Bu çalışma (BV) British Columbia Üniversitesi&#39;nden öğrencilik ve (DPS) Sağlık Araştırma Kistik Fibrozis Kanada ve Kanada Enstitüleri hibe tarafından desteklenmiştir. Biz protokollerin ilk hazırlık için Jacqueline Chung teşekkür ederim.

1.. Kültür Büyüme (Gün 1 +2) <ol><li> Gecede 37 ° C rotator de, bir çırpıda en iyi 15 ml tüp Luria Bertani (LB) suyu 3 ml: Bir starter kültür büyütün. Bir 0.6 OD 600 gece boyunca bir büyüme seyreltin. Bir 250 ml Erlenmeyer şişesi içinde LB et suyu 100 ml, bu ayarlama seyreltme ile 1 ml ilave edilir. , Daha iyi yaklaşık için durağan faz (SP) içine 16 saat boyunca 250 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de inkübe edilir toplu kültürü, enfeksiyon ve bu koşullar RPO ve çoğunluk olarak durağan faz, sinyal faktörlerinin kontrolü altında bu bakteriyel hastalık oluşturma faktörlerini sağlamak için algılama, ifade edilmektedir. Seçenek olarak ise, erken SP ya da orta-ya da geç logaritmik fazı yetiştirilen bakteri bakteri adaptasyon faz üzerinde bilgi elde etmek için kullanılabilir. </li><li> 16 saat OD 600 ölçmek ve temin sonra kültür aynı koşullar altında, daha önce yapılmış bir büyüme eğrisi ile karşılaştırma ile SP ulaşmıştır. </li></ol> 2. Protein Ekstraksiyon (Gün 3) <ol><li&gt; Gece buzdolabında önceden tüm medya ve çözümleri Chill. Tüm adımlar, bir buz kovası tüpleri ile yapılmalıdır. Bir mıkro-ve bir Beckman Coulter High Performance santrifüj (veya eşdeğeri), 4 ° C&#39;ye ve iç rotor (rotor = JA-20, santrifüj = J2-HS) Prechill. </li><li> Taze 0.1 M fenilmetansülfonil florür FMSF (&#39;DİKKAT&#39; PMSF, kullanımı yüz kalkanları ve eldiven toksik ve korozif) &#39;dir (&#39; DİKKAT &#39;aseton aseton 1 ml içinde 0.0174 g eriterek aseton (PMSF, 174,19 g / mol) çözeltisi hazırlayın zehirli ve yanıcı) yüz maskeleri ve eldiven kullanın. </li><li> 0.1 ml 0.1 M PMSF, 0.5 M EDTA, 0.1 ml ve 9.8 ml PBS: bir PBS / EDTA / PMSF çözelti hazırlayın. O SP olması gereken yerde 16 saat kültür OD yaklaşık edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 4500 x g &#39;de, bir santrifüj tüpüne Oakridge ve santrifüj kültür için bakteri kültürü ve transferi 35 ml alın </li><li> Bir çöp konteynerine süpernatant kaldırmak vesoğutmalı PBS 35 ml ekleyin ve pelet tekrar süspansiyon. Santrifüj tekrar 20 dakika boyunca 4500 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de </li><li> Soğuk PBS içinde 1 ml süpernatan ve tekrar süspansiyon çıkarın. 2 ml Eppendorf ve 4 ° C&#39;de 14,000 x g&#39;de mikrosantrifüj içinde yüksek üzerinde santrifüj 1 dk, steril Aktarma Çıkarın ve supernatant atın. </li><li> PBS / EDTA / PMSF solüsyonu 1 ml ilave edilir, 2 ml pelet ve transfer ~ 0.5 ml bir cam boncuk (presterilized) ihtiva eden (o-halka) ile vida başlıklı bir tüp tekrar süspansiyon. Cam boncuklar ve boncuk soğuk bir odada 1 dakika boyunca 4 ° C &#39;de bash içeren tüpe yeniden süspansiyon haline pelet ekleyin. Her bash sonra buz üzerinde örnek koyarak, bu 3x yapmak. </li><li> Mikrosantrifüj içinde 1 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı ve steril bir 5 ml polistiren tüp koydu. </li><li> Verim aynı tüpe PBS / EDTA / PMSF solüsyonu 1 ml eklemek arttırmak için tekrar cam boncuklar içerir. Boncuk Bash 1 dakika boyunca 4 ° C&#39;de tüp. Bu 2x buz af örneği koyarak mıter bash. Santrifüj bir dakika 14.000 xg de santrifüj ve süpernatant kaldırmak ve adım 2.8 süpernatanıyla ekleyin. Yeni bir steril 2 ml Eppendorf tüpüne polistiren tüp bir 1 ml şırınga ve bir 0.20 mikron filtre süpernatan kullanın. </li><li> Bu noktada örneklerin Pierce MicroBAC protein ekstre etme kiti ve 200 