Test, hastaların IgE ve alerjenlerin çapraz bağlanmasıyla indüklenen bazofillerin degranülasyonlarını simüle etmek için önemli bir araştırma aracını temsil eder. Böylece test tip 1, alerjik reaksiyonları taklit etmek için kullanılabilir. Test sağlam, tekrarlanabilir ve uyarlanabilir.
Ayrıca, az miktarda rekombinant veya saflaştırılmış alerjen veya hatta karmaşık alerjen özleri ile gerçekleştirilebildiği için oldukça hassastır. Yöntem, hastaların IgE'nin alerjenlere karşı reaktivitesini analiz ettiği için alerjileri teşhis etmek için kullanılır. Ayrıca bu yöntem çapraz reaktiviteyi analiz etmek ve AIT tedavi etkinliğini izlemek için uygundur.
Hücre kültürü şişesinden Ag8 hücrelerini toplayarak başlayın ve hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın. Pellet, oda sıcaklığında 250 kat g'da, beş dakika boyunca santrifüjleme ile hücreleri aşağı. Süpernatantı epire edin ve hücre peletini, insanlaştırılmış, RBL hücreleri ortamında mililitre başına, altıncı hücrelere yaklaşık bir kez 10 kez son konsantrasyona yeniden depolayın.
Testte bir ila 20 arasında son serum seyreltilmesi için Ag8 hücre süspansiyonunda insan serasını bir ila 10 arasında seyreltin ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın ve% beş ila% 7 karbondioksit. İnsanlaştırılmış RBL hücreleri% 50 ila 90 izdiah ulaştığında, yapıştığınız insanlaştırılmış RBL hücrelerine dokunmadan ortamı bir T-75 hücre kültürü şişesinden dikkatlice epire edin. Şişenin karşı tarafına 10 mililitre DPBS ekleyerek hücreleri iki kez yıkayın ve doğrudan hücrelere değil.
DPBS'yi aspire edin, hücre müfrezesi için bir kez önceden ısıtılmış beş mililitre trypsin-EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri ayırmak için şişeye hafifçe dokunun. Hücre süspansiyonunu 15 milimetrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve trypsin-EDTA'yı seyreltmek için tüpü insanlaştırılmış RBL hücre ortamı veya DPBS ile doldurun.
Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 kez g'da santrifüjleyin. Süpernatantı emiş edin ve peletin hücre sayımı için beş mililitre insanlaştırılmış RBL hücre ortamına yeniden koyun. Hücreleri saydıktan sonra, mililitre başına altıncı hücrelere iki kez 10 nihai konsantrasyon elde etmek için insanlaştırılmış RBL hücre ortamındaki hücreleri seyreltin.
Steril 96 kuyulu bir plakada kuyu başına bir kez 10'a eşdeğer, insanlaştırılmış 50 mikrolitre RBL hücre süspansiyonu ekleyin. Önceden inkübe edilmiş Ag8 serum süspansiyonunu santrifüj edin ve ag8 hücre peletini bozmadan, insanlaştırılmış RBL hücreleri içeren her kuyuya 50 mikrolitre santrifüj Ag8 serum süspansiyonu aktarın. Alt sinyal platosunun veya arka planın endikasyonu için antijen kontrolü olmadığı için antijen içermeyen duyarlılaştırılmış uyarılmamış hücreler kullanın ve arka planı ve maksimum lizis kontrol kuyularını duyarlı hale etmeyin.
Plakayı kapakla örtün ve gece boyunca 37 santigrat derecede ve% beş ila% 7 karbondioksitte kuluçkaya yatırın. Hücre ortamı içeren serayı epire edin, emici kağıdın üzerindeki plakayı ters çevirin ve dokunarak insanlaştırılmış RBL hücrelerini yıkamak için plakayı boşaltın. Kuyu başına 200 mikrolitre Tyrode tamponu ekleyerek hücreleri üç kez yıkayın ve ilk iki yıkama için yıkama başına yaklaşık 30 saniye kuluçkaya yatırın.
