Bu çalışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme İntramural Araştırma Programı (NS002986) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. AS el yazması yazdı ve deconvolution analizi uygulanmıştır. JSD deconvolution analizi ilk versiyonunu geliştirdi ve metin yorumladı.

1. Dilim Hazırlık <ol><li> 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 1.3 MgSO 4 · 7H 2 O, 4 MgCl2, 26.2 NaHCO3, 1 NaH 2 PO 4, ve 22 glukoz, 320: içeren / depolama çözümü (mM) dilimleme 500 ml hazırlayın mOsm, pH 7.4, </li><li> Dilimleri için bir batma odası hazırlamak için 250 ml beher kullanın, / depolama çözümü dilimleme 200 ml ile doldurun, 34 de bir su banyosunda sıcak ° C ve% 95 O 2,% 5 CO 2 ile balonu bu. </li><li> 4 bir cam şişede kalan dilimleme / depolama çözümü ° C tutun </li><li> Vibratome numune tutucu küçük bir agar blok (% 6, ACSF hazırlanan) ekleyin ve 4 ° C&#39;de saklamak için bir siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın </li><li> 30 dakika dilimleme başlamadan önce, buz ve% 95 O 2,% 5 CO 2 ile kabarcık onunla dolu bir kova dilimleme / depolama çözümü içeren cam şişe yerleştirin. </li></ol><strong&gt; Not: hız ve hassasiyet aşağıda açıklanan diseksiyon adımlar için büyük önem taşımaktadır. <ol start="6"><li> Halotan ile fare (P14-21, C57BL / 6) anestezisi / izofluran (izofluran astrositik glutamat alımını 15 geliştirmek için bildirilmiştir), bu başını kesmek ve oksijenli, soğuk dilimleme / depolama çözümü içeren 50 ml beher baş daldırma. </li><li> Kağıt havlu ile sarılır ve -20 ° C&#39;de saklanan bir buz paketi üzerinde beyin diseksiyon </li><li> Frontal gelen kuyruk sonuna kadar, başın sırt tarafında bir orta sagital cilt kesi yapmak ve kafatası ortaya çıkarmak için bir neşter kullanın. </li><li> Oksipital delik cerrahi makas küçük bir çift alt kesme bıçağı yerleştirin ve iki kesim, sola doğru ve sağ tarafta (45 ° açı) yapmak. </li><li> Kaudal ikinci ön ucuna, orta sagital hattı boyunca kafatasının kesin. </li><li> Bir spatula ile beyin çıkarın ve oksijenli, soğuk dilimleme / depolama soluti içinde daldırmaüzerinde. </li><li> Bir neşter ile, beş kesim yapmak: (1) koku ampuller ve frontal korteks kaldırmak, (2) beyincik çıkarın, (3) sol çıkarın ve (4) sağ temporal lob, (5) iki beyin hemisfer ayırmak orta sagital kesim ile. </li><li> Dab kağıt havlu ile beynin iki bölümden herhangi bir aşırı çözüm kaldırmak için. </li><li> Tutkal soğuk vibratome taban plakasına her bir beyin bölümünün yan yüzeyi: beyin dorsal tarafına vibratome bıçak dönük olmalıdır; beynin ventral tarafta ve uzakta bulunan vibratome bıçak, agar blok ile temas halinde olmalıdır. Not: yüksek kalitede dilimler elde etmek için, bu beynin iki parça sıkıca vibratome taban plakasına yapıştırılmış olması önemlidir. Bunu yapmak için, çok sıvı ve çok hızlı kurumasına olmadığını olmayan bir siyanoakrilat yapışkan kullanın. </li><li> Diseksiyon odasına vibratome taban plakası Güvenli, dilim inci set250 mikron ickness ve bıçak çalışma alanı genişliğini ayarlayın. Dilimleme ile devam edin. Not: her şeyin doğru yönlendirilmiş ise, vibratome beynin yan tarafına doğru ventral doğru dorsal gelen ve medial gelen parasagital dilimleri kesme edilmelidir. </li><li> Bıçak korteks ve hipokampus ile geçtikten sonra, orta beyin gelen korteks / hipokampus kesip 34 de su altında odasında her dilim yerleştirmek için bir neşter kullanabilirsiniz ° C </li><li> Dilimleri ilk çift atın. Tipik olarak, 12 dilim (250 um kalınlığında), bir P14-21 fare beyninden elde edilebilir. </li><li> 30 dakika boyunca 34 ° C&#39;de tutun dilimleri ve elektrofizyolojik kayıtları için kullanılmadan önce 30 dakika süre ile oda sıcaklığına soğumaya bırakın. </li></ol> 2. Astrosit Kimlik ve Kayıtlar <ol><li> 120 KCH SO 3 3, 10 EGTA, 20 HEPES, 2 MgATP, 0.2 NaGTP,: içeren bir iç çözelti (mM olarak) hazırlanması5 QX-314Br ve 5 NaCI, 290 mOsm, pH 7.2. </li><li> 119 NaCl, 2,5 KCl, 2.5 CaCl2, 1.3 MgSO 4 · 7H 2, O, 1 MgCl2, 26.2 NaHCO3, 1 NaHPO 4 ve 22 glikoz, 300 mOsm, pH 7.4: ihtiva eden bir hücre dışı kayıt solüsyonu (mM olarak) hazırlanması ,% 95 O2,% 5 CO2 ile doyurulur. </li><li> GluA, Glun, mGluRII, mGluRIII, GABA A, GABA B ve A1 adenosin reseptörlerinin (uM olarak) aktivasyonunu engellemek için, hücre dışı