ug alikotları kullanılarak protein miktarı için tahlil edilmesi gerektiği de dondurulmuş olmalıdır -80 ° C kadar gerekmektedir. </li></ol> 3. Numune Hazırlama (4. gün) <ol><li> 25 ml rehidrasyon bir stok çözelti hazırlayın (8 M üre,% 2 CHAPS,% 2 IPG tamponu,% 0.002 bromofenol mavisi) -20 ° C&#39;de ve 2.5 ml alikotları saklayın Rehidrasyon stok solüsyonu 2.5 ml kısım için kullanımdan hemen önce 7 mg ditiotreitol (DTT, 154.2 g / mol) ilave edin. </li><li> Süreç adım 3.1 &#39;de hazırlanan rehidrasyon stok çözeltisi 450 ul nihai resüspansyondan ile kiti, 2-D Clean up kullanarak adım 2.10 örnekler çözülmüş. </li></ol> 4. IlkOdaklama boyut Izoelektrik (İEF) (Gün 4) Bu bölümdeki tüm adımlar Ettan IGPhor İEF Sistemini kullanıyor. <ol><li> IPG Birinci boyut şeritleri kurmak: şerit temizleme solüsyonu ile temiz şerit tutucuları ve sonra kurumaya baş aşağı bırakın, Milli-Q su ile yıkayın. Bir jel şerit tutucu sayısına her örnek atamak. </li><li> (-) Ucu ikinci geniş bir alanda rehidrasyon aşamasından gelen numune yükleyin. Ambalaj dışında jel şeritler çekin temiz forseps kullanın. Jel şeritler koruyucu tabakasını dışarı atın. (+) Uçtan uca (-) Hat gelen yol boyunca ıslak şeritler almak için yavaş hareket kayar aşağı kaba yan şeritler. </li><li> Tükenmişlik önlemek için elektrot üstüne ve jel şeritler altında sterilize suyla nemli kurutma kağıdı koyun. Arıtılmış su ve etanol ile mermi arasında in-cımbız durulayın. Tüm kabarcıklarını çıkarmak kuru çıkışları engellemek için madeni yağ ile ince bindirme. Makinede jel şerit tutucuları hattı. </li><li> Rehyd için 20 ° C&#39;de 12 saat çalıştırınrasyon, 200 V, 1 saat, 500 V, 1 saat, 1000 V 1 saat, 4000 V 0.5 saat, 8000 V, 12 saat, 300 V ve 24 saat tutun bu anda dışarı alınabilir. </li><li> IEF tamamlandıktan sonra IPG şerit gelecek analizi için, mineral yağ ile kaplanmış Saran Wrap içine -80 ° C&#39;de donduruldu edilmektedir sürece, bu, ikinci boyutlu SDS-poliakrilamid jel elektroforezi gerçekleştirmek tavsiye edilir. Alternatif olarak, DTT nedeniyle erişim noktası iz kalmasından kaçınmak amacıyla bu IPG iodoasetamid ihtiva eden bir tampon maddesi ile önceden ikinci boyuta şeritler bir ikinci dengeleme aşamasını içerir mümkündür. </li></ol> 5. İkinci boyut SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (gün 5) Bu bölümde tüm adımlar Ettan DALTsix elektroforez aygıtı kullanılarak edilir. <ol><li> Jel teker aparatı monte etmek için, iyice tüm parçaları temizlemek ve emin olun jel tekeri düzeyi ve bağlayıcı gri kauçuk silikon jel ile yağlanır. Siyah ovmak koydualt üçgen tıpa ber. Daha sonra, alternatif olarak cam ön bakan kısa plaka ile ayırıcı ve cam levha yerleştirin. Ayırıcılar arka ve ön olduğundan emin olun. Dolgu maddeleri (yaklaşık 5 yaprak) kalan alanı doldurmak için, üst düzdür. Dışarıdan kırmızı ucu ile ön paneli koydu. Kullanım her tarafı sıkın ve alt vidalarını sıkmak için sıkıştırır. </li><li> Jel hazırlanması: Duracryl ve 297,3 ml ekleyin, Tris Buffer 147 ml 1.5 M pH 8.8, ve vakum ucu içeren bir balona Milli-Q su 143.3 ml (&#39;DİKKAT&#39; Duracryl toksik kullanımı yüz kalkanları ve eldiven olan) bir karıştırma çubuğu. Üst kapak koyun ve 20 dakika süreyle vakum ile orta hızda çözelti karıştırın. Vakum çözelti de gazı için kullanılır. Milli-Q su içinde 2 ml APS 0.2 g amonyum persülfat çözeltisi (APS, 218.8 g / mol) taze bir% 10 olun. </li><li> Jel döküm için jel karışımı ekleme: vakum yapıldığında% 10 sodyum dodesil sülfat 6 ml (SDS, 228,38 g / mol) ekleyinşişenin yan tarafına çözelti içinde daha fazla kabarcıklar koyarak önlemek için. , APS ilave