Ekstraksiyon pipet geliştirilmesi için fon DRP layık bir İç Araştırma ve Geliştirme Hibe kısmen sağlandı.

1. Örnek Lizis <ol><li> Örnekler sıvı formda olmalıdır. Örnek katı ise, örneğin gıda ve dışkı için, örnek salin (PBS) tamponlu su ya da fosfat gibi bir sıvı ortam içinde süspansiyona edilmelidir. </li><li> 1.5 ml tüp 6M Guanidin Tiyosiyanat (pH 6.5) 500 uL ile örnek 500 uL karıştırın. </li><li> Hava def, bir ayıklama pipet ampul bastırın. </li><li> Ampul yavaş yavaş genişletmek için izin vererek, emici malzeme üzerinde, ekstraksiyon pipet içine tüm 1 mL örnek çekin. </li><li> Çıkarma aleti gibi ters çevirin ki sorbent boncuk ve ampul içine örnek drenaj. </li><li> Ekstraksiyon pipet dışarı örnek çıkarmak için dikkatli olmak ampul örneği ile sorbent boncuklar Grind. </li></ol> 2. Nükleik asit ekstraksiyon (Şekil 1, panel A) <ol><li> Ekstraksiyon pipet (aşağı doğru açılması) ters çevirin ve orijinal 1.5 mL tüpüne örnek çıkarmak. </li> &lt;li&gt; ekstraksiyon pipet boyun sorbent tutmak için dikkatli olmak, ılımlı bir hızda, sorbent üzerinden geçen, ekstraksiyon pipet içine tüm 1 mL örnek çekin. </li><li> Ampul bastırarak 1.5 ml tüp içine tüm örneklem boşaltınız. </li><li> 5 geçişten toplam sorbent dört kez daha fazla örnek geçen, adımları 2.2 ve 2.3 tekrarlayın. </li><li> Sorbent üzerinde beşinci geçiş sonra, protein ekstraksiyon tamponu (15 ml konik tüp olarak) 4ml içine tüm 1 mL örnek çıkarmak, tüp kapatın ve daha sonra kullanmak üzere kenara koyun. </li><li> Nihai geçit üzerine orijinal tüp etanol dönen, sorbent üç kez% 95 etanol 1 ml geçerek izole nükleik asitler yıkayın. </li><li> Ikinci bir 1 ml,% 95 etanol yıkama kullanarak 2.6 adımı yineleyin. </li><li> Basın ve nükleik asitler / sorbent yatak kurumaya ekstraksiyon pipet boyunca hava geçerken, 5 dakika ampul bırakın. Ekstraksiyon pipet u ucundan kalan etanol WipeBir Kimwipe şarkı. </li><li> Sorbent beş defadan fazla 10 mM Tris (pH 6,8) 250 uL geçerek nükleik asitler kurtarın. Tris tampon gibi PBS gibi herhangi bir başka uygun bir sulu çözeltisi ile değiştirilebilir. Meydana gelen çözelti, ayıklanan nükleik asitleri içerir. </li></ol> 3. Protein Ekstraksiyonu (Şekil 1, B Paneli) <ol><li> Inversiyon adım 2.5 &#39;dan örnek ve protein ekstraksiyon tamponu tüp karıştırın ve yeni bir çıkarma pipet sorbent üzerinden bu 5 ml numune yaklaşık iki ila üç mililitre geçmektedir. </li><li> Ekstraksiyon pipet boyun sorbent tutmak için dikkatli olmak aynı 15 mL konik boru içine tüm örneklem boşaltınız. </li><li> Sorbent 15 defadan fazla örnek geçen, adımları 3.1 ve 3.2 tekrarlayın. </li><li> Sorbent yatağın üzerinde üç kez, bu kadar özgün tüpüne çıkarırken etanol% 95 etanol 1 ml geçerek sorbent ve bağlı protein yıkayın. </li><li> Ikinci bir 1 ml,% 95 etanol yıkama kullanarak 3.4 adımı yineleyin. </li><html><li> Basın ve protein / sorbent yatak kurumaya ekstraksiyon pipet boyunca hava geçerken, 5 dakika ampul bırakın. Bir kimwipe kullanılarak ekstraksiyon pipet ucundan kalan etanol silin. </li><li> Sorbent beş kat fazla PBS 250 uL geçerek protein kurtarın. PBS tamponu gibi 10 mM Tris (pH 6.8) gibi herhangi bir başka uygun bir sulu çözeltisi ile değiştirilebilir. Meydana gelen çözelti, örneğin, protein içeriği içerir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="Şekil 1A" /> Şekil 1.. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. içerik &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5.