kayıt çözümü için aşağıdaki ilaçlar ekleyin 10 2,3-Diokso-6-nitro-1, ,2,3,4-tetrahidrobenzo [ƒ] -3 kinoksalin-7-sülfonamid disodyum tuzu (NBKX), 10 (RS) - (2-carboxypiperazin-4-il)-propil-1-fosfonik asit (CPP), (2S )-2-Amino-2-[(1S, 2S)-2-carboxycycloprop-1-il] -3 - (Xanth-9-il) propanoik asit disodyum tuzu (LY341495), 100 (R, S)-α- metilserin-O-fosfat (MSOP), 100 Pikrotoksinin 3, 5 - [[(3,4-diklorofenil) metil] amino] propil] dietoksimetil) fosfinik asit (CGP52432), 18-siklopentil-1 ,3-dipropylxanthine (DPCPX). </li><li> - 36 ° C sıcaklık dereceleri 34 arasında olan, kayıt bölümü içinde hücre dışı çözeltinin sıcaklığını ayarlama </li><li> Bir çift kademeli kullanarak borosilikat cam kılcal (R ≈ 2.5 MQ), cam mikro-pipet çektirmenin yama-kelepçe elektrotlar hazırlayın. </li><li> Dilimleri birini alın ve kayıt odasına yerleştirin. Platin tel ve naylon dizeleri ile yapılan bir metal arp ile basılı tutun. </li><li> Görme Dodt aydınlatma veya IR-DIC altında dilimleri kontrol edin. Astrositler kendi küçük hücre gövdesi (Ø = 10 mikron) ve belirgin çekirdeği (Şekil 1) ile tespit edilebilir. </li><li> Sinaptik uyaranlar için, iki kutuplu bir paslanmaz çelik elektrot yerleştirmek, ~ 100 mikron uzakta yama planladığınız astrosit gelen. </li><li> Astrosit yama ve çok nazik vakum uygulayarak tam hücreli yapılandırma kırmak. Not: Astrositler genellikle düşük giriş dayanımı vare (~ MQ 10), hiperpolarize istirahat membran potansiyeli (~ -90 mV), ve hiçbir ateş aktivite. Astrositler gerilim-kelepçe modu (yani tutma akımı 0 pA okumalısınız) en deneyler genelinde istirahat membran potansiyeli tutulur. Her stimülasyon önce, gerilim adım (-3 mV) hiperpolarizan bir 10 ms astrosit dizi ve giriş direnci izlemek için kullanılır. </li><li> Seri direnç değişiklikleri&gt;% 20 veya astrosit en membran potansiyeli depolarize olursa eğer kayıtları atın. Astrosit arasında membran potansiyeli direkt voltaj-kıskaç ikinci akım kelepçe moduna geçiş ile ölçülebilir. Alternatif olarak, voltaj-kıskaç modunda iken, membran potansiyeli 0 Pa sonuçlanır tutma akımı bu tutma potansiyeli değerinin okuyarak izlenebilir. </li><li> Sinaptik uyarılara istihdam ise, alternatif tek ve eşli uyaranlara (dışında örneğin 100 msn), her 10 - 20 sn. </li><li> UV fotoliz experim içinveliler, mikroskop Epifloresans bağlantı noktasına bir uncaging Xe lambası takın ve hücre dışı çözüm için kafesli bileşik ekleyin. 100 mcM görüş tüm alanında MNI-L-glutamat (Ø = 662,5 mikron bir 40X objektif 14 kullanırken). Flaş uncaging zaman ~ 100 pA genlik taşıyıcı akımları elde edilebilir Açık ve bloke ışık yolu, her 10 ile Alternatif uyarılar - 20 sn. </li><li> Taşıyıcı akım genliği azaltmak için, kontrol koşulları ve geniş spektrumlu taşıyıcı glutamat antagonisti, D, L-treo-β-Benzyloxyaspartic asit (10 uM TBOA) bir alt doymuş konsantrasyon varlığında glutamat geçici ve kayıt taşıyıcı akımlarının uyandırmak tamamen bloke eder ve akım taşıyıcı + akım sürekli K izole etmek için (bkz. Bölüm 3) - en azından 30 olan kontrol değerinin% (bölüm 4, 5) veya TBOA yüksek bir konsantrasyon (100 uM 50) varlığında için . </li></ol> 3. PharmacSürekli K +-akım ological izolasyonu <ol><li> Kontrol koşulları ve TBOA yüksek bir, doymuş konsantrasyon (- 100 uM 50) varlığında, astrositik akımları kaydedin. </li><li> TBOA ortalama en az 20 temizleyicileri (50 - 100 mcM). </li><li> Fonksiyonu ile 3.2 elde edilen ortalama izleri Fit: <img alt="Denklem 1" fo:src="/files/ftp_upload/50708/50708eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50708/50708eq1.jpg" /> Not: TBOA-duyarlı bileşen (yani TBOA varlığında (50 kayıtlı olan bir - 100 uM)) + akım sürekli K temsil eder. Onun zaman tabii ki yukarıda açıklanan mono-üstel fonksiyonu ile tahmin edilir. </li><li> Farklı astrositler arasında bu uyum tekrarlayın ve Τ artış ortalama değeri (sürekli K +-akım ortalama yükselme zamanı (bkz. Bölüm 5) yani) elde. </li></ol> 4. Bensynaptically-Aktif Transporter Akımlar Kolaylaştırılmış kısmı (fSTCs) bir solation <ol><li> Kontrolü koşullarda ve TBOA eşleştirilmiş uyaranlar ile elde edilen ortalama en az 20 temizleyicileri, (10 mcM) (Şekil 2a sol). </li><li> Kontrolü koşullarda ve TBOA tek uyarılar, (10 mcM) (Şekil 2a orta) ile elde temizleyicileri ortalama bir aynı