edin, &#39;-tetrametiletilendiamin (TEMED, 116.20 g / mol) 0.25 ml N, N, N ekleyebilir (&#39; DİKKAT &#39;TEMED yanıcı kullanımı yüz kalkanları ve eldiven) ve karıştırın. </li><li> Düzeneğin arka sokulan bir huniden jel döküm içine jel karışımı dökün. Kısa plakasının altında bir inç kadar dökün. Jel üstüne suyla doyurulmuş butanol 1,5 ml ilave edilir ve su kaybını önlemek için saran sargı ile üst sarın. Tam edilebilir bir polimerizasyonun sağlanması için 1 saat boyunca bekleyin. </li><li> Jel Denetleme: jel (şişeyi kontrol edin) yapıldığında, bir lavabo ile jel tekeri sökmeye. Ilık su ile cam plakalar durulama sırasında jel bütünlüğünü kontrol, su plakasını girmek için izin vermez. Butanolü dökün ve butanol kurtulmak için iki kez su ile jel üst durulayın. Tekrar su ile doldurun ve üst jeller hemen kullanılmadığı takdirde bekletin. </li><li> Çıtalarının hazırlanması: dengeleme tampon maddesi çözeltisi hazırlayınDerin dondurucu (6 M Üre, 75 mM Tris-HCl pH 8.8, 29.9% SDS,% 0.002 bromofenol mavisi). Bu, -20 ° C&#39;de önceden hazırlanmış ve 10 mi alikotlar içinde muhafaza olabilir, Denge tampon çözeltisi, 10 ml DTT 0.1 g. Bir tüp iki IPG şeritleri için de kullanılabilir. Tampon üzerine aşağı şerit yüz jelleri koyun ve 30 dakika bekletin. Hangisi sonu hatırlıyorum. </li><li> Elektroforez ünitesi (2-D ayırma aygıtı) hazırlanması: 1x elektroforez tamponu (25 mM Tris baz [121,1 g / mol], 192 mM Glisin [288,38 g / mol], ve% 0.1 ağırlık / hacim SDS [288,38 4.5 L ekleyin g / mol]) çalışma tankına. Bu tampon 3x kadar kullanılabilir. Elektroforez birimini açın. Su soğutma makinesi su seviyesini kontrol edin ve düşük ise su ile doldurun. 10 ° C olmalıdır belirlenen sıcaklığını kontrol etmek için basın modu, makineyi açın </li><li> 2x çalışan tampon maddesi 1 L ve tampon çalışan 1x 1 L yapın ve 4 ° C&#39;de saklayın Ağırlık agaros 0.25 g: agaroz-sızdırmazlık çözümü olune ve 1x çalışan tamponu, 50 ml içinde çözülür. 15 saniye her Pulse. </li><li> Elektroforez birimi kurma: cımbız kullanın her şerit çıkarmak ve temiz bir kağıt havlu ile her iki tarafta aşırı tampon kaldırmak için. Şeritler DOKUNMAYIN. Jelin üstünde su dökün ve 1x çalışan tamponu ile jel üst satır. Temiz cımbız kullanın ve jel tarafı size bakacak, uzun plaka üstüne şeritler yerleştirin. Yağlayın şeritler 1x tampon eklemek. Slayt şeritler daha aşağı plastik şeritler kullanarak. Şerit ve jel arasındaki tüm kabarcıklar çıkarın. </li><li> Mühür şeridinin üstüne agaroz sızdırmazlık solüsyonu ekleyin. Şeritlerin geri kalanı için tekrarlayın. Jel tanka cam jel yuvasına içeren jeller tabak ve düşük yerleştirin. Dış odasında 1x tampon seviyesinin üzerinde üst bölmeyi koymadan önce belirlenen alt satırında olduğundan emin olun. </li><li> Cam levhaların üzerine üst tampon bölmesi için çerçeve yerleştirin ve tüm wa sağlamakalt bastırarak y aşağı. Bir huni kullanın ve orta çizgisine kadar üst odasına 2x çalışan tampon ekleyin. Bir huni kullanın ve üst satıra ulaşana kadar dış odasına 1x çalışan tampon ekleyin. Üstüne kapak yerleştirin ve Elektroforez ünitesi ve güç paketi açın. </li><li> , 52 V gecede 96 mA, 5 W. mevcut en yakın gümüş tel üzerinde kabarcıklar bakarak gidiyor olmadığını kontrol çalıştırın. Önde gelen çizgi alttan 1 cm kadar jel çalıştırın. </li><li> Proteinler aynı zamanda üretici talimatlarına göre, ekipman ve diğer şirketler gibi BIORAD veya Hoefer belirteçler kullanılarak analiz edilebilir. </li></ol> 6. Jel Görselleştirme Jellerin gümüş rengini (Gün 5-6) <ol><li> (Plastik bir kova içine 800 ml etanol, 200 ml asetik asit ve bir duman başlığı kullanılmıştır Milli-Q su içinde 1000 ml) bir düzeltme çözüm 1. hazırlayın. Çözüm 6 jeller için iyidir. Kapalı tüm makineleri çevirin ve Elektroforez ünitesi ve pu bütün orta bölümüne göz atınlavaboya edeceğiz. Ayrıca lavabo beyaz standı koymak. 