<ol>
	<li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries,+1984-2005.">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li><li>Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+Pipette.">Extraction Pipette.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample.">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli.">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li><li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea.">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li><li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain.">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li><li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages.">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes.">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu raporda açıklanan aracı, kimyaları ve protokol alanına tabanlı, nokta-bakım uygulamalarında kullanılabilir bir elektrik-ücretsiz, çok makromolekül ekstraksiyon sistemi bilinen ilk örneği temsil eder. Her ikisi de alt türleri makromolekülün teşhis veya analitik bir çok cihaz için de uygulanabilir. Numunenin proteini bileşen (Şekil 4) immünoreaktif iken, örneğin izole edilmiş nükleik asitler PCR kalitesi (Şekil 2 ve 3) bulunmaktadır. Dünyanın yalın veya kaynak sınırlı alanlarda bu ekstraksiyon sisteminin kullanımı büyük ölçüde orada yaşayan halklar üzerinde hastalık yükünü azaltabilir. Bu ekstraksiyon sistemi de sade veya uzak yerlerde numune için sağlam henüz hızlı ve maliyet etkin bir yöntem sağlayarak dünya çapında hastalık tarama programlarına yardımcı olabilir. Yukarıda belirtildiği ekstraksiyon yöntemi için bir önemli yönü olduğukullanıcı tarafından değiştirilebilir. Örneğin, numune boyutu ilk 500 μLs (adım 1.2) den büyük veya daha az olduğu durumlarda, kullanıcıya uygun reaktifler hacimleri ayarlayabilir. Yani mutlak hacimleri değiştirilebilir ise örneklem büyüklüğü için reaktiflerin hacimsel oranı sabit kalması gerekir vardır. Aynı zamanda, emici içinde kısımların sayısını düzenlemeler de kullanıcının takdirine bağlı olarak yapılabilir. Daha büyük bir örnek hacmi kullanılır Örneğin, listede daha sorbent kez daha (adım 2.4 ve 3.3) üzerinden örnek geçen sorbent iletişime makromolekül türü (nükleik asit ve protein) olasılığını artıracaktır. Sorbent doygunluk ulaşılana kadar geçişlerde artış artırmak verimliliği yakalamak gerekir. Biz çıkarma aracı ve ilişkili kimyaları protein ekstraksiyon kimyası çok glikozillenmiş kurtarma için verimsiz olması en önemli olan bazı sınırlamaları olduğunu bulmuşlarproteinler. Aşağı diyagnostik bir glikosilatlı protein hedefler olması durumunda, bu sistem tanımlanması için ideal olmayabilir. Ayrıca, nükleik asitler ya proteinlerin biri için ekstraksiyon verimleri üst ve alt sınırları hala tespit ve optimizasyonu kurtarma verimliliği maksimize sürüyor edilmektedir. Aracın daha da geliştirilmesi, bu mevcut bilgi boşluklar giderilecek.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Guanidin Tiyosiyanat </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> etanol </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 109.827-1L </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td></tr></tbody></table>

electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation

Böyle Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis veya prion tabanlı hastalıklar gibi geleneksel ve gelişmekte olan patojenler hükümetler, sanayi ve dünya çapında tıbbi profesyoneller için önemli bir endişe vardır. Örneğin, Shigella ile birlikte EHECs, yaklaşık 325.000 çocuk her yıl ölümünden sorumlu olan ve Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde yaygın laboratuar tabanlı kimlik, 1 kullanılamaz gelişmekte olan dünyada, özellikle yaygındır. Düşük maliyet geliştirme ve dağıtım, patojenler ya da hastalık belirteçleri hızlı bir şekilde tespit ve / veya tanısında yardımcı olması için alan bazlı, nokta-bakım araçlarıyla önemli ölçüde hastalığın ilerlemesine ve hastanın prognozunu değiştirebilir. Biz elektrik ya da ilgili laboratuar ekipmanları 2 olmadan katı-faz ekstraksiyon (SPE) tarafından örnek bir nükleik asitlerin ve proteinlerin izole etmek için bir araç geliştirdik. İzole makromoleküller tan için kullanılabilirileri laboratuar veya alan bazlı noktası bakım platformları kullanarak ya da sis. Önemli olarak, bu yöntem genomik ve proteomik analizi ile teyit güven sunan, nükleik asit ve bir un bölünmüş numuneden proteini verilerin doğrudan bir karşılaştırma için sağlamaktadır. Bizim izolasyon aracı silika bazlı parçacıkları veya filtreler 3 bağlanarak yoluyla chaotropic tuz çözeltisi, genellikle guanidin izotiyosiyanat, nükleik asitlerin izole katı faz nükleik asit izolasyonu için endüstri standardı, BOOM teknolojisi kullanır. CUBRC tescilli katı-faz ekstraksiyon kimyası nükleik asit izolasyonu 4 takiben atık veya akış-thru gelen, bu durumda, chaotropic tuz çözeltileri protein arındırmak için kullanılır. Ambalaj tarafından küçük, ucuz ve basit bir platform haline kimyaları iyi karakterize, biz var altında yapılabilir nükleik asit ve protein ekstraksiyonu için taşınabilir bir sistem yarattıkoşullar iety. İzole nükleik asitler stabildir ve protein içeriği hemen tutulan elle veya diğer immünolojik bazlı analizleri ile analiz edilebilir, güç PCR amplifikasyonu için mevcut olan bir pozisyona taşınabilmektedir. Alanda hastalık belirteçlerinin hızlı tespiti önemli hastalığın ilerlemesi daha erken bir aşamada tedavi uygun ders yönlendirerek hastanın sonucu değiştirebilir. Tarif aracı ve yöntemi hemen her enfeksiyöz ajan ile kullanım için uygundur ve aynı zamanda onların lojistik yükünü azaltırken, kullanıcı çoklu makromolekül tip analizlerin artıklık sunuyoruz.

