Biz fare poliklonal anti-RVFV antiserum ve akış sitometri ile yardım için UTMB Sitometrisi Core Tesisi M. Griffin sağlamak için RB Tesh teşekkür ederim. Bu çalışma UTMB.OL de James W. McLaughlin Bursu Fonu desteklenmiştir tarafından desteklenmiştir UTMB.BK de Aşı Geliştirme için Sealy Merkezi&#39;nden Batı Bölgesel Mükemmellik Merkezi, NIH hibe R01 AI08764301 ve finansman ile 5 U54 AI057156 tarafından desteklenmiştir Bir Maurice R. Hilleman Erken-Evre Kariyer Araştırmacı Ödülü.

Floresan mikroskobu ile transkripsiyon analizi 1. MP-12 ve AB ile Etiket Doğan RNA ile hücreler enfekte <ol><li> 12-iyi doku kültürü plakası içine Sıra 12-mm yuvarlak lamelleri, iyi başına bir lamel. </li></ol> Not: hücreleri kuyularda yerleştirmeden önce sorun lamelleri bağlı kalarak, poli-L-lisin (MW ≥ 70.000) ile kat var. Bu amaçla, 5 dakika boyunca poli-L-lisin H2O içinde steril, 0.1 mg / ml çözelti daldırmak lamelleri. En az 2 saat süreyle steril H 2 O ve hava-kuru ile lamelleri durulayın. <ol start="2"><li> Lamelleri üzerine tohum 293 hücreleri için, oyuk başına 1 ml büyüme ortamı (DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ihtiva eden) 5 x 10 4 hücre ekleyin. 37 nemlendirilmiş bir inkübatör inkübe ° C ve% 5 CO 2 O / N </li><li> 3 &#39;lik bir enfeksiyon çokluğu (İB) de MP-12 hücreleri enfekte. Dahil, en az iki<html> bulaşmamış kuyu: iki kuyu biri enfekte olmayan kontrol olarak hizmet verecek, diğer transkripsiyonel bastırma için bir kontrol olarak adım 1.5 de aktinomisin D (ActD) ile tedavi edilecektir. Büyüme ortamı çıkarın ve virüs stokunun seyreltmek böylece toplam hacim, her bir oyuğa ilave bir 200 ml &#39;dir. 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 1 saat boyunca inkübe ° C ve% 5 CO2. </li></ol> Not: yerine hücrelerin enfekte arasında, hücreler de plasmid DNA ile transfekte ya da in vitro olarak, belirli bir viral proteini kodlayan bir RNA sentez edilebilir. Bu amaçla, üreticinin talimatlarına göre uygun bir kimyasal transfeksiyon reaktif ile hücreleri transfect ve 16 saat sonrası transfeksiyon 1.5 adıma geçin. Bu RNA etiketleme ve sabitleme önce transfeksiyon koşulları ve inkübasyon süresi optimize etmek için tavsiye edilir. <ol start="4"><li> Inokulum kaldırmak ve iyi başına 1 ml taze besi ekleyin. 15 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol>ove_content &quot;&gt; Not:. başka bir virüs ile kullanmak için bu protokolü adapte, bu RNA etiketleme ve sabitleme için en uygun zaman noktası belirlemek için bir süre ders deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir bu kez enfeksiyon kez sendeleyerek böylece o dersin ve tüm kurun örnekler, etiketli sabit ve aynı zamanda boyanmış olabilir. <ol start="5"><li> 15 saat sonrası enfeksiyon (hpi), 1 mM AB içeren orta büyüme orta yerine. Sahte enfekte kuyu biri olan, aynı zamanda 5 ug / ml ActD ekleyin. ActD DNA-bağımlı RNA sentezini inhibe eder gibi bu, transkripsiyonel bastırma için kontrol olarak görev yapacak. Inkübatör hücreleri dönün. </li><li> 16 hpi olarak, orta kaldırmak ve 1 ml PBS (KCI 0.20 g / l, KH 2 PO 4 0.20 g / L NaCl, 8.00 g / L Na 2 HPO 4 1,15 g / l, pH 7.4) ile bir kere yıkayın lamelleri de başına. Oyuk başına% 4 paraformaldehid, 1 ml (PFA) eklenerek ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edilerek hücreleri saptamak. </li></ol>Not:% 4 PFA sabitleme solüsyonu hazırlamak için, ° C ısıtılmış bir manyetik karıştırıcı üzerinde 60 kadar ısıtılır 150 ml H 2 O 10 g paraformaldehid çözülür. 1M NaOH 500 ul ekleyin ve çözüm berrak hale gelinceye kadar karıştırmaya devam edin. Partikülleri kaldırmak ve 62.5 ml fosfat tampon eklemek için bir kağıt filtre ile filtre PFA çözeltisi (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM 2-Na HPO 4, pH 7.4). 