NIH P40 OD010952, Korein Vakfı, SLC Miami Arkadaş Grubu bir üniversite ve ATK bir Maytag burs tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar minnetle Aplysia yanı sıra Lauren Simonitis ve bir rakam için mikroskop sağlanan Hannah Peck, için Ulusal Kaynak personeli kabul.

1. Hücre Hazırlanması <ol><li> Gün 1, tartmak ve hayvan uyutmak. <ol><li> Bir 30 g kg-1 hayvan tartılır. Izotonik MgCl: 1:1 Uygulama deniz suyu 5-10 hayvan hacimlerde anestezisi. Bu ekli airstone ile elektrikli akvaryum hava pompası gibi havalandırma ile 1 saat 6H 2 0. </li></ol></li><li> Diseksiyon malzemeleri hazırlayın. <ol><li> Bu kumaş işaretçilerine olarak paslanmaz çelik düz iğne, temiz diseksiyon tepsi birleştirin. + Penisilin / streptomisin (P / S).; Birkaç Petri yapay deniz suyu içeren yemekler (Tablo 1 ve 3&#39;e bakınız ASW) monte </li><li> Hazır bir düşük güç mikroskop var. Temiz diseksiyon aletleri gibi nervürlü burun ve ince cerrahi forseps gibi, hazır, ve ince ve büyük cerrahi makas var. Kullanmadan önce% 70 isopropol alkol ile araçlar Sprey ve kurumasını bekleyin. </li></ol></li><li> Diseksiyon tepsi konumu hayvan. <ol><li> Diseksiyon tepsiye pozisyonu hayvan ventral tarafı. Pin hayvangövde duvarı ve parapodial sınırları, ancak dorsal yüzeyini ortaya çıkaracak şekilde, yükleme ve baş önlemek ve genital oluğun kenarları boyunca </li><li> Yavaş dönen soğuk musluk suyunda dorsal yüzeyi durulayın. Genital kanal boyunca bir sıkmak şişe ve başın üstünden 70% isopropol alkol hafif akışı uygulayın. </li></ol></li><li> Ilk kesi yapmak. <ol><li> Sığ bir kırpma sırasında düşük güç mikroskop kullanarak (bkz. Tablo 2) ve genital oluk ön kabuk marjı kaynaklanan noktaya gözlemlemek için yansıyan ışık, gerili, yivli-burun forseps Bu kökenli solunda doku kat ile tutun sadece iyi açılı makas ile genital oluk sağındaki vücut duvarının düzgün, düzlük tüm yol boyunca delik. </li><li> Hemolimf bazen ile karın ganglion ve mide taşıyan, delikten dökmek için dikkat edilmelidir. </li></ol></li><li> Kesi genişletin. <ol><li> Inci genişletmek için büyük makas kullanınöne rhinophores arasında bir noktaya e kesi, alt bıçak ile yukarı çekerken bağırsak nicklemek önlemek için. Iç organların kesi dışarı dökmek için gözlenecektir. </li></ol></li><li> Ganglionlar çıkarın. <ol><li> Tepsiyi yeniden konumlandırmak ve baş bölgeye mikroskop yönlendirmesi. </li><li> Temiz forseps ve ince makas kullanarak, bir noktada bir grup olarak plevra-pedalı ve serebral ganglionlar kaldırmak için yemek borusu etrafında bir halka içine baş ganglionlar oluşturan sinirler kesilmesinin tarafından baş ganglionlar çıkarın. </li><li> Yemek borusu ventral tarafına yapışır yanak ganglion çıkarın. </li><li> Bu ganglion gelen 4 büyük sinir bağlaçlar bu konuda keserek karın ganglion çıkarın. </li></ol></li><li> Ilgi ganglion izole edin. <ol><li> Ganglion en az çapına eşit olan her bir ilgi gangliyon bağlanmış bağlayıcılar arasında bir uzunluğa bırakarak, ayrı baş ganglion Trim; bu enzim geciktirir aşırı sindirimBir sonraki adım, ilgi hücre. </li><li> ASW 2 durulama + temiz forseps ile durulama arasında hareket P / S, ile her hedef ganglion koyun. </li><li> PVC hücreleri hedef, doğru pedal hemiganglion bağlı sağ plevral hemiganglion bırakın ve benzer şekilde sol pedal hemiganglion bağlı sol plevral hemiganglion bırakın. </li><li> Istenmeyen ganglionlar ve kabul edilen araştırma uygulama göre hayvanın geri kalanını atın. </li></ol></li><li> Enzimatik ganglionlar sindirmek. <ol><li> Her gangliyon için, 3.75 mg dispaz, 1 mg hiyaluronidaz ve DSH ml&#39;si başına 0.3 gr kollajenaz tip XI oluşan enzim çözeltisi, 1 ml hazırlanması 