Nükleik Asit İzolasyon: İzole nükleik asitlerin PCR amplifiable ve protein kontaminasyon ücretsizdir. Örnek 1: kurtarılmış nükleik asitler PCR bazlı uygulamalarda kullanım için uygundurlar. Örneğin, Şekil 2 ile ilişkili Enterohemorrhagic E. shiga toksini genlerinin büyütülmesi gösterir coli O157: ekstraksiyon pipet kullanarak bir nükleik asit / protein ekstraksiyon usul H7 suşu EDL-933 (ATCC # 35150). Shiga toksin genleri stx 1 ve 2 stx Bu ve diğer Enterohemorrhagic E. ılıman lambda benzeri bakteriyofaj ve kusurlu bakteriyofaj bulunur P R organizatörü 5 6 7 8 kontrolü altında coli. E. SOS tepkisinin aktivasyonu coli indüksiyonu ve / ya da toksin üretimi 9 profaj yol açar. Biz Feng ve arkadaşları tarafından çoğaltılmış PCR değiştirilmiş bir versiyonu kullanılmıştır ettik. 11 kültür ve çivili kanalizasyon örneklerinde hem stx stx 1 ve 2 genleri tanımlamak için. Şeritlerinin Şekil 2&#39;de A ve B, bir işlenmemiş kültürü örneği (şeritli A) bir PCR büyütmesi ve işlenmiş bir kültür örneği (şerit B) sonuçlarını göstermektedir. Bu sonuçlar hemen hemen aynı anlamı olan işlenmiş veya izole nükleik asitlerin aslına kaybı yoktur. Önümüzdeki çivili ham kanalizasyon (şerit D) ya da kirpi kanalizasyon izole edilen nükleik asitler (şerit E &amp; F) çoğaltıldı. Bu veriler, izole nükleik asitler kirpi lağım örnekleri non-izole nükleik asitler karşı daha büyük bir amplifikasyon yol açtığını göstermektedir. Bu nedenle doğal kanalizasyon bulunan PCR inhibitörleri ya izolasyonu üzerine kaldırılmış olduğunu veya nükleik asitlerin izolasyonu üzerine yoğunlaşmıştır sonucuna vardık. Bu iki hipotez bir kombinasyonu da mümkündür. Ultraviyole spektroskopisi sonraki izole nükleik asitler görece özgür olduğumuzu göstermek için kullanılan of kontamine protein. Şekil 3 İki E. UV spektrumları gösterir coli O157: H7 nükleik asit ekstraksiyon, etiketli bir izolasyon ve yalıtım, b öncesi izolasyon etiketli bakteriyel kültür normalize spektrum göre. İzole nükleik asitlerin UV spektrumu 260 nm ve 1,8 10 yaklaşırken 280 nm arasındaki bir absorbans hesaplanan oranına sahip olan saf bir nükleik asitlerin spektrumları benzemektedir. Bu veriler, açıklanan yöntem kullanılarak elde edilen nükleik asitin fraksiyonu içinde çok az protein kirletici olduğunu göstermektedir. Protein İzolasyon: nükleik asit / protein izolasyonu deney Kurtarıldı protein immunoreaktif ve saf protein elektroforetik aynıdır. Örnek 2: izole protein parçası RapidChek E. uygulanmıştır coli O157 yanal akış testi şeritler (SDIX, Inc.) Kontroller E. barındıran tüm örneklerde pozitif bir kimlik göstermek coli<html> Veya STX indüksiyon (Şekil 4, sırasıyla, şerit B ve C), olmadan O157,. Şekil 4&#39;te veriler de E. barındıran bu numuneler için olumlu sonuçlar ekstraksiyon pipet kullanılarak nükleik asitlerin ve daha sonra protein için işlendi coli O157. Bu veriler, her numuneden izole proteini ve böylece bir pozitif tepki tetikleme immünoreaktif olduğunu göstermektedir. PCR amplifikasyonu (Örnek 1 &#39;de açıklandığı gibi) izole edilmiş protein fraksiyonu nükleik asitler kirletici yoksun olduğunu göstermek için protein numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu deneyler için sonuçlar jel elektroforezi bütün negatifti. Böylece, örnek protein içeriği nükleik asitler karışmasını ayrıldı sonucuna vardık. Bu sonuçlar, nükleik asitlerin ve protein içeriği ayrı bir fraksiyonlara ayırma aşamada izole edilmektedir ki nükleik asit tecrit adım göstermek için tarif edilenler ile bütün olarak alınmıştır. t &quot;&gt; Örnek 3:. izole protein elektroforezi 10 için uygun olan Şekil 5, bir Coomassie ekstraksiyon pipet kullanılarak ve ilişkili 6M guanidin izotiyosiyanat izole BSA (Şekil 5, şerit A ve C) ve BSA ile yüklenir 8% akrilamid jel boyanmış tasvir protokolü. izole protein elektroforetik mobilite kontrol örnekleri ile aynıdır. Biz böylece çıkarma işlemi izole protein kovalent yapısını değiştirmez sonucuna vardık. <img alt="Şekil 1a" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> Şekil 1, Panel A: Tipik bir nükleik asit ekstraksiyon prosedürü tasviri örnek örnek tüp içinde 6M guanidin tiyosiyanat ile karıştırılır ve sorbent beş kat üzerinden geçirilir.. Son bir geçişten sonra, numune proteini ekstraksiyon tamponu ilave edilir. Sorbent bağımlı ve nükleik asitlere etanol ile iki kez