulanabilir, çünkü floresans teknikleri ile Haritalama viskozite avantajlıdır. Floresan moleküler rotorlar floresans süreleri ve bunların mikroçevresinin viskozitesi bir fonksiyonu vardır kuantum verimleri sergilerler. 4,5 Moleküliçi büküm veyaDönme uyarılmış duruma geri asıl durumuna olmayan radyatif sönümü yol açar. Bir viskoz ortam bu ışıksız çürümesine yol erişimi kısıtlayarak, bu rotasyon veya büküm yavaşlatır. Bu floresans kuantum verimi ve floresans ömrü bir artışa yol açar. Floresan moleküler rotor olarak hareket değiştirilmiş hidrofobik BODIPY boyaların Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) bu prob floresans yaşam ortamlarının microviscosity bir fonksiyonu olduğunu gösteriyor. 6-8 çözücü viskozitesi verimi karşı floresans ömrü bir logaritmik grafikte Förster Hoffman denklemi itaat düz bir çizgi. 9 Bu komplo da viskozite içine floresans ömrü dönüştürmek için bir kalibrasyon grafiği olarak hizmet vermektedir. Modifiye BODIPY floresan moleküler rotor ile yaşayan hücrelerin inkübasyonu takiben, noktasal boya dağıtım floresans görüntüleri görülmektedir. Th elde viskozite değericanlı hücrelerde e punktumlarda yaklaşık 100 kez su daha yüksek olduğu ve hücresel sitoplazmaya taşır. 6,7 Zaman bağımlı floresans anizotropi ölçümler bu büyük microviscosity değerleri ile uyum içinde dönme korelasyon kat verim. Floresans ömrü eşleyerek floresans yoğunluğunu bağımsızdır ve böylece prob konsantrasyonu ve viskozite etkileri ayırma sağlar. Özet olarak, floresan moleküler rotorların flim dayalı hücrelerinde microviscosity eşlemek için pratik ve çok yönlü bir yaklaşım geliştirdik.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells at JoVE.com

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) görüntü ortamı ve spesifik proteinlerin ve canlı hücreler boyaların etkileşimi önemli bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Floresan moleküler rotor flim canlı hücreler viskozitenin haritalama sağlar.

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

fluorescence-lifetime-imaging-of-molecular-rotors-in-living-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.8K Görüntüleme.  King's College London. Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) görüntü ortamı ve spesifik proteinlerin ve canlı hücreler boyaların etkileşimi önemli bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Floresan moleküler rotor flim canlı hücreler viskozitenin haritalama sağlar.

Video: Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Biyomühendislik

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Bir Çok Kanallı Çift elektrik alan mikroakışkan Chip kullanarak Akciğer Kanseri Hücreleri Electrotaxis Çalışmaları

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...