15 ml polipropilen konik tüpe +, P / S. </li><li> Yeri enzim çözüm ganglionlar durulanır ve kapağını sıkıca takın. Yaklaşık 23 saat boyunca 13-5 gece boyunca yavaş bir hızda döner çalkalayıcı üzerinde (bakınız Tablo 2) üzerinde yan tüp yerleştirin ° C (oda sıcaklığı). </li></ol></li><li> Hazırlayınkültür kaplarına. <ol><li> Mikrodiseksiyon önce (Gün 2), poli-D-lisin (PDL) kaplı bir doku kültürü kaputu kültür yemekleri hazırlamak. ~ 25 dakika süre ile, 35 mm tabağın merkezine ~ 0.5 ml PDL (0.2 mg / ml &#39;lik steril su) ilave edilir. </li><li> Steril su ile 3x PDL durulayın. Kurumasını bekleyin. Kalıpları UV-sterilize. </li></ol></li><li> 2. Gün nöronlar izole edin. <ol><li> PDL kaplı ve başka kuru bir tabak içinde medya bir ada oluşturmak için ASW + P / S yaklaşık 0.5 ml steril UV vardı 35 mm yemekleri ortasına doldurun. Bu doku kültürü kaputu dışında, bankta yapılabilir. Bir çanak hemiganglion kaynaklanan her hücre küme için hazırlanmalıdır. </li><li> Sylgard kaplama tarafından yapılan ve (bkz. Tablo 3) işaretçilerine ve sondalar olarak kullanılmak üzere çeşitli boyutlarda ince diseksiyon işaretçilerine ile donatılmış bir 5 mm derin diseksiyon yüzey, kür hazır bir 100 mm çapında diseksiyon çanak var. ASW ile + P / S, ve son olarak fi sonra,% 70 isopropol alkol ile bu çanak durulayınbu ASW + P / S ile ll </li></ol></li><li> Sindirilmiş gangliyon mikrodiseksiyon hazırlayın. <ol><li> Diseksiyon çanak içine sindirmek plevra-pedalı ve yanak ganglion içeren enzim çözeltisi dökün. </li><li> Yansıyan ışık altında siyah bir yüzeye karşı mikroskop sahnede çanak yerleştirin. </li><li> Ekli bağ dokusu kullanarak, her plevra-pedal hemiganglion sırt tarafında yukarı aşağı pin. Yumuşak doku ve germe hoşgörüsüz olacaktır. </li></ol></li><li> PVC nöronlar Microdissect. <ol><li> Temiz ince forseps 2 çift kullanarak ve bir prob olarak forseps bir çift bir ince diseksiyon iğne tutan, bir plevral hemiganglion gelen PVC hücreleri izole. Enzim sindirim kaldırıldı veya PVC küme kapsayan bağ dokusu kılıf dağıldığına, henüz hücreleri birbirine yapışır olacak. </li><li> Pedal-plevral bağ 18 bu hücreleri ayırmak için prob kullanın, sonra diseksiyon altına hücre küme düşmesine izinçanak. </li></ol></li><li> Kültür çanak nöronlar aktarın. <ol><li> Yavaşça hava kabarcıkları tanıtan önlemek için dikkatli olmak, sonra bir kültür çanak medya ada haline yavaş yavaş dağıtım, biraz yangın cilalı tek cam Pasteur pipet ucu içine küme emerek hazırlanmış bir 35 mm kültür çanak hücre küme aktarın pipet içine. Ayrı bir kültür çanak içine diğer hemiganglion ve yerin PVC küme izolasyonu tekrarlayın. </li></ol></li><li> BSC nöronlar Microdissect ve transfer. <ol><li> Ilgi hücreleri yedek dikkatle, kadar yanak ganglion ventral yan Pin. Yanak ganglion 10 2 BSC hücre kümeleri ile adım 1.12 tekrarlayın. </li><li> PVC kümeleri içeren BSC kümeleri ve 2 yemekleri içeren 2 yemekler: PVC ve BSC nöronların izolasyonu nöron kümeleri içeren 4 kültür kaplarına üretecek. Ganglion geri kalanı atın ve 100 mm diseksiyon çanak kenara koyun. </li></ol></li><li> Dissochücre kümeleri iate. <ol><li> Düşük güç mikroskop sahnede hücreleri içeren bir kültür çanak yerleştirin ve kapağı çıkarın. </li><li> Hafifçe forseps düzenlenen bir ince diseksiyon iğne ile hücre küme bitişik kültür çanak alt getirerek PVC küme ayırmak. Flicking rağmen plastik bir nokta kazmak için çalışıyor gibi çanak alt plastik içine iğne ucu kazma olduğunu. Plastik sürtünme pin nokta serbest bıraktığında, bir perküsyon dalga ayrı hücrelerin yakındaki yığın tatili vasıtasıyla üretilmektedir. </li><li> 5-10 sinema neredeyse tamamen hücreleri ayırmak