yıkanır. Örnek sonra hava dısrarcıyız ve emici gelen elüt. <img alt="Şekil 1b" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> Şekil 1, Panel B: tipik bir protein ekstraksiyon prosedür Tasvir adım 1, Şekil 1, bir ikinci bir ekstraksiyon pipetle 15 kat emici üzerinden geçer panelinden proteinin izole tamponu ile karıştırılır Örnek.. Prosedürün kalanı nükleik asit ekstraksiyon protokolü ile aynıdır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> Şekil 2:. Bir etidyum bromür ile boyanan agaroz jel Negatif resmi bir çoğaltılmış shiga toksin 1 ve 2 gen amplifikasyonu deney E. ile çivili kültür örnekleri (şerit A ve B) veya ham kanalizasyon örnekleri kullanılarak yapıldı coli O157: H7 (şerit D, E ve F). Örnekleri, ya doğrudan bir PCR reaksiyonu tüp (şeritlerinin A ve B) veya örnekleri ilave edildi izolasyonu süreç ile işlendis ve ekstre nükleik asitler PCR reaksiyonu tüp (Örnekler B, E ve F) ilave edildi. PCR protokolü Feng ve ark 11 tarafından tarif birinin bir modifikasyonudur. Bizim modifikasyon diğer tüm primer çiftleri bırakıp sadece stx 1 (alt bant) ve stx 2 (üst bant) primer çiftleri ile çoğaltıldı bu hedef. Lane C BioRad gelen 1 kB&#39;lık merdiven. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> Şekil 3: E. UV spektroskopi sonuçları coli O157: H7 nükleik asitler bildirilen ekstraksiyon pipet kullanılarak izole izole nükleik asitlerin izolasyonu ve izolasyon b etiketlenir.. Numunenin UV spektrumu da önceden nükleik asit çıkarımı ile test edildi ve pre-izolasyonu etiketlenmiştir. Spektrası, bir Hitachi U3010 spektrofotometre ile ilgili yazılım paketi kullanılarak elde edilmiştir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt; Şekil 4:. RapidChek test şeritleri Renkli fotoğraf Şekil 2&#39;de kullanılan örneklerinin protein içeriği ekstraksiyon pipet kullanılarak izole ve yanal akış testi ile immün reaktivite açısından test edilmiştir. Lanes AC, hücre kültürü nükleik asit ve protein çıkarma olmadan test şeridi eklendi edilir işlenmemiş kontrolleri vardır. Lane A E. olduğu negatif kontrol olarak E.coli BL21 de3 pLysS, Lanes B ve C gösterisi E. coli O157: (B) veya 4 saat boyunca mitomisin C (C) ile muamele edilmeyen idi H7. H ile Lanes D yanal akış test bantları için çıkarılan protein ilave sonuçlarını göstermektedir. Lanes D ve E E. protein ekstraktı kullanılarak probed edildi ya (D) olmadan veya negatif kontrol olarak mitomisin C tedavisi (E) ile coli BL21 de3 pLysS. E. protein ayıklandığında FH sonuçlarını göstermek Lanes coli O157: H7 kullanılmıştır. Proteini (F) arıtılmamış, ya da 2 saat (G) veya 4 saat (H) mitomisin C tedavi edilen kültürden ekstrakte edildi.Pozitif sonuçlar bir çift kırmızı çizgi üretirler. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> Şekil 5:. Bir Coomassie lekeli Fotoğraf SDS-PAGE BSA çıkarma pipet ve açıklanan protokolleri kullanarak çözüm izole edildi. Şeritlerinin A ve C, sırasıyla 250 ug / ml ve 500 ug / mL &#39;lik kontrolü şeritleri vardır. Şerit B, D, ilgili kontrol olarak aynı konsantrasyonlarını ihtiva eden çözeltiler elde BSA tasvir etmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation at JoVE.com

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Bir aracı ve kimyalarına sırayla elektrik için gerek olmaksızın bir numuneden proteinler tarafından takip nükleik asitler izole etmek için tarif edilmiştir. Aracı izolasyon kimyaları katı-faz ekstraksiyon ilkelere dayalı iken bir transfer pipeti içinde düzenlenen bir sorbent oluşur. İzole makromoleküller immüno-bazlı ve PCR bazlı analizleri ile analiz edilebilir.

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

electricity-free-sequential-nucleic-acid-and-protein-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Görüntüleme.  CUBRC, Inc.. Bir aracı ve kimyalarına sırayla elektrik için gerek olmaksızın bir numuneden proteinler tarafından takip nükleik asitler izole etmek için tarif edilmiştir. Aracı izolasyon kimyaları katı-faz ekstraksiyon ilkelere dayalı iken bir transfer pipeti içinde düzenlenen bir sorbent oluşur. İzole makromoleküller immüno-bazlı ve PCR bazlı analizleri ile analiz edilebilir.

Video: Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Gelişmekte Embriyonik Fare Kalp Vana Bölgesi&#39;nde Protein İzolasyonu

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...