sayıda. </li><li> Dört ortalama izleri (kontrol tek darbe, kontrol eşleştirilmiş-bakliyat, TBOA tek darbe, TBOA eşleştirilmiş-bakliyat) en -3 mV gerilim adıma ortalama akım yanıt genliği karşılaştırın. </li><li> Geçerli yanıt genliği dört izleri aynı ise, 4.7 adıma geçin. </li><li> Ortalama akım tepkisi genliği dört iz herhangi farklı ise, tek tek tüm izleri ortalama dahil edilmesi için uygun olduğunu gösterir. </li><li> Ortalama akım genliği dört iz herhangi farklıdır, ancak bütün halindeMünferit izleri ortalama dahil edilmesi uygun, doğrulamak her iz doğrusal test gerilimi adıma geçerli yanıt büyüklüğü ile FSTC ölçekler büyüklüğünde. Bu durumda, test voltajı adıma mevcut yanıtları genlik tüm eşit olacak şekilde birbirlerine göre tüm izlerini ölçeklendirme. Not: Kayıt koşullarında (yani hücre içi CH 3 SO 3 - veya C 6 H 11 O 7 -) Burada anlatılan, eksitatör akson sinaptik uyarılar mevcut bir hızla yükselen geçici içe stokiyometrik ve yavaş oluşan karmaşık dalga şekilleri ile astrositik akımları oluşturur -Yükselen, içe K sürekli + akım K + yeniden dengeleme komşu akson boyunca aksiyon potansiyeli yayılma takip eden hücre dışı alanda yansıtan. Herhangi bir kaçak akım olarak, +-akım bu sürekli K kaldırmak için kritik bir yol açacakglutamat ömür boyu abartma. </li><li> Eşleştirilmiş uyaranlar (Şekil 2a sağda) ile elde edilen ortalama iz gelen tek uyarılar ile elde edilen ortalama iz çıkarın. Bu adım, stokiyometrik ve sürekli K ikinci uyaran tarafından uyarılmış + akım izole sağlar. </li><li> Eşleştirilmiş-bakliyat (örneğin 100 msn) (Şekil 2b) teslim etmek için kullanılan arası nabız aralığı uygun bir zaman aralığı ile tek uyarılar ile elde edilen ortalama iz Shift. </li><li> 4,7 (Şekil 2c) &#39;de elde edilen ikinci teşvik için ortalama karşılık tek uyarımlar ile elde zaman kaydırmalı ortalama tepki çıkarın. Bu adım, ikinci uyaran (FSTC) tarafından uyarılmış taşıyıcı akımın kolaylaştırdı kısmını izole eder. </li><li> Çoğu durumda, bir önceki adımda tamamen sürekli K + akımı kaldırır. Bu durumda ise, fstc bölgesinin izolasyonu işlemi tamamlandığında ve prosedürü olabilirdeconvolution analiz ed ve astrositlerden glutamat açıklık zaman ders elde. Bazı durumlarda ise, küçük bir sürekli K + akımı hala mevcut olup (Şekil 2d) ve daha fazla analiz (bkz. Bölüm 5) gereklidir. Not: 4,7-4,10 açıklanan analiz kontrolü koşullarda ve TBOA (10 mcM) elde edilen ortalama izleri üzerinde yapılması gerektiğini unutmayın. </li></ol> 5. Artık zdustained K çıkarma fSTCs gelen + akım <ol><li> Bölüm 4 &#39;de tarif edilen bir analiz yapıldıktan sonra kalan + akım sürekli K genliği ölçün. </li><li> Kalıntı sürekli K +-akım genliği 5.1 (Şekil 2d, sol ve orta) ile ölçülür. 3.3 &#39;de tarif edilen mono-üstel fonksiyon genlik ölçeklendirme Bunu yapmak için, Denklem 3.3 &#39;de, bir me + akım sürekli K genliğine eşittir dönem ayarlamak5.1 asured ve dönem Τ artış 3.4 tahmin Τ artış ortalama değerine eşittir. </li><li> FSTC ve sürekli K + akım 4.10 (Şekil 2d sağ) elde. Ortaya çıkan mono-üstel fonksiyonu çıkarma Bu adım, fstc bölgesinin izolasyonu tamamlar. </li></ol> 6. Flash aktive Transporter Akımlar izolasyonu (FTCs) <ol><li> Kontrolü koşullarda ve TBOA açık ışık yolu, (10 mcM) ile elde edilen ortalama en az 20 süpürür. </li><li> Işık yolu ile elde temizleyicileri ortalama bir aynı sayıda kontrol koşulları ve TBOA (10 mcM) olarak, kapalı. </li><li> Dört ortalama izleri (kontrol tek darbe, kontrol eşleştirilmiş-bakliyat, TBOA tek darbe, TBOA eşleştirilmiş-bakliyat) en -3 mV gerilim adıma geçerli yanıt genliği karşılaştırın. </li><li> Geçerli yanıt genliği dört izleri aynı ise, 6.7 adıma geçin. </li><li&gt; Ortalama akım tepkisi genliği dört iz herhangi farklı ise, tek tek tüm izleri ortalama dahil edilmesi için uygun olduğunu gösterir. </li><li> Ortalama akım genliği dört iz herhangi farklıdır, ancak tek tek tüm izleri ortalama dahil edilmesi için uygun olan, ışık yolu ile her bir iz içinde büyüklüğü ile doğru orantılı olarak FTC ölçekler büyüklüğü açık olduğunu doğrulamak test gerilimi adıma geçerli yanıt. Bu durumda, test voltajı adıma mevcut yanıtları genlik tüm eşit olacak şekilde birbirlerine göre tüm izlerini ölçeklendirme. Not: Kayıt koşullarında (yani hücre içi CH 3 SO 3 - veya