için gerekli, ancak hücreleri mekanik sırf tarafından yok edilmesi diye çok fazla fiske yerine hücre küçük kümeler bırakmak daha iyidir olabilir. </li><li> Kapak ve diğer kültür yemekleri ile tekrar değiştirin. </li></ol></li><li> Hücre kültürleri saklayın. <ol><li> Ayrışmış hücreleri ile merkezlerinde medya adaları içeren kültür kaplarına yerleştirinBöyle bir 150 x 25 mm yuvarlak plastik Petri kabı gibi hava sirkülasyonu, izin verir, ve 17 ° C bir kuluçka set Bu yemeğin yer geniş bir kap </li><li> Odasında nem kaynağı olarak su açık bir tabak yükleyin. Gece rahatsız bırakın. Hücreler çanak merkezinde poli-D-lizin kaplama uyacaktır. </li></ol></li><li> Sel kültür kaplarına. <ol><li> Gün 3, yavaşça ASW 2.5 ml yemekleri sel + P / S Incelemek ve ters bir hücre kültürü mikroskop kullanarak hücreleri saymak. 17 ° C inkübatör saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Elektrofizyoloji Yöntemi (örnein, Sakmann ve Neher, 1995), pek çok metinde 16 tarif edilmiştir sıkıştırma standardı yamadır. Bu protokol hücreleri üzerinde ≤ 100 pF kapasitans, ya da hücreler &lt;Protokolün gün 3 ve 4 sırasında 60 mikron çapında çalışacaktır. Süreçleri olmadan Hücreler kayıt için uygun olan. Aşağıdaki özel de İngiltere&#39;deiyonları geçerlidir: <ol><li> Büyük hücreleri β = 0.1 olarak ayarlanmış Axopatch 200B amplifikatör yapılandırma ayarı ile yerleştirilebilir. Çok büyük akımlar aktivasyonu hücre gerilim kelepçe kaçmaya neden olabilir. ASW çözümleri (geçirimsiz bir N-metil-D-glukamin klorid ile ikame edilmiş NaCl örneğin bir kısmı) tuz içeriğinden ikame edilen bütün bir hücre akım genliği azaltmak için kullanılabilir. </li><li> Bir pipet çekici üzerine çekilir ve KCl ve diğer tuzlar 450 mm (bkz. Tablo 1) oluşan hücre içi çözelti (ICS) ile yarım toprakla fiber dolgulu borosilikat yama pipetler uygundur ve yaklaşık 0.5-1 Mohms bir dirence sahip olmalıdır. Belirli iyonik akımların izolasyonu isteniyorsa, örneğin, Na + K akımları, K +, bu çözüm yokluğunda akımları gibi Cs + gibi diğer iyonlar ile değiştirilebilir. Cl - daha doğal bir ICS isteniyorsa geçirgen olmayan anyon ile ICS değiştirilmesi de garanti edilir9. </li><li> Hücreler oda sıcaklığında mümkün&gt; 1 saat süren kayıtları ile sağlamdır. Kayıt kültüründe 24-48 saat için gelen, gün 3 ve protokolün 4 en uygunudur. 48 saat sonra, güçlük, hücre yüzeyi üzerinde bir glikokaliksin hazırlanması belki de, gigaohm conta oluşturan, ve proses sonucudur neden olduğu alan kıskaç sorunlar vardır. Hücreler &lt;14 d içinde tamamlanabilir gibi toksikoloji olmayan yama kelepçe çalışmalar, için, yararlı, ancak vardır. </li><li> ASW ve diğer çözümler ağırlık beslenen çözüm cihaz vasıtasıyla dağıtılabilmesidir için, hem de hücre içi çözelti süzülür gereken bir gigaohm conta oluşumuna müdahale ince parçacıkların ortadan kaldırmak için 0.2 mikron Acrodisk filtre (Tablo 3), bir şırınga monte edilebilir. </li><li> Örneğin, D-aspartat (D-Asp) agonist kullanıldığında Duyarsızlaştırma oluşur, bu nedenle agonist, uygulamalar arasında, 1-2 dakika ~ tavsiye edilir. Tersine, Potentiation genellikle hızlı tekrar başvurunun ile görülmektedirL-glutamat (L-Glu), agonist katyon. </li><li> L-Glu gibi agonist aktif akımları Picospritzer pipet ile agonistleri uygulayarak incelenebilir. Bu pipet yama pipet ile aynı çekilir ve ASW agonisti içerir. Bu pipet ucu yerçekimi beslenen çözüm cihaz çıkışı boru altında konumlandırılmış ve çıkış boru (Şekil 2F) bir 45 ° açıyla, agonist hızla hücreden kalmamis olur ve duyarsızlaştırma en aza inecektir zaman. Agonist pipet 90 ° &#39;lik ya da daha fazla yama pipet&#39; lik bir açı oluşturması gerekir. </li></ol>

