Yazar li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz ve Clayton Hall'a bu makalenin editoryal yardımı için teşekkür eder. Bu test ilk olarak Dartmouth'taki Geisel Tıp Fakültesi George O'Toole'un laboratuvarında geliştirilmiştir. Dr. Mah'un laboratuvarındaki araştırmalar, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi ve Kistik Fibrozis Kanada'nın hibeleriyle desteklenmektedir.

1. MBC-B
<ol><li>
Bir biyofilm yetiştirmek (O'Toole 9'danuyarlanmıştır).
	<ol>
<li>37 °C'de zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ilgi ve mutant suşu kültürünü büyütün.</li>
		<li>Doymuş gece kültürlerini 1:100 antibiyotik direnci tahlilleri için taze ortama seyreltin. P. aeruginosa için standart bir ortam, magnezyum sülfat ve arginin ile desteklenmiş M63 minimal ortadır (bkz. Tablo 1). Bu ortam daha sağlam bir biyofilm oluşumunu uyarır.</li>
		<li>96 kuyulu bir mikrotiter kabına kuyu başına 100 μl seyreltme ekleyin (bkz. Tablo 1). Bu tahliller tipik olarak her suş için üç taraflı olarak yapıldığı için, her suşun 24 kuyusu olmalıdır.</li>
		<li>Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Önceden biçimlendirilmiş biyofilmin bir konsantrasyon gradyan antibiyotikine maruz getirilmesi
	<ol>
<li>7 kuyu için 10x seyreltme antibiyotik serisi hazırlayın. Örnek: antibiyotik tobramycin için, kuyulardaki son konsantrasyonlar 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 ve 0.006 mg/ml 5-8'dir. 25 mg/ml'lik bir stoktan 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 ve 0,06 mg/ml'lik 10x seyreltmeler hazırlayın. Buzun üzerinde bırak.</li>
		<li>Harcanan süpernatant (planktonik hücreler içeren) çok kanallı pipet kullanarak çıkarın (bkz. Tablo 1).</li>
		<li>Tüm kuyulara 90 μl M63 (Mg/Arg) ekleyin.</li>
		<li>İstenilen son konsantrasyonları elde etmek için her 10x antibiyotik konsantrasyonunun 10 μl'sini ekleyin. Her çoğaltma ve gerinim için son kuyuya 10 μl su (antibiyotik kontrolü yok) ekleyin.</li>
		<li>Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ortamı yenilemek ve canlı hücrelerin birliğine izin vermek.
	<ol>
<li>Harcanan süpernatant (planktonik hücreler içeren) çok kanallı pipet kullanarak çıkarın.</li>
		<li>Tüm kuyulara 115 μl M63 (Mg/Arg) ekleyin.</li>
		<li>Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Canlı hücreler için test.
	<ol>
<li>96 kuyulu mikroter plaka başına iki LB agar plakası etiketle.</li>
		<li>Uçları % 100 etanol içine batırarak ve uçları bir Bunsen brülörünün açık alevinden geçirerek çok ürünlü cihazı sterilize edin (bkz. Tablo 1). yinelemek. Uçları hafifçe soğumaya bırakın. Çok yönlü cihazı kullanarak, mikrotiter plakanın her kuyusundan lb agar plakasının yüzeyine planktonik kültürün ~3 μl'yi (tipik olarak uçlarda tutulan miktar) aktarın.</li>
		<li>LB agar plakalarını 37 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Bakteri üremesi için kesileni gözle tanımlayarak antibiyotiğin minimum bakterisidal konsantrasyonunu belirleyin (Şekil 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MBC-P
<ol><li>
Bakteri suşlarının hazırlanması
	<ol>
<li>37 °C'de zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ilgi ve mutant suşu kültürünü büyütün.</li>
		<li>Doymuş gece kültürlerini 1:100 antibiyotik direnci tahlilleri için taze ortama seyreltin. P. aeruginosa için standart bir ortam, magnezyum sülfat ve arginin ile desteklenmiş M63 minimal ortadır (bkz. Tablo 1).</li>
		<li>96 kuyulu bir mikrotiter kabına kuyu başına 90 μl seyreltme ekleyin (bkz. Tablo 1). Bu tahliller tipik olarak her suş için üç taraflı olarak yapıldığı için, her suşun 24 kuyusu olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Planktonik hücreleri antibiyotik konsantrasyon gradyanine maruz kalma
	<ol>
<li>7 kuyu için 10x seyreltme antibiyotik serisi hazırlayın. Örnek: Antibiyotik tobramycin için kuyulardaki son konsantrasyonlar 0.032, 0.016, 0.008, 0.004, 0.002, 0.001 ve 0.0005 mg/ml'dir. 25 mg/ml'lik bir stoktan 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 ve 0,005 mg/ml'lik seyreltmeler hazırlayın. Buzun üzerinde bırak.</li>
		<li>İstenilen son konsantrasyonları elde etmek için her 10x antibiyotik konsantrasyonunun 10 μl'sini ekleyin. Her çoğaltma ve gerinim için son kuyuya 10 μl su (antibiyotik kontrolü yok) ekleyin.</li>
		<li>Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Canlı hücreler için test.
	<ol>
<li>96 kuyulu mikroter plaka başına iki LB agar plakası etiketle.</li>
		<li>Uçları % 100 etanol içine batırarak ve uçları bir Bunsen brülörünün açık alevinden geçirerek çok ürünlü cihazı sterilize edin (bkz. Tablo 1). yinelemek. Uçları hafifçe soğumaya bırakın. Çok yönlü cihazı kullanarak, mikrotiter plakanın her kuyusundan lb agar plakasının yüzeyine planktonik kültürün ~3 μl'yi (tipik olarak uçlarda tutulan miktar) aktarın.</li>
		<li>LB agar plakalarını 37 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Bakteri üremesi için kesileni gözle tanımlayarak antibiyotiğin minimum bakterisidal konsantrasyonunu belirleyin (Şekil 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics.">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li><li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance.">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene,+ndvB,+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms.">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells.">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+Analyzing+Static+Biofilms.">Growing and Analyzing Static Biofilms.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li><li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1.+Growing+and+analyzing+biofilms+in+fermenters.">Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li></ol>