C 6 H 11 O 7 -) Burada anlatılan, flaş uyarı hızla yükselen geçici stokiyometrik içe akım sadece oluşan astrositik akımları oluşturur. </li><li> Işık pat ile elde edilen ortalama iz çıkarmah açık ışık yolu ile elde edilen ortalama iz engellendi. Bu adım uyaran eser kaldırılması ve FTCs izole sağlar. Not: 6.7 &#39;de tarif edilen analiz kontrol şartlarında ve TBOA (10 uM)&#39; de elde edilen ortalama izleri gerçekleştirilmelidir. </li></ol> 7. Dekonvolüsyon analizi <ol><li> Fit kontrol koşulları (Şekil 3a sol) ve gibi bölümlerde 4 açıklandığı TBOA (10 mcM) (Şekil 3a sağda) ve izole kaydedilen akım taşıyıcı (FSTC veya FTC) - çok üstel fonksiyonu ile, 6: <img alt="Denklem 2" fo:src="/files/ftp_upload/50708/50708eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50708/50708eq2.jpg" /></li><li> Bozunur mono-katlanarak işleve göre bir anında yükselen işlevi oluşturmak: <img alt="Denklem 3" fo:src="/files/ftp_upload/50708/50708eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50708/50708eq3.jpg" /> veBu TBOA (10 mcM) (Şekil 3b) kaydedilen taşıyıcı akımın çürüyen aşamasında iyi açıklar. Not: 7.2 (yani H (t)) &#39;de tarif edilen işlevi TBOA (10 uM) mevcudiyetinde astrositlerden glutamat açıklık zaman süreci temsil eder. </li><li> 7.1 (Şekil 3a doğru, sol C) &#39;de elde TBOA (10 uM) kaydedilen taşıyıcı akımın uygun 7.2 (Şekil 3b ve 3c orta)&#39; de elde edilen mono-üstel fonksiyon Deconvolve. Not: deconvolution (örneğin Matlab, Python) gibi birçok analiz yazılım paketleri dahil matematiksel bir işlemdir. IgorPro, biz genellikle bu tür bir analiz gerçekleştirmek için kullandığınız programlama kodu, deconvolution çalışma verimli ayrık hızlı Fourier dönüşümleri kullanılarak, aşağıda açıklandığı gibi hesaplanabilir. İlk olarak, di hesaplamak için FFT işlemini kullanınscrete hızlı Fourier 7.2 &#39;de elde edilen mono-üstel fonksiyonu ve 7.1 elde TBOA kaydedilen taşıyıcı akım uyum dönüşümü. Sonra, iki FFT fonksiyonların oranı ters ayrık hızlı Fourier dönüşümü hesaplamak için IFFT işlemi kullanır. Elde edilen fonksiyonu I (t), aşağıdaki gibi tarif edilebilir: <img alt="Denklem 4" fo:src="/files/ftp_upload/50708/50708eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50708/50708eq4.jpg" /> 7.3 açıklanan adım TBOA (10 mcM) (Şekil 3c sağ) mevcut taşıyıcı filtre kaynaklanan sağlar. 6 (yani FSTC veya FTC) - Filtre bölümlerde 4 izole taşıyıcı mevcut içine astrositik membran de glutamat ömrü dönüştürmek bozulma faktörleri temsil eder. </li><li> (Kontrol koşullarda mevcut taşıyıcı uygun gelen (Şekil 3c sağ, Şekil 3d orta) filtre Şekil 3a Deconvolve </strong&gt; sol, Şekil 3d) bıraktı. Not: Bu adım kontrol koşullarda astrositlerde (Şekil 3d sağ) glutamat açıklık zaman ders kaynaklanan sağlar. Bu deconvolution adım altında yatan varsayım, filtrenin zamansal profil kontrolü koşullarda ve TBOA (10 mcM) içinde değişmeden kalmasıdır. </li><li> Glutamat boşluk genel zaman tabii ki bir kantitatif tahmin elde etmek için, adım 7.4 &#39;de elde edilen dalga ağırlık merkezi (&lt;t&gt;) hesaplar. Bu &lt;t&gt; olarak hesaplanarak yapılır: <img alt="Denklem 5" fo:src="/files/ftp_upload/50708/50708eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50708/50708eq5.jpg" /> burada G (t), dalga biçimi adım 7.1 &#39;de elde edilir. Yukarıdaki denklem tarif terimi, t tamamlayıcı hesaplanan zaman penceresini karşılık gelir. Not: yöntem ilk kurulduğu zaman,&lt;t&gt; 13 serbest bırakıldı zaman pencereler üzerinde hesaplandı. Entegrasyon pencere tamamen geri başlangıca glutamat açıklık ve boşluk dalga bozunur süreleri daha geniş olarak ayarlanır gibi bu yaklaşım sürece kullanılabilir. Bu durum bu değilse, ancak, &lt;T&gt; tahmin Bu yöntem, bazı sınırlamalar karşılaşır. Açıklık dalga formu için tam olarak geri temel çürük etmez, örneğin, daha sonra &lt;T&gt; birleştirme penceresinin genişliği artar. &lt;t&gt; Ve tahmin için yanlışlık herhangi bir potansiyel kaynak önlemek için, şimdi başlangıcından 14 öncesi ve sonrası, mevcut taşıyıcı zirvesinde% 10 tekabül eden bir zaman penceresi üzerine hesaplamak. İkinci yaklaşım, &lt;t&gt; hücreler boyunca ölçüldüğü ile tutarlılık artırır. Boşluk sırasında ders farmakolojik tedavilerin küçük etkileri analiz bu özellikle kullanışlı oluyor. </li></ol>