250 ml toplam hacme H2O ekleyin. Tek kullanımlık alikotları -20 ° C&#39;de dondurun. <ol start="7"><li> Oyuk başına 1 ml PBS ile bir kez yıkayın. Resim inkübasyon süresi bu ve daha sonraki tüm yıkama adımları için gereklidir. 2. adıma hemen geçin. </li></ol> Not: Uzun süre için bu aşamada tutulması durumunda RNA dejenere gibi, hemen tıklama reaksiyon devam etmek açısından önemlidir; hücreler, 4, 1 saat boyunca tutulur, RNA flüoresan sinyal kaybı önceden tespit edilebilir ° C . Benzer şekilde, eğer başıBir süre ders deney oluşturan, etiket emin olun düzeltmek ve aynı zamanda tüm örnekler leke. 2. Etiketli RNA Algılama Reaksiyon tıklayın <ol><li> 1 ml PBS içinde% 0.2 Triton X-100 eklenmesi ile hücre geçirgenliği. Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li></ol> Not: adımda kullanılan tüm çözümler 2.1 ile 2.3 nükleaz ücretsiz olması gerekir. <ol start="2"><li> Oyuk başına 1 ml PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Nemli odasına 12-plaka ve transfer lamelleri çıkarın. Her: 100 ul tıklayın boyama solüsyonu (100 mM askorbik asit 100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO 4, 20 mcM floresan azid [590/617 nm uyarma / emisyon maksimum]) - 50 ile her lamel örtün. Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> Not: Plastik parafin film ile 10 cm çapında nemli odası, çizgi bir hücre kültürü veya petri altına monte etmek için. Di kenarının iç çizgiyinemli kağıt havlu ile sh. Plastik parafin film üzerine lamelleri yerleştirin. Not: lamelleri bu veya protokolde başka bir adımı sırasında kurumasına izin vermemek için dikkatli olun. Bu nemli odasına yerleştirildi kuruluşuna her lamel boyama çözüm eklemek için en iyisidir. Not: Bu adımı hemen önce taze tıklama boyama çözüm hazırlayın. 1.5 M Tris, pH 8.5, 100 mM CuSO 4 ve 500 mM askorbik asit stok çözeltileri 4 ° C de muhafaza edilebilir Ancak, sarı döndü herhangi bir askorbik asit stok solüsyonu atın. Not: floresan mikroskop filtreleri eşleşen bir fluorofor seçtiğinizden emin olun. <ol start="4"><li> Yeni bir 12-plaka içine nemli odası ve yerden lamelleri çıkarın ve iyi başına 1 ml PBS ile üç kez yıkayın. </li></ol> Not: de iseviral proteinlerin koruması, istenen lamelleri monte edilebilir ve bu adımı (3.3 adıma geçin) sonra görüntülenmiş. 3. Viral Proteinlerin İfade bulmak için İmmünofloresan <ol><li> Her bir kuyucuğa engelleme tamponu, 1 ml (% 3 (w / v) sığır olarak albumin (BSA), serum PBS) ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Nemli odasına, 12 plaka transfer lamelleri çıkarın ve 50 ile kapak - tampon (1:500) engelleme seyreltilmiş primer antikor 100 ul (anti-RVFV, Dr RB Tesh bir tür hediye, UTMB). Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> Not: Farklı bir virüs ile kullanmak için bu protokolü adapte olduğunda, önce primer antikor için en uygun seyreltme belirler. Not: Alternatif olarak, bu adım, karanlıkta 4 ° C&#39;de O / N gerçekleştirilebilir. <ol start="3"><li> 12 plaka geri nemli odası ve yerden lamelleri çıkarın ve yıkayınüç 1 ml PBS ile kat başına iyi. </li><li> 50 ile nemli odası ve kapağı içine 12-iyi bir yerde, yerden lamelleri çıkarın - ikincil antikor 100 ul (anti-fare IgG floresan boya [uyarma / emisyon maksimum: 495/519 nm] konjuge) (1 tampon engelleme seyreltilmiş: 500). Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> Not: Birincil antikor tanımak ve floresan mikroskop filtreleri uygun bir ikincil antikor seçtiğinizden emin olun. Not: Arzu edildiği takdirde, 200 ng / ml &#39;DAPI çekirdekleri görselleştirmek için ikincil antikor seyreltme eklenebilir. <ol start="5"><li> Geri 12 plaka içine nemli odası ve yerden lamelleri çıkarın ve iyi başına 1 ml PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Bir mikroskop lamı üzerine Fluoromount-G bir damla (ca. 15 ul) koyarak lamelleri monte edin. H 2 O içine lamel batırın, inci dokunarak fazla H 2 O çıkarınFluoromount-G açılan aşağı bir kağıt havlu ve yerine hücre tarafı karşı e tarafı. 