1. Hazırlık adımları
<ol><li>1 L damıtılmış suya 25 g MH suyu ekleyerek Muller-Hinton suyu (MHB) hazırlayın ve karıştırın. 2,5 saat boyunca 121 °C'de otoklav. Ardından, otomatik kapatılmış ortamı oda sıcaklığında veya buzdolabında saklayın.</li>
	<li>Söz konusu bakterileri(E. coli ESBL) dört çeyrek çizgi yöntemini kullanarak agar medyasında alt kültüre koyun ve 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.<ol>
<li>Steril bir döngü kullanarak, bir koloni alın ve yakın paralel çizgiler yaparak MacConkey agar plakasının ilk yarısına yayın.</li>
		<li>Döngüyü kullanarak, bakterileri ilk çeyrekten itibaren çizgileyerek ikinci çeyrekte yayın.</li>
		<li>İkinci çeyrekten itibaren, yakın paralel çizgiler kullanarak üçüncü çeyrekteki çizgileri genişletin.</li>
		<li>Bakterileri dördüncü çeyreğin ortasına üçüncü çeyrekten itibaren çizerek yayarlar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Panel hazırlığı
<ol><li>Bir kare oluşturmak için yan yana dört 96 kuyu plakası yerleştirin. Bir bant kullanarak, altlarını birbirine bantlayın.</li>
	<li>Her biri 4 plaka içeren dört panel elde etmek ve bunları A1, A2, A3 ve A4 olarak adlandırmak için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Dört panelin 16 adet 96 kuyu plakasındaki sütun 2 ile sütun 11 arasındaki kuyulara 50 μL MH suyu ekleyin.</li>
	<li>Dört panelin 16 adet 96 kuyu plakasında negatif kontrol kuyusu olarak hizmet veren kuyu H12'ye 200 μL MH suyu ekleyin.</li>
	<li>Dört panelin 16 adet 96 kuyu plakasında pozitif kontrol kuyusu görevi gören A1 ve H1 kuyularına 150 μL MH suyu ekleyin.</li>
</ol>3. İlaç 1, Cefotaxime, seri seyreltme
<ol><li>Konik bir tüpe 15 mL steril dH2O ekleyin.<ol>
<li>C 1 V 1 = C 2 V2formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V1 = (C2 x 15 mL) / C1. NOT: Bizim durumumuzda, Cefotaxime stok çözeltisi 105 μg / mL ve C2 2 256 μg / mL'dir; böylece V1 = 38,4 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hesaplanan hacmi 15 mL steril dH2O'dan çıkarın ve ardından ilacı ekleyin.</li>
	<li>H12 hariç sütun 11 ve sütun 12'deki her kuyuya hazırlanan ilaç çözeltisinin pipet 50 μL'si.</li>
	<li>Sütun 11'den 50 μL çıkararak ve sütun 10'daki ilgili kuyulara koyarak seri seyreltmeye başlayın ve ardından sütun 2'den alınan 50 μL'nin atılacağı sütun 2'ye ulaşana kadar.</li>
	<li>Dört panelin tüm 16 96 kuyu plakası için 3.4 ve 3.5 adımlarını yineleyin.</li>
</ol>4. İlaç 2, Amkacin, seri seyreltme
<ol><li>Konik bir tüpe 10 mL steril dH2O ekleyin.</li>
	<li>C 1 V 1 = C 2 V2formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V1 = (C2 x 10 mL) / C1. NOT: Bizim durumumuzda, Amikacin stok çözeltisi 103 μg / mL ve C2 64 μg / mL'dir; böylece V1 = 64 μL.</li>
	<li>Hesaplanan hacmi 10 mL steril dH2O'dan çıkarın ve ardından ilacı ekleyin.</li>
	<li>Sekiz ayrı 96 kuyu plakası alın.</li>
	<li>Her tabağa, G ve B sıraları arasındaki kuyulara 100 μL MHB ekleyin.</li>
	<li>Daha önce hazırlanmış ilaç 2 çözeltisinin 100 μL'lik kısmını G sırasının kuyularına ekleyin.</li>
	<li>Her kuyudan 100 μL alarak G satırından B satırına seri olarak seyreltin ve son olarak 100 μL'yi B satırının kuyularından atın.</li>
	<li>Sekiz plaka hazırlamak için 4.5, 4.6 ve 4.7 adımlarını yineleyin.</li>
</ol>5. İlaç 2'nin dört panele aktarılması