<ol>
	<li>Buttner, N., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+modulation+of+a+hyperpolarization-activated+Cl(-)+current+in+Aplysia+sensory+neurons+by+SCP(B)+and+FMRFamide.">Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide.</a> J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).</li><li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia.">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).</li><li>Carlson, S. L., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica.">Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).</li><li>Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica.">Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).</li><li>Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Na++and+Ca2++currents+in+bag+cells+of+sexually+immature+Aplysia+californica.">Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).</li><li>Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+D-Aspartate+ion+currents+in+the+Aplysia+nervous+system+with+aging.">Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging.</a> Br. Res. 1343, 28-36 (2010).</li><li>Glansman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+in+Aplysia:+The+Cheshire+Cat+of+neurobiology.">Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).</li><li>Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cellular+Mechanism+of+Classical+Conditioning+in+Aplysia:+Activity-Dependent+Amplification+of+Presynaptic+Facilitation.">A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation.</a> Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).</li><li>Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acetylcholine+on+ventrocaudal+sensory+neurons+in+the+pleural+ganglia+of+Aplysia.">Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia.</a> Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).</li><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cellular basis of behavior. , (1976).</li><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialog+between+nerves+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+correlates+of+habituation+and+habituation+of+the+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia.">Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).</li><li>Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+an+Aplysia+bag-cell+neuron+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+A+and+a+protein+phosphatase.">Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase.</a> J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).</li><li>R, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+transcriptome+of+Aplysia:+neuronal+compartments+and+circuitry.">Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry.</a> Cell. 127, 1453-1467 (2006).</li><li>Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+underlying+developmental+regulation+of+repetitive+firing+in+Aplysia+bag+cell+neurons.">Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-channel recording. , (1995).</li><li>Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+Ca2++current+contributes+to+a+prolonged+depolarization+in+Aplysia+bag+cell+neurons.">Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).</li><li>Schacher, S., Proshansky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+regeneration+by+Aplysia+neurons+in+dissociated+cell+culture:+modulation+by+Aplysia+hemolymph+and+the+presence+of+the+initial+axonal+segment.">Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment.</a> J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).</li><li>Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoafferent+neurons+innervating+tail+of+Aplysia.+I.+Response+properties+and+synaptic+connections.">Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections.</a> J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).</li><li>Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+Ca(2+)-sensitive+nonspecific+cation+channel+underlying+prolonged+repetitive+firing+in+Aplysia+neurons.">Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons.</a> J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).</li><li>White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+regulates+a+vesicular+class+of+calcium+channels+in+the+bag+cell+neurons+of+Aplysia.">Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).</li><li>Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+a+calcium-sensitive+nonspecific+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+and+phosphatase+activities.">Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).</li><li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures.">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Ayrışma teknikleri glia ve diğer tanımlanamayan hücrelerin az sayıda serpiştirilmiş 50-100 izole nöron içeren duyusal nöron kültürleri verim burada açıklanan. Protokolde en kritik adımlar ganglionlar enzim çözeltisi kalır zaman vardır, ve, tek tek hücrelere küme bozmaya sindirilmiş hücre kümeleri ayrışma Flicking. Enzim sindirimi (adım 1.8) mevcut sıcaklığında optimize edilmesi gerekmektedir. 23 yavaş sallayarak ° C, 13 saat BSC kümeleri while15 saat PVC kümeleri için optimum sonucu ...