Yazar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan eder.

Planktonik hücrelerde antibiyotik direnci, hücrelerde kalıcı bir değişiklik (örneğin bir mutasyon) nedeniyle bir antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunda (MIC) bir artış olaraktanımlanır. Bugüne kadar tanımlanan biyofilme özgü direnç veya tolerans mekanizmaları, biyofilmler içindeki vahşi tip genlerin ekspresyonunun sonucudur. Bu nedenle, klasik direnç tanımı biyofilmler için geçerli değildir. Bununla birlikte, başka bir tanım kümesi sunulmuştur: direnç mekanizmaları an...

Antibiyotik direnci tahlilleri başlangıçta planktonik (serbest yüzme) bakteri kültürlerinin direncini test etmek için geliştirilmiştir. Birçok bakteriyel enfeksiyon biyofilmleri (yüzeye bağlı hücreler) içerdiğinden, biyofilme özgü antibiyotik direncini test etmek için bir yöntem geliştirmekle ilgileniyorduk. Bununla birlikte, antibiyotik direnci testlerinin çoğu biyofilmlerin direncini ölçmek için uygun değildir. Örneğin, minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) belirlenmesi, planktonik bakteri kültürlerinin antibiyotik direncini belirlemek için altın standarttır 1. Bu test, seyreltilmiş bir planktonik kültürün bir seyreltme antibiyotik serisi ile karıştırılmasını gerektirir.  Planktonik hücrelerin görünür büyümesini engelleyen antibiyotik konsantrasyonu MIC'dir. Bu test büyümenin inhibisyonunu dayandığından, tanım olarak, önceden büyümüş bir biyofilmdeki hücrelerin antibiyotik duyarlılığını incelemeyi gerektiren biyofilm kültürleriyle çalışamaz. Burada açıklanan MBC-B tahlili, büyüme inhibisyonunu ölçmek yerine, bir biyofilmde zaten var olan hücreleri öldüren antibiyotik konsantrasyonunu belirler. Bu nedenle, bu test yerleşik biyofilm enfeksiyonlarının antibiyotik tedavilerini taklit etmeyi ve bakteriyelantibiyotik direncinin vivo daha alakalı bir görünümünü sağlamayı amaçlamaktadır.
Biyofilmler genellikle planktonik kültürlerden daha antibiyotik dirençli olduğundan 2-4 Bir biyofilmin antibiyotik direncini planktonik bir kültürünkiyle doğrudan ilişkilendiren bir yöntem tasarlamak gerekiyordu. Bu nedenle, bu yöntemin bir diğer amacı, planktonik ve biyofilm hücreleri arasındaki antibiyotik direnci seviyesini doğrudan karşılaştırabilmektir. Burada açıklanan MBC-P ve MBC-B tahlilleri bunu mümkün kilmektedir çünkü hücreler benzer koşullar altında kültürlenir. Biyofilme özgü antibiyotik direnci için önemli olan birkaç geni incelemek için bu yöntemi kullandık 5-8 .