<ol><li>Pipet 50 μL ilaç 2, G ve B sıraları arasındaki kuyulardan dört paneldeki her plakadaki ilgili kuyulara. Hazırlanan bir 96 kuyu plakası, bir panelde iki plaka için yeterli olan 100 μL ilaç 2 içerir.</li>
</ol>6. İlaç 3, Levofloksasin, ilave
<ol><li>Dört farklı konik tüpe 14 mL steril dH2O ekleyin.</li>
	<li>C 1 V 1 = C 2 V2formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V1 = (C2 x 14 mL) / C1. NOT: Bizim durumumuzda, Levofloksasin 5 x 103 μg / mL'lik bir stok çözeltisinden dört farklı konsantrasyonda hazırlanır. C1 = 2 μg/mL, V1 = 5,6 μL C2 = 4 μg/mL, V1 = 11,2 μL C3 = 8 μg/mL, V1 = 22,4 μL C4 = 16 μg/mL, V1 = 44,8 μL</li>
	<li>Hesaplanan hacmi her tüpten 14 mL steril dH2O'dan çıkarın ve ardından ilacı ekleyin.</li>
	<li>Üçüncü ilacın gerekli konsantrasyonlarını hazırladıktan sonra, 50 μL alın ve B ve G satırları ile C1'in dört paneldeki dört P1 plakasına karşılık geldiği her panelde ilgili plakadaki 2 ve 12 sütunları arasındaki ilgili kuyulara ekleyin, C2 dört paneldeki dört P2 plakasına karşılık gelir. , C3 dört paneldeki dört P3 plakasına, C4 ise dört paneldeki dört P4 plakasına karşılık gelir.</li>
</ol>7. İlaç 4, Trimethoprim-sulfamethoxazole, ilave
<ol><li>Konik bir tüpe 14 mL steril dH2O ekleyin.</li>
	<li>C 1 V 1 = C 2 V2formülünü izleyerekilacın stok çözeltisinden çıkarılacak hacmi hesaplayın. Böylece, V1 = (C2 x 14 mL) / C1. NOT: Bizim durumumuzda trimethoprim-sulfamethoxazole, 48 x 103 μg/mL'lik bir stok çözeltisinden dört farklı konsantrasyonda hazırlanır. C1 = 512 μg/mL, V1 = 149,33 μL C2 = 1024 μg/mL, V1 = 298,66 μL C3 = 2048 μg/mL, V1 = 597,33 μL C4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194,66 μL</li>
	<li>Hesaplanan hacmi her tüpün 14 mL steril dH2O'sundan çıkarın ve ardından ilacı ekleyin.</li>
	<li>Dördüncü ilacın gerekli konsantrasyonlarını hazırladıktan sonra, 50 μL alın ve C1'in panel 1'e, C3'ün panel 3'e ve C4'ün panel 4'e karşılık geldiği ilgili paneldeki dört plakadaki 2 ve 12 sütunları arasındaki ilgili kuyulara ekleyin.</li>
</ol>8. Bakteriyel inoculum E. coli ESBL hazırlanması ve eklenmesi
<ol><li>Steril bir döngü kullanarak, daha önce bir plaka üzerinde kültürlenmiş bakteriyel izole E. coli ESBL'nin bir kolonisini 2 mL steril MHB ve girdap içine aktarın.</li>
	<li>Bir densitometre kullanarak 0.5 McFarland olması gereken yerde bulanıklığı kontrol edin.</li>
	<li>Steril bir idrar kabına 80 mL steril MH suyu ekleyin.</li>
	<li>C 1V 1 = C 2 V2'yitakiben idrar kabına0,5McFarland inokülüsten bakteriyel inokülum ekleyin, burada V 1 =(10 6 x 80 mL) / 108 = 800 μL.</li>
	<li>Pipet 50 μL inoculum çözeltisi 106 CFU/mL sterilite kontrolü iyi olan H12 hariç her kuyuya.</li>
	<li>Panelleri gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, kuyulardaki büyümeyi kaydetmek için 50 μL Iodotetrazolium ekleyin.</li>
</ol>9. FIC şablonu için protokol (Ek Dosya)
<ol><li>A panelinde sarı hücreye en yüksek ilaç 1 (Cefotaxime) konsantrasyonu yazın.</li>
	<li>B panelinde sarı hücreye en yüksek ilaç 2 (Amikacin) konsantrasyonu yazın.</li>
	<li>C panelinde sarı hücreye en yüksek ilaç 3 konsantrasyonu (Levofloksasin) yazın.</li>
	<li>En yüksek ilaç konsantrasyonu 4'ü (Trimethoprim-sulfamethoxazole) panel D'ye yazın.</li>
	<li>Kırmızıda büyüme olan kuyuları vurgulayarak Redline'ı (Büyüme/Büyüme yok arayüzü) takip edin.</li>
	<li>İlaç 1'in MIC'ini ilaç 1 (ATB1) tablosuna yazın.</li>