<ol>
	<li>Ventura, R., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+relationships+between+hippocampal+synapses+and+astrocytes.">Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes.</a> J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).</li><li>Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+perisynaptic+astroglia+during+synaptogenesis+in+the+mature+rat+hippocampus.">Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus.</a> Glia. 55, 13-23 (2007).</li><li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+uptake.">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li><li>Herman, M. A., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+glutamate+concentration+in+hippocampal+slice.">Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice.</a> J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).</li><li>Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+independent+hippocampal+synapses+is+controlled+by+glutamate+uptake.">Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake.</a> Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).</li><li>Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+synapse+independence.">An evaluation of synapse independence.</a> J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).</li><li>Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+glutamate+diffusion+in+the+hippocampus:+ultrastructural+constraints,+uptake,+and+receptor+activation.">Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation.</a> J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).</li><li>Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flux+coupling+in+a+neuronal+glutamate+transporter.">Flux coupling in a neuronal glutamate transporter.</a> Nature. 383, 634-637 (1038).</li><li>Eliasof, S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+glial+cell+glutamate+transporter+is+coupled+to+an+anionic+conductance.">Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).</li><li>Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+fluxes+associated+with+excitatory+amino+acid+transport.">Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport.</a> Neuron. 15, 721-728 (1995).</li><li>Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+and+microscopic+properties+of+a+cloned+glutamate+transporter/chloride+channel.">Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel.</a> J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).</li><li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes.">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li><li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes:+transmitter+uptake+gets+faster+during+development.">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).</li><li>Scimemi, A., Tian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+transporters+regulate+glutamate+clearance,+NMDA+receptor+activation,+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus.">Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).</li><li>Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+enhances+glutamate+uptake+via+glutamate+transporters+in+rat+glial+cells.">Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells.</a> Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).</li><li>Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogenic+uptake+of+glutamate+and+aspartate+into+glial+cells+isolated+from+the+salamander+(Ambystoma)+retina.">Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina.</a> J. Physiol. 436, 169-193 (1991).</li><li>Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+coupled+and+uncoupled+currents+during+glutamate+uptake+by+GLT-1+transporters.">Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters.</a> J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).</li><li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+glutamate+does+not+overwhelm+transporters+on+hippocampal+astrocytes+during+high-frequency+stimulation.">Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation.</a> J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).</li><li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+regulates+glutamate+transporter+dynamics+in+developing+astrocytes.">Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes.</a> Glia. 60, 175-188 (2012).</li><li>Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+synaptic+glutamate+spillover+and+reuptake+by+linker+optimized+glutamate-sensitive+fluorescent+reporters.">Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).</li><li>Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid&#946;1-42+slows+clearance+of+synaptically-released+glutamate+by+mislocalizing+astrocytic+GLT-1.">Amyloid&#946;1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1.</a> J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