Tyrode'un tamponunu üçüncü kez ekledikten sonra, tamponu aspire edin ve çözeltiyi antijen seyreltmeyi eklemeye hazır olana kadar kuyularda bırakın. Önceden hassaslaştırılmış insanlaştırılmış RBL hücrelerini içeren her kuyuya 100 mikrolitre antijen çözeltisi aktarın, ancak antijen ile maksimum liziz ve duyarlı olmayan arka plan hücrelerini uyarmayın. Maksimum lizis kontrol kuyularına, hassaslaştırılmamış arka plan kontrol kuyularına ve hassaslaştırılmış antijensiz kuyulara 100 mikrolitre Tyrode tamponu ekleyin.
Hücreleri 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatır ve %5 ila %7 karbondioksit. Maksimum lizis kontrol kuyularını kuyu başına %10 Triton X-100'ün 10 mikrolitresi ile tedavi edin ve beta-hexosaminidaz'ın% 100 salınımı için hücreleri tamamen susamak için düzgün bir şekilde karıştırın. Bağlayıcı olmayan yeni bir 96 kuyu plakasına 50 mikrolitrelik substrat çözeltisi ekleyin.
Plaka içeren insanlaştırılmış RBL hücrelerinin kuyularından 50 mikrolitreyi substrat çözeltisini içeren yeni plakaya aktarın ve florojenik substratın dönüştürülmesine izin vermek için plakayı 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya bırakın. Kuyu başına 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi floresan ölçün. Beta-hexosaminidaz aktivite testinde elde edilen çan şeklindeki eğri, alerjen fazlalığı nedeniyle immünoglobulin E'nin antijen epitoplarının monovalent mesleğini gösterir, bu da alerjen immünoglobulin E çapraz bağlanmasını yüksek antijen konsantrasyonlarında inhibe eder.
Yarım maksimum mediatör salınımı için gerekli antijen konsantrasyonu doğrusal regresyon analizi kullanılarak hesaplandı. Hücre canlılığı tahlili, duyarlılaştırıcı serumdan veya stimülasyon için kullanılan antijenden elde edilen sitotoksik etkileri dışlamak için yapıldı. Beta-hexosaminidaz aktivitesi testi için beş farklı insan serumu kullanıldı ve huş poleni alerjisi hastalarından elde edilen beş seradan dördü Bet v 1 stimülasyonuna yanıt vererek Bet v 1'in immünoglobulin E aracılı alerjik semptomlardan sorumlu güçlü bir alerjen olduğunu gösterdi.
İmmünoglobulin E'nin homolog alerjenlere çapraz reaktivitesi değerlendirildi. Bet v 1'e yanıt her iki hastada da bulundu, ancak ikinci hasta da Cor a 1'e yanıt verdi. Bet v 1 homolog gıda alerjeni, hasta ikide daha yüksek Cor a 1 çapraz reaktif immünoglobulin E seviyelerini gösterir.
Alerjenlerin mutant varyantlarının hipoalerjenik doğası değerlendirildi ve vahşi tip muadillerine göre karşılaştırıldı. Bet v 1 kat varyantının serbest bırakma eğrisi, vahşi tip alerjene kıyasla daha yüksek bir antijen konsantrasyonuna doğru kaymıştır, bu da yarı maksimal salınımı kışkırtmak için önemli ölçüde daha yüksek bir antijen konsantrasyonuna neden oldu, bu da mutantın daha az alerjik olmasını ve bu nedenle alerjen spesifik immünoterapi için bir aday olmasını sağlar. Hücrelerin kurumasını önlemek için antijen seyreltme uygulanana kadar yıkama çözeltilerini hücrelerde bırakmayı unutmayın, aksi takdirde bu tahlilin düşük performansına neden olur.
Test, alerjen spesifik immünoterapi için kullanılan deri iğnesi test çözeltileri veya ekstraktlar gibi biyolojik faaliyetlerine dayanarak alerjenik ürünlerin standardizasyonu da dahil olmak üzere birçok farklı uygulama için kullanılabilir.