5 dakika boyunca hava kuru. </li></ol> Not: ters bir mikroskop görüntüleme ise, Fluoromount-G 4 katılaşmaya izin ° mikroskop lamı CO / N veya yapıştırın lamelleri şeffaf oje ile kenar sızdırmazlık tarafından. Not: bir hafta için Slaytlar hemen görüntülü veya karanlıkta 4 ° C&#39;de saklanabilir. 4. Veri Toplama <ol><li> Bir floresan mikroskop kullanılarak görüntü. </li></ol> Not: mikroskop kullanılarak görüntülendi olabilir uygun fluorophores seçtiğinizden emin olun. Başvuru için, aşağıdaki bu yayında gösterilen görüntüler elde etmek için kullanılan fluorophores ve filtre setleri. DAPI: Tahrik olma filtresi: BP 330-385 Iki renkli ayna: DM 400 Emisyon filtresi: LP 420 Tahrik olma filtresi: BP 460-490 Iki renkli ayna: DM 505 Emisyon filtresi: LP 510 590/617 bir uyarma / emisyon maksimum fluorofor: Tahrik olma filtresi: BP 545-580 Iki renkli ayna: DM 600 Emisyon filtresi: LP 610 Akış sitometrisi ile transkripsiyon analizi 5. MP-12 ve AB ile Etiket Doğan RNA ile hücreler enfekte <ol><li> Büyüme ortamı (DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ihtiva eden) içinde 6-çukurlu bir doku kültür levhası içine Tohum 293 hücreleri. % 100 confluency - 37 ° C ve% 5 CO 2 hücreleri 80 ulaşana kadar nemlendirilmiş bir inkübatör inkübe edin. </li><li> Bir moi 3 de MP-12 ile hücreleri enfekte. En az iki bulaşmamış kuyu şunlardır: iki kuyu biri enfekte olmayan kontrol olarak hizmet verecek, diğer adımda ActD ile tedavi olacak5.4. Büyüme ortamı çıkarın ve toplam hacim, her bir oyuğa ilave böylece virüs stokunun seyreltik 400 ul. 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 1 saat boyunca inkübe ° C ve% 5 CO2. </li><li> Inokulum çıkarın ve 2 ml taze besi başına iyi ekleyin. 12 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Not: başka bir virüs ile kullanmak için bu protokolü adapte, bu etiketleme ve hasat için en uygun zaman noktası belirlemek için bir süre ders deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Enfeksiyon kez incelirler ve tüm örnekler hasat, etiketlenmiş ve aynı zamanda boyanmış olabilir, böylece bu zaman aralığının ayarlayın. <ol start="4"><li> 12 hpi de, 0.5 mM AB içeren orta büyüme orta yerine. Sahte enfekte kuyu biri olan, aynı zamanda 5 ug / ml ActD ekleyin. ActD DNA-bağımlı RNA sentezini inhibe eder gibi bu, transkripsiyonel bastırma için kontrol olarak görev yapacak. Inkübatör hücreleri dönün. </li><li> 13 hpi de, zekâ kez hücreleri yıkayınhücreler tripsinizasyon ile saat PBS ve hasat. PBS, 1 mM EDTA (PBS-EDTA) içeren hasat edilmiş hücreler üç kez yıkayın. </li></ol> Not: Bu ve daha sonraki adımları sırasında, 500 daha hızlı hücreler santrifüj yok - 1.000 x g hücre kırılması önlemek için. 1 hücreleri santrifüj - sediment için 2 dk. Not: bir yüzey immün yerine lastik polis veya tek hücre kazıyıcı kullanarak tıklama reaksiyon, hasat sonrasında planlanmış ise. <ol start="6"><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 PFA ve inkübe 1 ml bunları yeniden süspansiyona hücreleri saptamak. % 4 PFA hazırlamak için nasıl talimatlar için 1.6 adıma bakın. </li><li> Oyuk başına 1 ml PBS-EDTA ile bir kez yıkayın. 6. adıma hemen geçin. </li></ol> Not: uzun süre için bu aşamada muhafaza edilmesi durumunda RNA bozulur gibi, hemen tıklama reaksiyon devam etmek önemlidir. Benzer şekilde, bir zaman c yerine iseourse deney, aynı zamanda tüm örnekler, etiket düzeltmek ve leke emin olun. 6. Etiketli RNA Algılama Reaksiyon tıklayın <ol><li> PBS içinde% 0.2 Triton X-100, 0.5 ml &#39;si içinde yeniden asılı hücreleri geçirgenliği. Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li></ol> Not: adımda kullanılan tüm çözümler 6.1 to 6.3 nükleaz ücretsiz olması gerekir. Not: hücreleri bu adımı sırasında tortu düzgün yapmazsanız, 5 dakika için santrifüj süresi artar. Sedimantasyon davranış kez hücreleri FACS tampon (adım 6.4) olarak askıya alınır açısından yararlı olacaktır. <ol start="2"><li> 1 ml PBS ile bir kez yıkayın. </li></ol> Not: Bu Cu 2 + iyonları tıklama reaksiyon için gerekli şelat gibi bu adımda EDTA kullanmayın. <ol start="3"><li> 200 ul tıklayın boyama çözüm içinde süspanse edin hücreleri (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO 4, floresan boya [hariç etiketli 200nM azidaktif rehabilitasyonu amaçlayan / emisyon maksimum, 650/665 nm], 100 mM askorbik asit). Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> Not: Bu adımı hemen önce taze tıklama boyama çözüm hazırlayın. 1.5 M Tris, pH 8.5, 100 mM CuSO 4 ve 500 mM askorbik asit stok çözeltileri 4 ° C de muhafaza edilebilir Ancak, sarı döndü herhangi bir askorbik asit stok solüsyonu atın. Not: Bu adımı sırasında birlikte hücreleri yığın ise, birkaç kez aşağı yukarı pipetleme ve ile tekrar süspansiyon. Not: akış sitometresinde ile tespit edilebilir bir fluorofor seçtiğinizden emin olun. Not: Ayrıca tıklama boyama işlemi tabi değildir enfekte hücrelerin bir örneği hazırlamak, bu akış sitometresinin kalibrasyonu için gerekli olacaktır. Ya enfekte hücrelerin yarısı kullanabilir veya adım 5.2 de iyi enfekte ek içerir. Bu control hücreleri adım 7.1 olarak boyanmış olacaktır. <ol start="4"><li> FACS tampon maddesi (PBS, 1 mM EDTA ve% 0.5 (w / v) BSA içeren) ile iki kez yıkanır. </li></ol> Not: viral proteinlerin herhangi bir immün isteniyorsa, hücreler analiz edilebilir hemen (8 adıma). 7. Viral Proteinlerin İfade bulmak için İmmünofloresan <ol><li> Primer antikor, 200 ul süspansiyon hücreleri (anti-RVFV) FACS tamponu (1:10,000) içinde seyreltilmiş ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> Not: Alternatif olarak, bu adım, karanlıkta 4 ° C&#39;de O / N gerçekleştirilebilir. Not: Ayrıca tıklama boyama işlemi tabi ama boyanmış olmayacaktır enfekte olmamış hücrelerin bir örneği hazırlamak, bu akış sitometresinin kalibrasyonu için gerekli olacaktır. Ya sahte enfekte hücrelerin yarısı kullanabilir veya ek bir bulaşmamış iyi de dahil5.2 adım. Not: Farklı bir virüs ile kullanmak için bu protokolü adapte olduğunda, önce primer antikor için en uygun seyreltme belirler. <ol start="2"><li> FACS tamponunda iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> İkinci antikor, 200 ul süspansiyon hücreleri (anti-fare IgG, floresan boya [uyarım / emisyon maksimum: 495/519 nm] konjüge) FACS tamponu (1:1,000) içinde seyreltilmiş ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> FACS tamponunda bir kez hücreleri yıkayın. </li></ol> Not: Bu noktada, hücreler, karanlıkta 4 ° C&#39;de O / N saklanabilir. 8. Veri Toplama <ol><li> 5 ml polistiren tüpler içine 500 ul FACS tampon, transfer hücrelerin yeniden süspanse ve akış sitometresi kullanılarak analiz. Alet kalibre MP-12 enfekte hücreleri (sadece bir tıklama tepki, anti-RVFV boyama) ve sahte enfekte hücreleri (sadece tepki tıklayın) kullanın. </li></ol> Değile: Cihazınızın ile tespit edilebilir uygun fluorophores seçtiğinizden emin olun. Referans için, aşağıdaki Bu yayında gösterilen veriler elde etmek için kullanılan lazer çizgi ve filtre kümesi vardır. 495/519 bir uyarma / emisyon spektrumu ile fluorofor: Lazer: 488 nm Filtre: 530/30 650/665 bir uyarma / emisyon spektrumu ile fluorofor: Lazer: 640 nm Filtre: 670/20