2x çalışan tampon içeren üst tepsisini dışarı doğru çekin. </li><li> Cihazı sökmeye ve düzeltme çözüm 1 içine cam plakalardan jelleri kaldırın. Jeller, bunlar cam plakalardan kaldırıldığında köşeleri keserek tespit edilebilir, köşelerin sayısı döküm olarak jel siparişine karşılık gelen kesin. </li><li> En az 1 saat için gece boyunca 4 ° C&#39;de bir çalkalayıcı üzerinde düzeltme çözeltisi ve jeller ile kap yerleştirin </li><li> (% 50 glutaraldehid, 600 ml etanol, 5 potasyum tetratiyonat g (302,46 g / mol), 136 bir sodyum asetat (82,03 g / mol) g ve Milli-Q su ile 20 ml çözelti 2 düzeltmek için jeller transfer 2.000 ml) ve 1 saat için bir rocker yer. </li><li> Jeller Milli-Q su içinde, 15 dakika her biri için 4x yıkayın. </li><li> 30 dakika veya en fazla 48 saat boyunca gümüş nitrat çözeltisi (2.000 ml, gümüş nitrat (169,87 g / Mol) ve formaldehit 500 ul ve Milli-Q su içinde 4 g) &#39;de jeller Leke. </li><li> 1 için jel yıkayınmin Milli-Q su içinde. </li><li> 5-30 dakika boyunca (2.000 ml, sodyum karbonat, 60 g (105,99 g / Mol) ve formaldehit 300 ul, sodyum tiyosülfat (158,11 g / mol), 15 mg, ve Milli-Q su) geliştirici Çözüm transfer dek jel lekeli. </li><li> 10 dakika boyunca (2.000 ml Tris-Base (121,14 g / mol), asetik asit, 40 ml, 100 g ve Milli-Q su) Stop Solution jeller koyun. </li><li> (Uzun süreli depolama isteniyorsa gliserol 40 ml veya 400 ml ve Milli-Q su içinde 1600 ml) depolama için, gliserol çözeltisine jeller transferi, 10 dakika boyunca ve daha sonra bir jel kurutucu kullanılarak kurutun. </li><li> Jetler, ışık transilluminator&#39;de veya Jel görüntüleyicisi kullanılarak fotoğraflandı bir tarayıcı / dansitometresinde, gibi görüntüleme sistemleri kullanılarak boyandıktan sonra görülebilir. Bu tür BioRad&#39;dan PDQuest 2-D analizi gibi Image Analysis yazılımı daha sonra bir numune içinde proteinlerden niceliksel ve niteliksel bilgileri elde etmek için kullanılabilir. </li></ol> 7. Kütle Spektrometre Analiz için jel Gümüş Boyama </p&gt; <ol><li> % 50 metanol içinde jeller saptamak ve 1 saat boyunca% 5 asetik asit elde edildi. </li><li> Gece boyunca, en azından 10 dakika için% 50 metanol içinde yıkayın. </li><li> 10 dakika için damıtılmış su içinde 3x yıkayın. </li><li> 15 dakika boyunca% 0.02 sodyum tiyosülfat (158,11 g / mol) ile duyarlı hale 2x. </li><li> 10 dakika boyunca CHILLED distile su 3x yıkayın 3x. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 saat için en az 20 dakika soğutulmuş,% 1 gümüş nitrat çözeltisi (169,87 g / mol) içinde jel daldırın </li><li> Damıtılmış su ile 1 dakika boyunca yıkama 2x. Tepsi / kova değiştirin. </li><li> % 2 sodyum karbonat, susuz (105.99 g / mol)% 0.04 formaldehit gelişir ve oldukça hızlı sarı döndüğünde atmak; üç partiler var ve her 5 dk değiştirmeye hazır olmak. </li><li> % 5 asetik asit içinde yıkanmakta, daha sonra,% 1 asetik asit içinde depolar. </li><li> USP dereceli etanol ve hava-kuru kullanım öncesi ile 1.5 ml Eppendorf tüpleri (nokta kesik almak tutmak için) durulayın. </li><li> Temiz forseps,% 100 metanol ile tıraş bıçakları ve yüzeyler. </li><li> Etanol ile eldiven ve yüzeyleri sprey. </li><li> Bir akış kaputu ya da temiz hava alanında tüketim noktalar. Noktalar da otomatik bir nokta kesici kullanılarak eksize edilebilir. </li><li> Buz üzerinde Eppendorf tüpleri ve gemi koyun veya buzdolabında tutun. </li></ol>