	<li>İlaç 2'nin MIC'ini ilaç 2 (ATB2) tablosuna yazın.</li>
	<li>İlaç 3'ün MIC'ini ilaç 3 (ATB3) tablosuna yazın.</li>
	<li>İlaç 4'ün MIC'ini ilaç 4 (ATB4) tablosuna yazın.</li>
	<li>ATB1 için FIC hesaplamak için<ol>
<li>Büyüme/Büyüme yok arabirimindeki kuyuları belirleyin.</li>
		<li>Atb1 tablosunda, FIC1'in yanındaki hücreye çift tıklayın ve A panelinin solundaki sarı hücreyi seçilen ilk kuyuya sürükleyin.</li>
		<li>9.10.2 adımlarını, kuyu 1'in FIC1'e karşılık geldiği, 2'nin FIC2'ye karşılık geldiği ve benzeri her kuyu için tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATB2 için FIC'yi hesaplamak için<ol>
<li>ATB2 tablosunda, FIC1'in yanındaki hücreye çift tıklayın ve B panelinin solundaki sarı hücreyi önceden seçilmiş ilk kuyuya sürükleyin.</li>
		<li>Önceden seçilmiş her kuyu için 9.11.1 adımlarını yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATB3 için FIC'yi hesaplamak için<ol>
<li>Tablo ATB3'te, FIC1'in yanındaki hücreye çift tıklayın ve C panelinin solundaki sarı hücreyi önceden seçilmiş ilk kuyuya sürükleyin.</li>
		<li>Önceden seçilmiş her kuyu için 9.12.1 adımlarını yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATB4 için FIC'yi hesaplamak için<ol>
<li>Atb4 tablosunda, FIC1'in yanındaki hücreye çift tıklayın ve D panelinin solundaki sarı hücreyi önceden seçilmiş ilk kuyuya sürükleyin.</li>
		<li>Önceden seçilmiş her kuyu için 9.13.1 adımlarını yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATB1+2+3+4 etiketli tabloda, her ATB'nin FIC1'ini otomatik olarak toplar. Aynı durum diğer FIC'ler (FIC2, FIC3 vb.) için de geçerli olacaktır.<ol>
<li>FIC içeren ve sarı ile vurgulanan hücrede, üzerine çift tıklayın ve TABLO ATB1 +2+3+4'ten toplam ΦFIC'leri seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dokuz plakayı temsil eden dokuz sayfanın her biri için bu adımları yineleyin. NOT: Tüm FIC sayfasında, tablo elde edilen değerin yorumlanmasıyla son toplamlı FIC'yi gösterecektir.</li>
</ol>10. Dört ilaç için mikrodilütion testini kullanarak MIC tayini
<ol><li>Test edilen her ilacın kısaltmasıyla dört farklı satırı etiketle. Örneğin, Cefotaxime için CTX, Amikacin için, Levofloksasin için LEVO ve Trimethoprim-sulfamethoxazole için SXT.</li>
	<li>Pipet 200 μL steril Muller Hinton suyu, kullanılan her satırda kuyu numarası 1 ve kuyu numarası 12'ye. 12 numara negatif kontrol kuyusu olarak hizmet edecek.</li>
	<li>Pipet 100 μL steril Muller Hinton suyu kuyulara 2 ila 11 kullanılan her satırda.</li>
	<li>C1V 1 = C 2 V2 formülünü kullanarak eklenecek her ilacın hacmini hesaplayın. Böylece, V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2, 200 μL olan kuyulardaki son hacimdir, C1 stok çözeltisinin konsantrasyonudur ve C2 ilk kuyuda sahip olmamız gereken ilk konsantrasyondur. NOT: Burada aşağıdakileri kullanırız: Cefotaxime: C1 = 105 μg/mL, burada 104 μg/mL, C 2 =256 μg/mL'ye seyreltiyoruz; böylece, V1 = 20,48 μL Amikacin: C1 = 103 μg/mL, C2 = 64 μg/mL; böylece, V1 = 51.2 μL Levofloksasin: C1 = 5 x 103 μg/ mL, burada 5 x 102 μg / mL, C2 = 16 μg / mL'ye seyreltiyoruz; böylece, V1 = 25,6 μL Trimethoprim-Sulfamethoxazole: C1 = 48 x 103 μg/mL, C2 = 4096 μg/mL; böylece, V1 = 68,26 μL</li>
	<li>Pipet, ilacın eklenmesinden sonra toplam 200 μL hacim elde etmek için 200 μL et suyundan aynı hacmi çıkardıktan sonra ilgili satırın ilk kuyusundaki her ilaç için gerekli hacmi sağlar.</li>