Burada astrositlerden elektrofizyolojik elde etmek için deneysel bir yaklaşım tanımlamak, astrositlerde glutamat taşıyıcı akımlar izole etmek için analitik bir protokol ve bir matematiksel yöntem astrositik taşıyıcı akımlardan glutamat açıklık zaman ders elde. Analizin başarısı astrositlerden yüksek kaliteli yama kelepçe kayıtları elde etmek için yeteneği ve taşıyıcı akımları tanımlamak için kullanılan uydurma algoritmaları doğruluğunu dayanır. Deconv...

Astrositler yıldız şeklinde morfolojisi ve nöropil boyunca uzanır ve komşu sinaptik iletişim 1,2 ulaşmak, ince zar çıkıntıları olan beyinde en bol hücre tipleri vardır. Astrositler &#39;hücre zarı yoğun glutamat taşıyıcı moleküllerin 3 ile doludur. Fizyolojik koşullar altında, glutamat taşıyıcıları hızla zarın hücre dışı glutamat tarafında bağlanır ve hücre sitoplazması aktarın. Böyle yaparak, nakil dışı alan 4 glutamat düşük bazal konsantrasyonu korumak. Sinaps eksitatör bitişik ince astrositik süreçlerinde glutamat taşıyıcılarının ideal uzak sinaptik yarık gelen yayılır olarak sinaptik olaylar sırasında serbest glutamat bağlamak için konumlandırılmış. Böyle yaparak, taşıyıcılar da uyarıcı sinyal mekansal yayılmasının azaltılmasında, peri-ve ekstra-sinaptik bölgelere doğru ve komşu sinaps üzerine glutamat yayılma sınırı5-7 beyinde n. Glutamat taşıma stokiyometrik 3 hareketine bağlı olan bir süreçtir Elektrojenik Na + ve 1H bunların elektrokimyasal gradyan boyunca + K + 1 ve 8 arasında karşı taşıma. (Tiyosiyanat)&gt; NO - 3 - (nitrat) ≈ Cıo 4 - (perklorat)&gt; I -&gt; Br -&gt; Cl -&gt; F - değil, glutamat taşıma SCN geçirgen (ancak stokiyometrik olarak birleştirilmiş olmayan) anyonik bir iletkenlik ile ilişkili (metan sülfonat) ve C 6 H 11 O 7 - - (glukonat) 9-11 CH 3 SO 3. Her iki akımları (stokiyometrik ve olmayan stokiyometrik) görsel olarak akut olarak Dodt aydınlatma veya kızılötesi diferansiyel girişim kontrast (IR-DIC) kapsamında belirlenen astrositlerden, gelen tam hücreli yama-kelepçe kayıtları alarak kaydedilebilirE beyin dilimleri 12. Zarından glutamat taşıma ile ilişkili geçerli stoikiometrik bileşeni CH3 SO 3 kullanılarak izole edilebilir - ya da C 6H 11 O - 7 dayalı hücre içi solüsyon ve astrositler 13,14 üzerinde flaş-Uncaging glutamat tarafından uyarılmış olabilir, veya komşu sinaps gelen glutamat serbest etkinleştirerek, ya elektriksel 12 veya hedeflenen optogenetic kontrol. Taşıyıcı akım stokiyometrik bileşeninin zaman ders astrositik membran (yani glutamat boşluk) de glutamat konsantrasyonu profili ömrü ile şekillenir, glutamat taşıyıcıları, astrositlerde pasif membran özelliklerinin kinetik ve sinaptik uyarımlar, sırasında aktive sinaps 13 arasında glutamat serbest eşzamanlılık. Burada tam ayrıntılı olarak açıklar: (1) deneysel yakörnek deneysel hazırlık olarak akut fare hipokampal dilimleri kullanarak astrositlerden tam hücreli yama-kelepçe kayıtları glutamat taşıyıcı akımların stokiyometrik bileşeni izole etmek için oach, (2) analitik bir yaklaşım bu kayıtları 13, gelen glutamat açıklık zaman ders türetmek için 14. Bu yöntemler, kayıt ve merkezi sinir sistemine ait herhangi bir bölgede astrositlerden glutamat taşıyıcı akımları analiz etmek için kullanılabilir.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CGP52432</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1246</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>(R,S)-CPP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>173</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DPCPX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>439</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LY341495 disodium salt</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MSOP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>803</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>NBQX disodium salt</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D,L-TBOA</td>
			<td>Tocis</td>
			<td>1223</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MNI-L-glutamate</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexa 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10438</td>
			<td>Optional</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Matrix electrodes</td>
			<td>Frederick Haer Company</td>
			<td>MX21AES(JD3)</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PG10165-4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dual-stage glass micro-pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Loctite 404 instant adhesive</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>46551</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xe lamp</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>FlashMic</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Igor Pro 6</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents

Beyinde glutamat taşıyıcıları en yüksek yoğunluğu astrositlerde bulunmuştur. 3 Na +, 1 H, CO-kamyonu + ve 1 K karşı taşıma zarından glutamat glutamat taşıyıcılarının çift hareket +. Taşıma işlemi tarafından oluşturulan stoikiometrik mevcut astrositlerden tam hücre patch-clamp kayıtları ile izlenebilir. Kaydedilen akımın zaman ders astrositler maruz kaldığı glutamat konsantrasyonu profil, glutamat taşıyıcı kinetiği ve astrositik membranların pasif elektrotonik özelliklerinin zaman ders şekillenir. Burada astrositlerde glutamat taşıyıcı akımları kaydetmek ve astrositik taşıyıcı akımların dalga şekli tüm diğer faktörlerden glutamat açıklık zaman ders izole etmek için kullanılabilecek deneysel ve analitik yöntemleri açıklar. Burada açıklanan yöntemlerle kullanım süresi o tahmin etmek için de kullanılabilirf flash Uncaged ve sağlık ve hastalık sırasında merkezi sinir sisteminin herhangi bir bölgesinde astrositik membranlar de glutamat synaptically-yayınladı.

Analitik yaklaşımın başarısı kritik merkezi sinir sisteminin herhangi bir bölgesinde astrositlerden taşıyıcı akımların yüksek kaliteli elektrofizyolojik elde bağlıdır Burada anlatılan. Akut fare hipokampal dilimleri, astrositlerde kolayca nedeniyle küçük hücre gövdesi (Ø = 10 mikron) ve belirgin çekirdeği (Şekil 1) Dodt aydınlatma veya IR-DIC altında tespit edilebilir. Hücre içi bir çözüm, (Şekil 1) Alexa 594 (50 mcM) gibi bir fluorofor eklerken kendi ...