Deniz opistobranch yumuşakça, Aplysia, onlarca yıl için yararlı bir nörobiyolojik model olmuştur. Bu iyi alışkanlık ve klasik koşullanma 7, 8 modeli olarak bilinir. Bu modelde öğrenme ve hafıza ile ilgili çalışmalar o Arvid Carlsson ve Paul Greengard 10 ile paylaşılan bir ödül, Eric R. Kandel için 2000 yılında Fizyoloji veya Tıp Nobel Ödülü kazandı. Düşük hazırlıkları elektrik kayıtları içeren çalışmalar, hangi bu omurgasız ve sinir sisteminin unsurları sinirleri ile hayvan disseke ve kasların tutunduğu, Aplysia bireysel nöronların rollerini aydınlatmak yardımcı olmuştur bıraktı. Aplysia öğrenme teşkil hassas moleküler mekanizmaların belirlenmesi Ancak, çoğu zaman bireysel donör hayvanlardan tek tek elde edilen başka bir teknik, uzun vadeli bir duyusal nöron eş-kültür ve bir motonöron, istihdam ve kültür çanak 21 bir sinaps oluşturmak için izin . Biz ve diğerleri 1, 3, 6, 14, 15, 16 nöronlar sözde homojen nöron kümeleri ayrışmış kısa vadeli kültürleri yapmak için uzun vadeli deneylerde de kendi dayanıklılık gibi bu modelde hedeflenebilir tespit hangi ile kolaylığı istismar var hangi biz yama kelepçe yapılandırmasında gerilim kelepçe altında iyonik akımların çalışma. Birçok Aplysia nöronlar uzun süreli deneysel manipülasyonlar için zaman tanımak için sıkma yama tekrar mermi stand up. Bu teknik, örneğin, karın ganglion Nörosekretor torba hücreleri ve ayrışma burada açıklandığı plevral ve yanak ganglion sensor nöronları olarak nöronlar için yararlıdır, fakat çok büyük nöronlar&gt; 60 mikron gibi L7 gibi çapı ya da R2 karın ganglion. Biz başka bir yerde tanımlanan duyusal-motor nöron ko-kültür aksine, bizim kültürlerde Aplysia serum istihdam yok. Bu işlem kullanılarak elde edilen en nöronlar t işlemleri olmadan olacako tüm hücre voltajı kayıt kolaylaştırmak kültüründe ilk 48 saat,, ama sonra filiz ve besin ve / veya büyüme faktörlerinin eksikliği nedeniyle ölme önce yaklaşık 14 gün boyunca akson ve diğer işlemler ayrıntılı olacaktır. Bu teknik, bukkal ve plevral gangliyon fizyolojik olarak belgelenmiş bölgelerinden tabak başına 50-100 nöronlarının birincil kültürleri üretir. Bu protokol, araştırmacılar, çeşitli deneysel hayvan başına çoğaltır gerektiren deneylerde tek hücre fizyolojisinin açıdan araştırılması için de faydalıdıdr. Bu eşleştirilmiş tedavi ve kontrol kültürlerinden çalışmalar yarar izin, sol ve sağ hemiganglia içine hedef hücrelerin anatomik ayrılması nedeniyle kültürlerin bir eş üretir. Protokol yanak ganglion yanak S kümesi (BSC) nöronlar ve plevral ganglion plevral ventrocaudal (PVC) nöronlar hedefliyor. Bu hücreler, tüm hücre voltaj kayıtları ve görüntüleme Robus için uygun bir boyuttadırt glutamaterjik yanıtları. Açıklanan metodoloji Aplysia&#39;nın sinir sisteminde en gangliyonların birleşmeleri için uygundur.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Artificial seawater ASW</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>assorted</td>
 <td>(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intracellular solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>assorted</td>
 <td>(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6407</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100</td>
 <td>Lonzo Walkersville, Inc.</td>
 <td>17-603E</td>
 <td>5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral dispase II</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>10165859001</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>hyaluronidase</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4272</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>collagenase type XI</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C9407</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamate (L-Glu)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49601-100G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-Aspartate (D-Asp)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>11200-10G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
 <td>Biomol</td>
 <td>100002-268</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Asp</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6683-25G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6816-5MG</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glu R antagonists</td>
 <td>various</td>
 <td>various</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>agar</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>kynurenate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>61250</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>APV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-propanol</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>BDH1133</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloriding solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>assorted</td>