<ol>
	<li>Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+cenocepacia+in+cystic+fibrosis:+epidemiology+and+molecular+mechanisms+of+virulence.">Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).</li><li>Suarez-Moreno, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Features+of+Environmental+and+Potentially+Beneficial+Plant-Associated+Burkholderia.">Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia.</a> Microb. Ecol. , (2011).</li><li>Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melioidosis:+insights+into+the+pathogenicity+of+Burkholderia+pseudomallei.">Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).</li><li>White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melioidosis.">Melioidosis.</a> Lancet. 361, 1715-1722 (2003).</li><li>Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifarious,+multireplicon+Burkholderia+cepacia+complex.">The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).</li><li>Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Burkholderia+cepacia+complex+in+patients+with+cystic+fibrosis.">Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis.</a> Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).</li><li>Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+susceptibility+of+Pseudomonas+pseudomallei.+Emergence+of+resistance+in+vitro+and+during+treatment.">The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment.</a> J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).</li><li>Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+susceptibility+of+65+isolates+of+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+mallei+to+35+antimicrobial+agents.">Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).</li><li>Govan, J. R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transmission+of+Pseudomonas+cepacia+by+social+contact+in+cystic+fibrosis.">Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis.</a> Lancet. 342, 15-19 (1993).</li><li>Thongboonkerd, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proteome+in+Burkholderia+pseudomallei+rpoE+operon+knockout+mutant:+insights+into+mechanisms+of+rpoE+operon+in+stress+tolerance,+survival,+and+virulence.">Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence.</a> J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).</li><li>Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analysis+of+B.+cenocepacia+using+two-dimensional+liquid+separations+coupled+with+mass+spectrometry.">Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry.</a> Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).</li><li>Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+profiles+and+the+potential+markers+between+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+thailandensis.+Mol.">Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol.</a> Cell Probes. 21, 81-91 (2007).</li><li>Harding, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+surface+proteins+of+Burkholderia+pseudomallei.">The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei.</a> Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).</li><li>Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+(2-D+DIGE)+reveals+molecular+strategies+employed+by+Burkholderia+cenocepacia+to+adapt+to+the+airways+of+cystic+fibrosis+patients+under+antimicrobial+therapy.">Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy.</a> Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).</li><li>Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Mucoidy+in+Virulence+of+Bacteria+from+the+Burkholderia+cepacia+Complex:+A+Systematic+Proteomic+and+Transcriptomic+Analysis.">The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis.</a> J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).</li><li>Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+proteome+of+Burkholderia+cenocepacia+H111:+setting+up+a+2-DE+reference+map.">Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map.</a> Proteomics. 6, 207-216 (2006).</li><li>Weiss, W., Gorg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+solublization+buffers+for+two-dimensional+electrophoresis.">Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis.</a> Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).</li><li>von der Haar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protein+extraction+for+quantitative+proteomics+of+yeasts.">Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts.</a> PLoS One. 2, e1078 (2007).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li><li>Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+low-abundance+proteins+using+multidimensional+chromatography+and+isotope-coded+affinity+tags.">Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags.</a> J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li><li>Velapati&#241;o, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+proteins+from+Burkholderia+pseudomallei+isolated+during+primary+and+relapsing+melioidosis.">Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis.</a> Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).</li><li>Chung, J. W., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+and+characterization+of+bacterial+factors+associated+with+Burkholderia+cenocepacia+survival+in+a+murine+host.">Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host.</a> Microbiology. 153, 206-214 (2007).</li><li>Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Public+health+assessment+of+potential+biological+terrorism+agents.">Public health assessment of potential biological terrorism agents.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).</li><li>Thon, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteomic+analysis+of+protein+changes+during+platelet+storage+requires+complementary+proteomic+approaches.">Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches.</a> Transfusion. 48, 425-435 (2008).</li><li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+New+and+Emerging+Proteomic+Techniques.">In New and Emerging Proteomic Techniques.</a> Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).</li><li>Lopez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+silver+stain+and+SYPRO+Ruby+Protein+Gel+Stain+with+respect+to+protein+detection+in+two-dimensional+gels+and+identification+by+peptide+mass+profiling.">A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling.</a> Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Proteinlerin hazırlanması için bir yöntem ve iyi bir tekrarlanabilirlikle Burkholderia proteinlerin çoğunluğu elde olduğunu tarif edilmiştir. Bu, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, LB veya YEM, çorba içinde yetişen aynı bakteri kültürü kullanarak farklı günlerde yapılan iki bağımsız preparatlar aynı protein profili elde edilmesi ile gösterilir. Ancak biz plakaları üzerinde büyüyen bakteriler için bu yöntemi test değil, ekstraksiyon, sıvı ortam içinde büyüm...