<ol>
	<li>Fakan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+support+for+RNA+synthesis+in+the+cell+nucleus.">Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus.</a> Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).</li><li>Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+RNA+synthesis+using+bromouridine+labelling+and+bromodeoxyuridine+antibodies.">Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies.</a> Cytometry. 14, 455-458 (1993).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidotriazoles+on+solid+phase:+[1,2,3]-triazoles+by+regiospecific+copper(i)-catalyzed+1,3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides.">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li><li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSs+protein+of+rift+valley+fever+virus+promotes+posttranslational+downregulation+of+the+TFIIH+subunit+p62.">NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li><li>Kalveram, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rift+Valley+fever+virus+NSs+inhibits+host+transcription+independently+of+the+degradation+of+dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR.">Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR.</a> Virology. , (2012).</li><li>Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+Rift+Valley+fever+virus+NSs+encoding+a+partial+truncation.">Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation.</a> PLoS One. 7, e45730 (2012).</li><li>Lihoradova, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Rift+Valley+Fever+Virus+MP-12+Strain+Encoding+NSs+of+Punta+Toro+Virus+or+Sandfly+Fever+Sicilian+Virus.">Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus.</a> PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).</li><li>Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toscana+Virus+NSs+Protein+Promotes+Degradation+of+Double-Stranded+RNA-Dependent+Protein+Kinase.">Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).</li><li>Le May, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TFIIH+transcription+factor,+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus.">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li><li>Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagen-directed+attenuation+of+Rift+Valley+fever+virus+as+a+method+for+vaccine+development.">Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development.</a> J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).</li><li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+infectious+Rift+Valley+fever+virus+entirely+from+cDNA,+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene,+and+expression+of+a+foreign+gene.">Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li><li>Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viral+RNA+by+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH).">Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. , e4002 (2012).</li><li>Reich, E., Goldberg, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinomycin+and+nucleic+acid+function.">Actinomycin and nucleic acid function.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).</li><li>Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+of+fluorochromes+to+monoclonal+antibodies.">Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Sağlanan protokolü doğmakta olan RNA içine üridin analog AB&#39;nin birleşme ile konak hücre transkripsiyon viral enfeksiyon etkisini ölçmek için bir yöntem açıklanır. Hızlı, hassas olduğunu ve radyoaktif izotopların kullanımı dayanmaz: Bu yöntem önceki yöntemlere göre birçok avantajı vardır. Ayrıca yöntem, floresan mikroskobu veya esas itibariyle aynı reaktifler kullanılarak akış sitometrisi ile sayısal veriler ile niteliksel verileri vermek üzere adapte edilebilir. Viral antijenler i...