Watch this Scientific Journal Video about Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents at JoVE.com

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Biz astrositlerde glutamat taşıyıcı akımların elektrofizyolojik kayıtları astrositik membranların de glutamat ömrünü tahmin etmek için analitik bir yöntem açıklanmaktadır.

Astrositik Transporter Akımlar bir Dekonvolüsyon Analizi ile Glutamat Gümrükleme gün Dersin türetilmesi

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

deriving-time-course-glutamate-clearance-with-deconvolution-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.3K Görüntüleme.  National Institutes of Health. Biz astrositlerde glutamat taşıyıcı akımların elektrofizyolojik kayıtları astrositik membranların de glutamat ömrünü tahmin etmek için analitik bir yöntem açıklanmaktadır.

Video: Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Nörobilim

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer&#039;s Mouse Models

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

Enzim bazlı biyosensörlerin kullanılması Alzheimer Fare Modellerinde Tonik ve Fazik glutamat Ölçmek için

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

GLUT4 protein Deconvolution mikroskobu kullanarak fare birincil hipotalamik nöronlarda ticareti canlı görüntüleri

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing neuronal dysfunction which eventually leads to cognitive decline. Hyperphosphorylated tau aggregates in the neuron are believed to cause most of the pathology associated with AD. These aggregates are assumed to be released into the extracellular compartment and taken up by adjacent healthy neurons where they induce further tau aggregation. This &#34;prion-like&#34; spreading can be interrupted by antibodies capable of binding and &#34;neutralizing&#34; extracellular tau aggregates as shown in preclinical mouse models of AD. One of the proposed mechanisms by which therapeutic antibodies reduce pathology is antibody-mediated uptake and clearance of pathological aggregated forms of tau by microglia. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess tau uptake by microglia. This assay uses the mouse microglial cell line BV-2, allows for high specificity, low variability and medium throughput. Data generated with this assay can contribute to a better characterization of anti-tau antibody effector functions.

Here we describe a cell-based assay to quantitatively assess tau uptake by microglia with the aim of creating an investigational tool to better characterize the mechanisms of action of anti-tau antibodies.

Antikor aracılıklı Tau izni Microglia tarafından eğitim için tahlil hücre tabanlı

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a premise for determining the role of neuron types within a neural circuit, and their significance in information encoding relative to learning. Likewise, the method can be used to test the physiological significance of two or more connected brain regions in awake and anesthetized animals. The current study demonstrates how VTA glutamate neurons modulate the firing rate of putative pyramidal neurons in the CA1 (hippocampus) of anesthetized mice. This protocol employs adeno-associated virus (AAV)-dependent labeling of VTA glutamate neurons for the tracing of VTA presynaptic glutamate terminals in the layers of the hippocampus. Expression of light-controlled opsin (channelrhodopsin; hChR2) and fluorescence protein (eYFP) harbored by the AAV vector permitted anterograde tracing of VTA glutamate terminals, and photostimulation of VTA glutamate neuron cell bodies (in the VTA). High-impedance acute silicon electrodes were positioned in the CA1 to detect multi-unit and single-unit responses to VTA photostimulation in vivo. The results of this study demonstrate the&#160;layer-dependent distribution of presynaptic VTA glutamate terminals in the hippocampus (CA1, CA3, and DG). Also, the photostimulation of VTA glutamate neurons increased the firing and burst rate of putative CA1 pyramidal units in vivo.

The current protocol demonstrates a simple method for tracing of ventral tegmental area (VTA) glutamate projections to the hippocampus. Photostimulation of VTA glutamate neurons was combined with CA1 recording to demonstrate how VTA glutamate terminals modulate CA1 putative pyramidal firing rate in vivo.

Hipokampustaki Ventral Tegmental Alan Glutamat Terminallerinin Kombine In Vivo Anatomik ve Fonksiyonel İzlenmesi

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...