	<li>100 μL'yi kuyudan 1'den kuyu 2'ye çıkararak seri olarak seyreltin ve böylece kuyudan çıkarılan 100 μL'nin atılacağı kuyu 10'a ulaşana kadar. 11'in pozitif kontrol olarak iyi hizmet ettiğini unutmayın.</li>
	<li>Pipet 100 μL 106 negatif kontrol görevi gören 12 numara hariç kullanılan her bir kuyuya bakteriyel inoculum hazırladı.</li>
	<li>Gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+resistance+to+antibiotics.">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antibiotics:+Are+we+in+the+post-antibiotic+era.">Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era.</a> Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+at+the+crossroads.">Antibiotics at the crossroads.</a> Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).</li><li>Bollenbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+interactions:+mechanisms+and+implications+for+drug+discovery+and+resistance+evolution.">Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).</li><li>Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+antibiotic+resistance+in+common+infectious+diseases:+role+of+antibiotic+combination+therapy.">Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).</li><li>Chanda, S., Rakholiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+Synergism+between+natural+plant+extracts+and+antibiotics+against+infectious+diseases.">Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases.</a> Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).</li><li>Cottarel, G., Wierzbowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+drugs,+an+emerging+option+for+antibacterial+therapy.">Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy.</a> Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).</li><li>Kristiansen, J., Amaral, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+management+of+resistant+infection+with+non-antibiotics.">The potential management of resistant infection with non-antibiotics.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).</li><li>Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+treatment+of+infections+with+gram-negative+bacteria.">Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria.</a> Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).</li><li>Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+of+antimicrobial+therapy.">General principles of antimicrobial therapy.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).</li><li>Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+combinations:+Should+they+be+tested.">Antibiotic combinations: Should they be tested.</a> Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin,+meropenem,+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates.">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).</li><li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+essential+oil+components+and+antibiotics:+a+review.">Synergy between essential oil components and antibiotics: a review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).</li><li>Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-kill+assay+and+Etest+evaluation+for+synergy+with+polymyxin+B+and+fluconazole+against+Candida+glabrata.">Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).</li></ol>