<html> Geleneksel olarak, transkripsiyonel aktivitesini radyoaktif (3H-üridin) 1 ya dahil edilmesi ile ölçülür ya da doğmakta olan RNA içine (BrU) 2 nükleosidlerin halojenli edilmiştir. Bu üridin analoglan, hücreler tarafından alınır nükleosit kurtarma yolu ile üridin trifosfat (UTP) haline dönüştürüldü ve daha sonra yeni sentezlenen RNA&#39;nın dahil edilmiştir. 3H-üridin zaman alıcı olabilir otoradyografi, veya parıldama ile tespit edilebilir edilir özel ekipman gerektiren, sayma. Ayrıca, radyoaktif izotopların kullanımı yüksek çevreleme biyogüvenlik laboratuarları dahil olmak üzere, laboratuvar ortamlarında bir dizi pratik olmayabilir. BrU RNA ikincil yapı antikor bağlayıcı bir sterik engel olabilir olarak çekirdek ya da RNA&#39;nın kısmen denatüre, ve antikorun erişimi sağlamak için sert geçirgenliği gerektirebilir anti-BrU antikorları ile immüno-boyama yoluyla tespit edilebilir. _content &quot;&gt; Burada açıklanan protokol en son gerilme RVFV MP-12 ile enfekte edilmiş hücrelerde transkripsiyonel aktivitesini ölçmek için kimya 3 tıklayın geliştirilmiştir. Click kimyası, son derece seçici ve etkili bir bakır (I) katalizli bir alkin arasındaki siklo-ilave reaksiyonu dayanır kullanır 4,5-bir azid yarımı. Bu protokol, enfekte olmuş hücrelerde Yeni oluşan RNA ilk üridin analog AB dahil edilmesi yoluyla etiketlenir. ikinci bir adımda, kurulmuş AB, floresan azit ile reaksiyona sokulması ile tespit edilir. Bu yöntemin en önemli avantajları , (1) bunun radyoaktif izotopların kullanımını gerektirmeyen ve (2) bu kadar sert geçirgenliği veya RNA denatürasyon gerektirmez. yetersiz tarafından engellenir değildir az 50 Da, floresan azid ile erişim arasında bir moleküler ağırlığa sahip Bir sınıf ile RNA&#39;nın tespiti birleştirirken geçirgenliği veya RNA sekonder yapısı. Dahası, araştırmacıların birincil antikor seçiminde sınırlı değildirviral proteinler için ical immün. Iki farklı yöntem, bu protokolde tarif edilmektedir: floresan mikroskobu (1-4), ve akış sitometrisi (adım 5-8) aracılığıyla transkripsiyon miktarının belirlenmesi için, bir transkripsiyon ile görüntülenmesi için, bir. Bu yöntemlerin her ikisi bir hücre-by-hücre olarak transkripsiyonel aktivite ve viral enfeksiyon arasında bir ilişki sağlar viral proteinler, bir hücre içi immün ile doğmakta olan RNA etiketleme birleştirir. Yazarlar, başarılı bir protokol RVFV suşu MP-12 6, Toscana virüsü (TOSV) 10 ile enfekte olan farklı MP-12 mutantları 7,8, 9, ve hücreler ile enfekte olmuş hücrelerin ile enfekte olmuş hücrelerin içinde transkripsiyonel aktiviteyi belirlemek için burada açıklanan kullandık. Burada tarif edilen protokol kolayca farklı virüs ile kullanılmak üzere adapte edilmiş ve belirli viral veya hücresel proteinlerin immünofloresan boyama içermek üzere modifiye edilebilir potansiyeline sahip olabilir.