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			1x&#160;M63
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare as a 5x&#160;M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.&#160; Dilute 5x&#160;stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			KH2PO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P285-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			K2HPO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P288-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			(NH4)2SO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5132
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Magnesium sulfate
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			M63-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 1 mM final concentration.&#160; Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tobramycin
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare 50 mg/m&#160;stock. Aliquot and store at -20&#176;C.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Arginine
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5131
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 0.4% final concentration.&#160; Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.&#160; This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			96-well microtiter plates
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Corning
			</td>
			<td style="width:160px;">
			3595
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sterile, flat-bottom, low evaporation
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tranferpette (multichannel pipette)
			</td>
			<td style="width:160px;">
			BrandTech
			</td>
			<td style="width:160px;">
			2703610
			</td>
			<td style="width:160px;">
			8-channel, 20-200 &#956;l
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Multiprong device
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Dan-Kar
			</td>
			<td style="width:160px;">
			MC48
			</td>
			<td style="width:160px;">
			48 prongs fit into &#189; of a 96-well microtiter plate
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)

Bu protokol, bir biyofilm in vitrooluşturabilen bakteriyel bir suş için planktonik ve biyofilm direnci arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. Bakteriler 96 kuyulu bir mikroter plakanın kuyularına aşılanır. Planktonik test durumunda, tercih ettiği antimikrobiyal ajanın seri seyreltmeleri bakteriyel süspansiyonlara eklenir. Biyofilm testinde, aşılandıktan sonra, bakteriler belirli bir süre boyunca bir biyofilm oluşturmak için bırakılır. Eklenmemiş hücreler kuyulardan çıkarılır, ortam yenilenir ve tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmeleri eklenir. Antimikrobiyal ajana maruz kaldıktan sonra, planktonik hücreler büyüme için test edilir. Biyofilm tahlili için, medya antimikrobiyal ajandan yoksun taze medya ile yenilenir ve biyofilm hücreleri iyileşmeye bırakılır. Biyofilm hücre canlılığı iyileşme döneminden sonra test edilir. Antimikrobiyal ajan için MBC-P, planktonik kültürdeki hücreleri öldüren en düşük ilaç konsantrasyonu olarak tanımlanır.  Buna karşılık, bir suş için MBC-B, önceden biçimlendirilmiş biyofilmlerin 24 saat boyunca artan antimikrobiyal ajan konsantrasyonlarına maruz kalarak belirlenir. MBC-B, biyofilmdeki hücreleri öldüren en düşük antimikrobiyal ajan konsantrasyonu olarak tanımlanır.

PA14 vahşi tipinin hassasiyetini PA14 ∆ndvBile karşılaştıran MBC-P ve MBC-B tahlilleri gerçekleştirildi. Antibiyotik olarak tobramycin kullanıldı. Adım 1.4.4 (Şekil 1) ve adım 2.3.4 (Şekil 2) 'ye karşılık gelen sonuçlar sunulmuştur. PA14 ve ∆ndvB üç taraflı olarak MBC-P ve MBC-B testlerine aşılandı. MBC-B protokolünün 1.0-1.4 ve MBC-P protokolünün 2.0-2.3. Hücrelerin solunda tobramycin(μ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B at JoVE.com

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B

Bu protokol, 96 kuyulu bir mikrotiter plaka kullanarak biyofilm in vitro oluşturabilen bakteriyel bir suş için planktonik ve biyofilm direnci arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. Planktonik veya biyofilm bakterileri, tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmelerine maruz kalır. Canlılık, agar plakalarındaki büyüme ile test edilir.

Planktonik Hücreler (MBC-P) ve Biyofilm Hücreleri (MBC-B) için Bir Antimikrobiyal Ajanın Minimal Bakterisidal Konsantrasyonunun Oluşturulması

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

establishing-minimal-bactericidal-concentration-an-antimicrobial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

19.8K Görüntüleme.  University of Ottawa. Bu protokol, 96 kuyulu bir mikrotiter plaka kullanarak biyofilm in vitro oluşturabilen bakteriyel bir suş için planktonik ve biyofilm direnci arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. Planktonik veya biyofilm bakterileri, tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmelerine maruz kalır. Canlılık, agar plakalarındaki büyüme ile test edilir.