Dörtlü Dama Tahtası yöntemi, protokolündeki dama tahtasına ve üç boyutlu dama tahtasına benzer. Ancak, deneme sırasında hataları önlemek için bazı önemli adımlar dikkate alınmalıdır.
Plakalarda seri olarak seyreltilmesi gereken ilaç 1 ve ilaç 2 için seyreltmeleri başlatmak için gereken konsantrasyonların ne olduğunu bilmek için protokole başlamadan önce test edilen izoleye karşı her ilacın MIC'ını test etmeyi unutmayın. İlaç 3 ve ilaç 4 ile ilgili olarak,...

Antibiyotiklerin aşırı kullanımı ve yanlış kullanımı nedeniyle direncin artmasıyla1,2, bakteriyel enfeksiyonları tedavi etmek için yeni ilaçlar ve ajanlar geliştirme ihtiyacı çok önemli hale gelmiştir. Direnç krizinin üstesinden gelmek için yeni ilaçlar geliştirmek gibi yeni yaklaşımlar çok önemlidir. Bununla birlikte, ilaç endüstrisi yeni antimikrobiyal ajanlar geliştirmekle ilgilenmiyor. Ayrıca, yeni ilaçlar geliştirilirse, bakteriler bu yeni ilaçlara karşı gelişmeye ve direnç geliştirmeye devam edecektir3,4. Böylece, direnç sorunu çözülmeyecek ve bakteri direncinin üstesinden gelmek için başka bir yaklaşıma duyulan ihtiyacı dikkate alınması ve çalışılması gereken bir zorunluluk haline getirecektir.
İlaç kombinasyonu, bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde çok önemli bir kavramdır, esas olarak çokdrojenlere dirençli patojenlerin neden olduğu5,6. Tedavinin seyrini azaltır, verilen dozu azaltır; böylece, verilen ilacın toksisitesini azaltmak, direnç gelişme hızını azaltmaya yardımcı olur ve bir şekilde, teminat duyarlılığıkavramındaaçıklandığı gibi bakterileri verilen ilaçlara duyarlı hale verir 5,7,8,9.
Bir ilaca direnç gelişimi tek bir mutasyon gerektirir; bununla birlikte, birden fazla yolu hedefleyen ilaçların bir kombinasyonuna direnç gelişimi, bu kombinasyon tarafından yavaşlatılan birkaç bağımsız mutasyon gerektirir. Kombinasyon tedavisi kullanırken direncin azalmasına bir örnek, Mycobacterium Tuberculosis10'daRifampin'e karşı direncin azalmasıdır. Başka bir örnek Gribble ve ark. tarafından yapılan bir çalışma, piperacillin alan hastalarda dirençli suşların ortaya çıkış oranının karboksipenisilin ve aminoglikozin kombinasyonunu alanlardan daha yüksek olduğunu göstermiştir10. Çalışmalar, gelişen bakterilerde aminoglikozinlere karşı direnç gelişiminin bu suşları diğer çeşitli ilaçlara duyarlı hale getirdiğinigöstermiştir 5. Beta-laktam sınıfı ilaç amoksisilin ve laktamaz inhibitörü clavulanic asit arasındaki kombinasyon dirençli bakteri suşlarının tedavisinde başarı göstermiştir8.
Tedavi süresini azaltmak, ilaç kombinasyonlarından kaynaklanan iyi bir avantajdır. Örneğin, 2 hafta boyunca gentamisin ile kombine penisilin veya seftriakson tedavisi, 4 hafta boyunca verildiğinde sadece penisilin veya sedtriakson tarafından verilen etkinliğin aynısını verecektir11. İlaçların birleştirilmesi, Sub-MIC'ler gibi tek başına verildiğinde etkili olmayan ilaçların daha düşük dozajlarının kullanımına izin verir. Sülfonamidler örneği, üçlü sülfonamidlerin kullanımının en aza indirildiği yerlerde, daha düşük dozlarda, çözünmeyen sülfonamidleri tam dozlarda kullanırken kristal oluşumu veya kristalüri olan toksisiteverilebilir 12.
Böylece verilen dozajın ve tedavi süresinin azaltılması sonunda ilaçların vücuttaki toksisitesini azaltacaktır. Kombine ilaçlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için yöntemler geliştirme fikri çok önemlidir. Bir çalışmada, sonuçlar kombinasyon tedavisinin dirençli Acinetobacter ve P. aeruginosa8 türlerinin tedavisinde daha etkili olduğunugöstermiştir.
İlaçların birlikte verilmesi Dama tahtası yöntemi, zaman öldürme eğrisi yöntemi ve E-test yöntemi13gibi ilaç kombinasyonlarını inceleyebileceğimiz farklı yöntemler vardır. Dama tahtası yöntemi, söz konusu iki ilaç arasındaki tüm olası kombinasyonları bir deneyin kendisinde inceleyebilir. Ek olarak, üç ilacın bir kombinasyonunu incelemek için geliştirilmiştir14. Şimdi, bunu esas olarak multidrug dirençli patojenlerin tedavisi için dört ilacın bir kombinasyonunu incelemek için genişletiyoruz.
Zaman öldürme eğrisi testi genellikle belirli bir ilacın bakterisidal etkisini test etmek için gerçekleştirilir. Ayrıca, belirli konsantrasyonlarda birkaç ilacın birleştirildiği ilaç kombinasyonlarının etkisini test etmek için de kullanılmıştır. Bu protokol, her fincanda et suyunu, ilaçların kombinasyonunu ve gerekli bakteri suşunu eklediğimiz birkaç steril tüpün veya bardağın hazırlanmasını gerektirir. Optik yoğunluğun birkaç zaman noktasında inkübasyonu ve kaydedilmesi sonrasında, büyüme hızının artıp artmadığını veya değişmediğini görmek için kullanılan suşun normal büyüme hızı ile karşılaştırılmıştır13.
E-test yöntemi genellikle söz konusu ilacın gradyan konsantrasyonu içeren bir şeridin aşılanmış bir plakaya konulduğu minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) test etmek için yapılır. Ayrıca, plakaya iki şeridin MIC13'lerindekesişen dik bir şekilde eklendiği iki ilaç arasındaki kombinasyonu test etmek için de kullanıldı.
Literatüre göre sinerjiyi tanımlamak ve incelemek için altın bir standart yoktur; bu nedenle, kombinasyonu incelemek için kullanılan yöntemlerden hangisinin daha iyi olduğunu ve hangisinin daha iyi ve daha güvenilir sonuçlar ürettiğini değerlendirmek zordur esas olarak13. Bununla birlikte, Time-kill testi emek yoğun, zaman alıcı ve pahalı15,16, E-test yöntemi sadece iki ilaç arasındaki bir kombinasyonu incelemek için geliştirilmiştir. Dama tahtası test edilen iki ilaç arasındaki tüm olası kombinasyonları inceleyebilir ve bu yüzden bu teknik geliştirilmek üzere seçilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