<table><tbody><tr><td>5-ethynyl-uridine</td><td>Berry Associates</td><td>PY 7563</td><td>dissolve in DMSO for 100 mM stock</td></tr><tr><td>12-mm round coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polystyrene tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D (ActD)</td><td>Sigma</td><td>9415</td><td>dissolve in DMSO for 10 mM stock</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2323</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C-8027</td><td>dissolve in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 100 mM stock</td></tr><tr><td>DAPI </td><td>Sigma</td><td>D-9542</td><td>dissolve in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 5 mg/ml stock</td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)</td><td>Invitrogen</td><td>A10270</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>dissolve in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 500 mM </td></tr><tr><td>paper filter</td><td>VWRbrand</td><td>28333-087</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde </td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine (MW &amp;#8805; 70000)</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>dissolve in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 1.5 M stock, pH 8.5</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Olympus IX71</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; BD Biosciences LSRII Fortessa</td></tr></tbody></table>

using click chemistry to measure the effect of viral infection on host-cell rna synthesis

Birçok RNA virüsleri hücresel savunma aşmak için bir araç olarak konakçı hücre transkripsiyonu inhibe etme yeteneği gelişmiştir. Bu virüslerin Çalışma için, enfekte olmuş hücrelerde transkripsiyonel aktivitesini ölçmek için bir hızlı ve güvenilir bir şekilde olması için bu nedenle önemlidir. Geleneksel olarak, transkripsiyon H-üridin gibi immün ile tespit takiben 5-bromouridine (BRU) gibi halojenlenmiş üridin analoglannın Otoradyografi veya sintilasyon sayımı veya birleşme ile tespit takiben 3 gibi radyoaktif nükleosidlerin ya da eklenmesi ile ölçülmüştür. BrU tespiti külfetli olabilir ve düşük hassasiyet muzdarip olurken radyoaktif izotopların kullanımı, ancak, özel ekipman gerektirir ve laboratuvar bir dizi mümkün değildir. Bir azid ve alkin bir bakır-katalize triazol oluşumu içerir yeni geliştirilen tıklayın kimya, şimdi hızlı ve highl sağlarBu iki yöntem y duyarlı bir alternatif. Click kimyası Yeni oluşan RNA önce bir floresan azid ile etiketin saptanması, ardından üridin analog 5-ethynyluridine (AB) eklenmesi ile etiketlenmiş olduğu, iki aşamalı bir işlemdir. Bu azidler görselleştirme için seçenekleri geniş bir yelpazede için izin, birkaç farklı fluorophores olarak mevcuttur. Bu protokol, MP-12 suşu tıklama kimya kullanılarak Rift Valley vebası virüsü (RVFV) ile enfekte edilmiş hücrelerde transkripsiyonel bastırma ölçmek için bir yöntem açıklanır. Aynı zamanda, bu hücrelerde viral proteinlerin ekspresyonu klasik immün hücre içi tarafından belirlenir. 8 detay akım sitometri ile transkripsiyonel bastırma ölçmek için bir yöntem ile 5 arasındaki adımları ise, 4 ayrıntılı floresan mikroskobu ile transkripsiyonel bastırma görselleştirmek için bir yöntem adım 1. Bu protokol, diğer virüsler ile kullanıma kolaylıkla adapte edilebilir.

RVFV bölgesinin NSS proteini (Bunyaviridae ailesi, cins Phlebovirus) 11 iki ayrı mekanizma ile konak hücre genel transkripsiyon inhibe eder: (i) kenetleme ile P62 arasında proteozomal degradasyonu teşvik, bazal transkripsiyon faktörü TFIIH 11 ve (ii) bir p44 alt birimi TFIIH 6 alt birimi. MP-12 suşu bir biyogüvenlik düzeyi 2 laboratuarda ele alınabilir ve diğer vahşi geçerlidir ABD&#39;de seçim aracı kural, dışında olduğundan RVFV MP-12 aşı suşu <...