 <td>25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard silicone 2-part polymer</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>SYL184</td>
 <td>Provides pin-out surface for small dissection dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0-40x zoom magnification microscope for dissections</td>
 <td>Wild</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator</td>
 <td>Microoptics of Florida</td>
 <td>TQ FOI-150</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RotoMix 50800 orbital mixer</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) &amp; 40x objectives</td>
 <td>SR Research Ltd.</td>
 <td>Eyelink II</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tektronix digital oscilloscope</td>
 <td>SR Research Ltd.</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pClamp 10 data acquisition and analysis software</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PC with Windows XP or higher operating system</td>
 <td>PC Solutions</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown P87 micropipette puller</td>
 <td>Sutter Instruments, Novato, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>CV203BU</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1200 A/D converter</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration</td>
 <td>Parker Hannifin, Cleveland, OH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TMC Micro-G Vibration isolation table</td>
 <td>Ametek</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Faraday cage</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>custom manufacture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators</td>
 <td>Burleigh Instruments; Thorlabs</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>presently PCS-5000; -6000 series + mounts</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer)</td>
 <td>Narishige USA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID -</td>
 <td>WPI</td>
 <td>1B150-3</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3 inch length</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl half cell</td>
 <td>WPI</td>
 <td>EP4</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>21008-918</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Angled Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15006-09</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumostar Fine forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-00</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm falcon tissue culture dishes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>25382-064</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>1013</td>
 <td>also can be made into small dissection dishes with sylgard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>sylgard</td>
 <td>WPI</td>
 <td>SYL184</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>animal dissection tray</td>
 <td>various</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>21008-918</td>
 <td>For 6-bore gravity-fed perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum clips with screw hole ends</td>
 <td>hardware store</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>23 gauge needles (manually file off points)</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array</td>
 <td>Narishige USA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>one-way valves</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps 1 &mu;l</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 gauge needles for suction (filed off points)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polyethylene tubing</td>
 <td>Cole Parmer</td>
 <td>4.27436E+11</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>fine dissection pins</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>26002-20</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>capillary tubes</td>
 <td>Kimble 71900-100</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>modeling clay</td>
 <td>craft store</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dish holder for microscope stage with isolated ground bath</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Custom manufacture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pasteur pipettes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>14672-412</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pipette bulbs</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>53283-911</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>acrodisk syringe filters</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>28144-040</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass</td>
 <td>WPI</td>
 <td>1B150F-3</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.