İlaç kombinasyon tedavisi kavramı, esas olarak ilaçlara karşı direncin artmasıyla çok önemli hale gelmektedir. Q-checkerboard olarak da adlandırılan Dörtlü dama tahtası, diğer protokollerle aynı sonuçları elde etmek için gereken zamanı ve çalışmayı en aza indirmek için bir deneyde dört ilaç arasında elde edilebilen olası kombinasyonların sayısını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır. Bu protokol, ilaçların seyreltildiği ve birkaç 96 kuyu plakasında birleştirildiği basit mikro seyreltme tekniğine dayanmaktadır.
96 kuyulu tabakların ilk setinde, Muller-Hinton suyu seri olarak seyreltmek için ilk gerekli ilaç (örneğin, buradaki Cefotaxime) eklenir. İlk adım yapıldıktan sonra, belirli bir ilaç 2 hacmini çıkararak aktarılacak ve ilaç içeren ilk 96 kuyu plakaları kümesinde karşılık gelen kuyulara konulacak ikinci ilacı (örneğin Amikaci) seyreltmek için başka bir 96 kuyu plakası seti kullanılır. Üçüncü adım, üçüncü ilacın gerekli konsantrasyonları (örneğin, Levofloksasin), ilaç 1 ve 2 kombinasyonunu içeren ilk sette uygun plakalara eklenerek yapılır. Dördüncü adım, dördüncü ilacın gerekli konsantrasyonları (örneğin, Trimethoprim-sulfamethoxazol) ilk sette uygun plakalara eklenerek yapılır. Daha sonra E. coli ESBL bakteriyel inoculum hazırlanarak eklenecektir.
Bu yöntem, tüm olası kombinasyonları değerlendirmek için önemlidir ve in vivo test için daha fazla test edilmesi gereken daha geniş bir olasılık yelpazesine sahiptir. Çok fazla odaklanma gerektiren yorucu bir teknik olmasına rağmen, sonuçlar dikkat çekicidir ve tek bir deneyde birçok kombinasyonun test edilebildiği zaman tasarrufu sağlar.