Watch this Scientific Journal Video about Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis at JoVE.com

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Bu yöntem, Rift Valley vebası virüsü (RVFV) suşu, MP-12 ile enfeksiyon sonrası konakçı hücre transkripsiyon değişiklikleri ölçmek tıkırtı kimya kullanımı açıklanmaktadır. Sonuçlar floresan mikroskobu ile nitel görüntülendi veya akım sitometri ile kantitatif elde edilebilir. Bu yöntem, diğer virüs ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ana-Hücre RNA sentezi üzerinde Viral Enfeksiyon Etkisi Tedbir tıklayın Kimya Kullanımı

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

using-click-chemistry-to-measure-effect-viral-infection-on-host-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Görüntüleme.  University of Texas Medical Branch. Bu yöntem, Rift Valley vebası virüsü (RVFV) suşu, MP-12 ile enfeksiyon sonrası konakçı hücre transkripsiyon değişiklikleri ölçmek tıkırtı kimya kullanımı açıklanmaktadır. Sonuçlar floresan mikroskobu ile nitel görüntülendi veya akım sitometri ile kantitatif elde edilebilir. Bu yöntem, diğer virüs ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Video: Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Biyokimya

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Reverse Genetics to Engineer Positive-Sense RNA Virus Variants

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA viruses. By integrating a full RNA genome error-prone PCR and reverse genetics, random genome-wide substitution mutagenesis can be induced. We have developed a method using this technique to synthesize diverse libraries to identify viral mutants with phenotypes of interest. This method, called full-length mutant RNA synthesis (FL-MRS), offers the following advantages: (i) the ability to create a large library via a highly efficient one-step error-prone PCR; (ii) the ability to create groups of libraries with varying levels of genetic diversity by manipulating the fidelity of DNA polymerase; (iii) the creation of a full-length PCR product that can directly serve as a template for mutant RNA synthesis; and (iv) the ability to create RNA that can be delivered into host cells as a non-selected input pool to screen for viral mutants of the desired phenotype. We have found, using a reverse genetics approach, that FL-MRS is a reliable tool to study viral-directed evolution at all stages in the life cycle of the hepatitis C virus, JFH1 isolate. This technique appears to be an invaluable tool to employ directed evolution to understand adaptation, replication, and the role of viral genes in pathogenesis and antiviral resistance in positive-sense RNA viruses.

The protocol describes a method for introducing controllable genetic diversity in the hepatitis C virus genome by combining full-length mutant RNA synthesis using error-prone PCR and reverse genetics. The method provides a model for phenotype selection and can be used for 10 kb long positive-sense RNA virus genomes.

Pozitif Anlamlı RNA Virüsü Varyantlarını Tasarlamak için Tersine Genetik

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA ...

Genetik

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and assay development in virology. The RNA template of nonsegmented negative-sense (NNS) RNA viruses, such as the respiratory syncytial virus (RSV), is not an RNA molecule alone but rather a nucleoprotein (N) encapsidated ribonucleoprotein complex. Despite the importance of the authentic RNA template, the generation and assembly of such a ribonucleoprotein complex remain sophisticated and require in-depth elucidation. The main challenge is that the overexpressed RSV N binds non-specifically to cellular RNAs to form random nucleocapsid-like particles (NCLPs). Here, we established a protocol to obtain RNA-free N (N0) first by co-expressing N with a chaperone phosphoprotein (P), then assembling N0 with RNA oligos with the RSV-specific RNA sequence to obtain virus-specific nucleocapsids (NCs). This protocol shows how to overcome the difficulty in the preparation of this traditionally challenging viral ribonucleoprotein complex.

For in-depth mechanistic analysis of the respiratory syncytial virus (RSV) RNA synthesis, we report a protocol of utilizing the chaperone phosphoprotein (P) for coexpression of the RNA-free nucleoprotein (N0) for subsequent in vitro assembly of the virus-specific nucleocapsids (NCs).

Solunum Sinsitial Virüsünün Virüse Özgü Nükleopapsidlerinin Üretimi ve Montajı

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...