Genus Burkholderia fazla 62 türü, niş geniş bir izole edilen Gram negatif organizmaları içerir ve iki ana küme 1,2 ayrılmıştır. İlk küme insan, hayvan ve phytotrophic organizmaları içerir ve en çok çalışmalar nedeniyle klinik önemi bu grubun patojenik türler odaklanmıştır. En patojen üyeleri B&#39;dir pseudomallei ve B. (sırasıyla Meliodosis ve ruam neden olur) mallei 3,4 ve kistik fibrozis (CF) ve kronik granülomatöz hastalık (ÇGD) hastalığa neden fırsatçı patojenler 5 (Burkholderia cepacia&#39;nın kompleksi, BCC 17 tanımlanmış türler), 1. 30&#39;dan fazla patojenik türlerle ikinci küme, bitkiler ya da ortamı ile ilişkili bakteri içerir ve ana 2 için potansiyel olarak yararlı olarak kabul edilmektedir. Çok sayıda komplikasyonlar ortaya frBu tür durumlarda, çünkü 6-9 çoğunda ortadan kaldırmak için zor hale antibiyotiklere karşı içsel veya kazanılmış direnç hasta, hastalığın yayılmasını ve tedavi başarısızlık arasındaki patojenin iletimi gibi Burkholderia cinsin patojenik üyeleri ile om bakteriyel enfeksiyon. Bu nedenle, bakteriyel enfeksiyon kurulması için esas daha net bir anlayış kazanıyor bu organizmaların neden olduğu hastalıkların tedavisi için çok önemlidir. Enfeksiyon kurulması anlamak amacıyla, patogenez ile ilişkili bakteri bileşenleri üzerinde kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır. Proteomik yaklaşımlar kullanılarak Burkholderia organizmaların proteomik analizi odaklanan çalışmalar bakteri patojeninde yanı sıra proteomu değişiklikler 10-16 profilleri edilmiş proteinler açıklanmıştır. Yüksek konsantre ihtiva eden liziz tamponu içinde sonikasyon ve dondurularak çözülmüş döngüleri kullanılarak protein çıkarma yöntemleriüre entration, deterjan ve amfolitler ile kombinasyon halinde tioüre Burkholderia proteomik çalışmalar 10-13 uygulanmıştır. Üre protein denatürasyonu için oldukça etkili olsa da, bu şekilde (Karbamilleme reaksiyonu) 17 eserler oluşturan amino asit grupları ile reaksiyona girebilen amonyum izosiyanat, sulu çözelti içinde bir denge kurabilir. Bu nedenle, siyanat tarayıcılar olarak işlev taşıyıcı amfolitler içerir ve 37 ° C 17 üzerinde sıcaklıklar önlemek için önerilir. Ayrıca, protein miktarının eden liziz tamponu, herhangi bir kimyasal etkileşimi önlemek için, aynı liziz tamponu örnekler ve standartlar, aynı arka plan 10 sahiptir, böylece standart bir eğri oluşturmak için kullanılabilir. Diğer yöntemler ısı kuluçka dönemleri 17,18 ile alkalin tamponlar ve deterjan kullanımını içerir, ancak bu koşulların proteomun değişikliklere neden olabilir ve bazı deterjanlar pr ile uyumlu değildiroteomics uygulama müteakip deterjan kaldırma adımlar 17,18 dahil edilmedikçe. , Yeterli bir özümleme ve miktar sonra her bir proteinin küresel protein ekspresyonu, iki boyutlu (2-D) jel elektroforezi gibi proteomik yaklaşımlar kullanılarak incelenebilir. Bu teknik, ilk olarak O&#39;Farell 19 tarafından tanımlanan ve ikinci boyutta akrilamid jel elektroforezi ile birinci boyutta izoelektrik odaklama ile izoelektrik noktasına göre proteinlerin ayrılması, ve daha sonra, moleküler ağırlığa göre de oluşuyor. Nedeniyle çözünürlük ve hassasiyet için, bu teknik karmaşık biyolojik kaynaklardan 19,20 proteinlerin analizi ve tespiti için güçlü bir araçtır. Bu ayırma tekniği transkripsiyon sonrası modifikasyon veya proteolitik işlenmesi nedeniyle protein izoformlarını çözme büyük avantajı ile protein-merkezli yaklaşımlar şu anda kullanılabilir. Kantitatif değişikliklerJelin 20 lekelenmesiyle karşılık gelen nokta yoğunluğunu karşılaştırarak tespit edilebilir. Ancak, bu teknik çok büyük proteinler, zar proteinleri, oldukça bazik ve asidik ya da hidrofobik proteinlerin tanımlanması için uygun ve biraz zahmetli ve zaman alıcı bir teknik 20&#39;dir değildir. Daha sağlam ve objektif olan yeni peptid-merkezli yaklaşımlar (non jel bazlı) kullanılabilir hale gelir ve bu (İcat) 21 etiketleme izotop kodlu afinite ile sistein etiketleme, ve amino grubu gibi diferansiyel izotop etiketleme yöntemleri ile Kantitatif karşılaştırma için kullanılabilir göreli ve mutlak kantitatif (iTRAQ) 22 için izotop etiketleme tarafından etiketleme. Tek proteomik tekniğin kullanılması yeterli bilgi verebilir ve bu nedenle, iki tamamlayıcı proteomik yaklaşımların kullanımı proteom en tam değerlendirmek değişiklikler için gereklidir. Bununla birlikte, 2-D jel elektroforezi yaygın olarak kullanılan ve rutin Quan için uygulanabilirfarklı organizmalar çeşitli proteinlerin ifadesini titative. Burada adapte ve optimize GE Healthcare 2-D Elektroforez Esaslarına ve yöntemleri Handbook 80-6429-60AC 2004 (edildi Burkholderia türler için bir bütün hücre protein çıkarma ve 2-D jel elektroforezi prosedürlerini tarif <a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a> ). Protein ekstre etme, 5 mM EDTA (etilendiamin tetraasetik asit) ve 1 mM PMSF (fenilmetilsülfonil florür) içeren PBS varlığında, cam boncuklar ile bir boncuk çırpıcı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu işlem en az bozulma ile proteinlerin ölçümü sağlar ve daha önce bildirilen 15,23,24 gibi proteomik yaklaşımlar için iyileştirilebilir. 2-D jel elektroforezi 24 cm uzun hareketsiz pH 4-7 gradyan ve proteinleri kullanılarak gerçekleştirildi izoelektrik noktasına göre ayrıldı. Sonra proteinler Molec göre ayrıldıSDS-poliakrilamid jel ile küler ağırlığı. Ayrıca, nokta proteinlerin görselleştirme ve kütle spektrometre analizi için uygun olan bir gümüş leke yöntemi için bir gümüş boyama yöntemi açıklanmıştır. Birlikte bu işlemler patojeneze dahil olabilir Burkholderia türlerinin önemli proteinlerin tanımlanmasını izin verebilirsiniz.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7626</td>
 <td>Toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A18-1</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS Buffer</td>
 <td>Bioscience</td>
 <td>R028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP118-500 </td>
 <td>toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass beads (0.1 mm)</td>
 <td>BioSpec Products</td>
 <td>11079101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21009-342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroBCA protein extraction kit</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>23235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-681-375</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-D Clean-Up kit</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6484-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15505-050</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>17-1314-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>856126</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>176002-46</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Duracryl</td>
 <td>Proteomic Solutions</td>
 <td>80-0148</td>
 <td>Very toxic, carcinogen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP179-100</td>
 <td>Flammable, toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15524-010</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP166-500</td>
 <td>Acute toxicity, flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15510-027</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>HC1100-1GL</td>
 <td>Flammable, toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A491-212</td>
 <td>Flammable, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutaraldehyde</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>G151-1</td>
 <td>Very toxic, corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium tetrathionate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2926</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium acetate</td>
 <td>EM Science</td>
 <td>7510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver nitrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>209139</td>
 <td>Corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>252549</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium thiosulfate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S7026</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>EMD</td>
 <td>9230</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>808831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>800688</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A412-4</td>
 <td>Flammable, toxic, health hazard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium carbonate anhydrous</td>
 <td>EMD</td>
 <td>SX0400-3</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral oil</td>
 <td>ACROS</td>
 <td>415080010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JA-20 ultracentrifuge rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>334831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini Beadbeater</td>
 <td>Biospec Products</td>
 <td>3110BX</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6505-03</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6485-27</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