isolation of sensory neurons of aplysia californica for patch clamp recordings of glutamatergic currents

Deniz gastropod yumuşakça Aplysia californica öğrenme ve hafıza çalışmaları özellikle öneme sahip, sinir sistemi fonksiyonu bir model olarak bir saygıdeğer bir geçmişi vardır. Bu tür çalışmalar için tipik hazırlıkları duyusal ve motor nöronlar minimal disseke hayvan değişmeden kalır, ya da bireysel duyusal ve motor nöronlar bir teknik olarak nöronal ko-kültür edildiği olanlardır. Daha az görülen sözde homojen nöronların küçük kümeler kısa vadeli kültüründe tek hücrelere ayrışmış olduğu izole nöronal hazırlıktır. Bu tür izole edilmiş hücreler yama kıskaç teknikleri ve bu iletkenlikleri hedef modülasyonu kullanılarak iyon akımlarının biyofiziksel karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tür kültürlerde hazırlanması için bir protokol açıklanmıştır. Protokol plevra ve yanak ganglion kolayca tanımlanabilir glutamaterjik duyu nöronlarının yararlanır ve bunların ayrışma ve minimum bakım açıklar iserumsuz birkaç gün boyunca N kültürü.

Bu protokolde hedeflenen gangliyon içindeki duyu nöronlarının yerle BSC ile PVC nöronlar Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. BSC nöronlar bukkal gangliyonu, sağlam ganglion (Şekil 1A) &#39;de bukkal kütle uzağa dönük yüzeyinin ventral tarafta simetrik 2 oval kümeler halinde bulunmaktadır. PVC nöronlar merkez ekseni (Şekil 1B) doğru plevral ganglion dorsal yüzeyi etrafında saran ikili, V şeklinde kümeler oluştururlar. Sağ veya sol küme olaylar yak...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents at JoVE.com

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Biz deniz deniz tavşan sinir sisteminin diseksiyonu tarif<em&gt; Aplysia</em&gt; Anestezi sonrası, kısa süreli doku kültürü için nöronlar, ve yama kelepçe tekniği ile tek bir hücre iyon akımlarının kayıtların izolasyon.

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

isolation-sensory-neurons-aplysia-californica-for-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

12.2K Görüntüleme.  University of Miami. Biz deniz deniz tavşan sinir sisteminin diseksiyonu tarif Aplysia Anestezi sonrası, kısa süreli doku kültürü için nöronlar, ve yama kelepçe tekniği ile tek bir hücre iyon akımlarının kayıtların izolasyon.

Video: Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal. Simultaneously recording from multiple nerves and muscles gives us precise information about the timing of neural activity. Previous recording methods have worked for two electrodes, but the study of additional nerves or muscles required combining and averaging the recordings of multiple animals, which made it difficult to determine fine details of timing and phasing, because of variability from response to response, and from animal to animal. Implanting four individual electrodes has a very low success rate due to the formation of adhesions that prevent animals from performing normal feeding movements. We developed a new method of electrode fabrication that reduces the bulk of the electrodes inside the animal allowing for normal feeding movements. Using a combination of glues to attach the electrodes results in a more reliable insulation of the electrode which lasts longer, making it possible to record for periods as long as a week. The fabrication technique that we describe could be extended to incorporate several additional electrodes, and would be applicable to vertebrate animals.

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A technique is described for implanting four in vivo electrodes to monitor the neuromuscular control of feeding behavior in Aplysia californica.

Elektrot İmalat ve İmplantasyon Aplysia californica Bozulmamış, Serbestçe Behaving Hayvanlar Çok kanallı Sinir ve Kas Kayıtlar

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

Nörobilim

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Canlı görüntüleme Sf9 Hücreler ve PKC Translokasyon Aplysia Duyu Nöronlar

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.