Şekil 2A, Cefotaxime ve Amikacin'in belirli Levofloksasin ve Trimethoprim-sulfamethoxazole konsantrasyonlarıyla birleştirilmesiyle elde edilen sonuçları temsil eder. Şeklin sol kısmında, şeklin sağ kısmındaki ilaçların konsantrasyonları ile şematik olarak sunulan dört plakayı görebiliriz. Oklar Büyüme/Büyüme yok arabirimindeki kuyuları temsil eder. Renkli kuyular büyüme içeren kuyulardır. Dördüncü plakanın kombinasyonu içeren kadranda büyüme içermediğini ...

Watch this Scientific Journal Video about Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations at JoVE.com

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Bu protokol, tek bir deneyde dört ilaç arasında elde edilebilen tüm olası kombinasyonların nasıl incelanacağını açıklar. Bu yöntem, sonuçları değerlendirmek için standart 96 kuyu plakası mikro seyreltme testine ve fraksiyonel inhibitör konsantrasyonların (FIC) hesaplanmasına dayanmaktadır.

Dörtlü Dama Tahtası: İlaç Kombinasyonlarını İncelemek için Üç Boyutlu Dama Tahtasının Modifikasyonu

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

quadruple-checkerboard-modification-three-dimensional-checkerboard

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

4.3K Görüntüleme.  University of Balamand. Bu protokol, tek bir deneyde dört ilaç arasında elde edilebilen tüm olası kombinasyonların nasıl incelanacağını açıklar. Bu yöntem, sonuçları değerlendirmek için standart 96 kuyu plakası mikro seyreltme testine ve fraksiyonel inhibitör konsantrasyonların (FIC) hesaplanmasına dayanmaktadır.

Video: Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Perfüze Mikro-biyoreaktörler Chip tabanlı üç boyutlu Hücre Kültürü

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Biyoloji

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Üç boyutlu Hücre ekimi için Chip-ölçekli Yapı iskeleleri mikroimalat

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize&#39;a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

CyanoGate Modüler Klonlama Araç Kiti Kullanılarak Konjugasyon ile Siyanobakterilerin Genetik Modifikasyonu

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...