total protein extraction and 2-d gel electrophoresis methods for burkholderia species

Bakteri türlerinin hücre içi protein düzeylerinin araştırılması bu organizmaların neden olduğu hastalıkların patojenik mekanizmaların anlaşılması önem taşımaktadır. Burada, fosfat tamponlu tuzlu su içinde, etilendiamin tetraasetik asit ve fenilmetilsülfonil florit varlığında, cam boncuklar kullanılarak mekanik olarak parçalanması göre Burkholderia türünden protein çıkarımı için bir prosedür tarif eder. Bu yöntem, değişik büyüme koşulları için, farklı Burkholderia türler için kullanılabilir, ve bu diğer bakterilerin proteomik çalışmalarda kullanım için olası uygundur. Protein ekstre edilmesinden sonra, bir iki boyutlu (2-D) jel elektroforezi proteomik teknik bu organizmaların proteomlarda genel değişiklikler çalışma açıklanmaktadır. Bu yöntem, molekül ağırlığı bazında ayrılması ve ardından birinci boyutta izoelektrik odaklama ile izoelektrik noktasına göre proteinlerin ayrılması oluşurikinci boyutta akrilamid jel elektroforezi ile. Ayrılmış proteinlerin görselleştirilmesi gümüş boyama ile gerçekleştirilir.

İki farklı vesilelerle aynı bakteri kültürü çıkarılan protein profilleri karşılaştırmalı analizi, başarılı protein ekstraksiyonlanm gösteren benzer modeller bantlama gösterdi. Ekstre molekül ağırlıklı proteinlerin 10-150 kDa arasında değişmektedir. Burkholderia multivorans gelen tüm-hücre proteini ekstraksiyon Şekil 1 temsili Coomassie blue lekeleme jel (BCC bir üyesi) ya da Şekil LB Maya / Manitol (YEM) suyu ve yetiştirilen klinik izolatlar dur...

Watch this Scientific Journal Video about Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species at JoVE.com

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Burkholderia cinsin üyeleri klinik önemi patojenlerdir. Bu, mekanik bozulma ve daha sonraki analiz için proteomik 2-D jel elektroforezi kullanılarak, toplam bakteri protein çıkarımı için bir yöntem tarif eder.

Toplam Protein Ekstraksiyon ve 2-D Jel Elektroforez Yöntemleri<em&gt; Burkholderia</em&gt; Türler

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

total-protein-extraction-2-d-gel-electrophoresis-methods-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

28.9K Görüntüleme.  University of British Columbia.  Burkholderia cinsin üyeleri klinik önemi patojenlerdir. Bu, mekanik bozulma ve daha sonraki analiz için proteomik 2-D jel elektroforezi kullanılarak, toplam bakteri protein çıkarımı için bir yöntem tarif eder. 

Video: Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

Belirlenmesi için 1.5 Saat Usulü Enterococcus</emDoğrudan Kan Kültürleri> Türler

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Kuş FTA Kartları İnfluenza Sürveyans: Alan Yöntemleri, Biyogüvenlik ve Ulaşım Sorunları çözüldü

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü<em&gt; Anofel</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Bir Kuş Türlerinin Sindirim Sistemi geçtikten sonra Bulaşıcı prions belirlenmesi için prosedürler

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Türler özgü Algılama Loop-aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP) Tahliller<em&gt; Eimeria</em&gt; Tavuklar bulaştırmak ki

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

Otomatik ölçüm Cryptococcal türler polisakkarit kapsülü ve hücre vücut

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...