Yardımları için Homaira Nawabi, Frederic Moret ve Isabelle Sanyas'a teşekkür ederiz. Bu çalışma CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA to V.C. C.D-B ve A.J, sırasıyla La Ligue contre le cancer ve Labex DevWeCan bursları tarafından desteklenmektedir.

1. PleksinA1 Reseptörü pHluorin ile Etiketlemek için Klonlama Stratejisi
<ol><li>Omurga olarak uygun bir ifade vektörü seçin(örneğin, fare reseptör pleksistiA1 ifade vektörü, Dr. Andreas Puschel11'inbir tür hediyesi). Not: Bu pleksinA1 vektörü, plazma membranında verimli HA veya VSV etiketli reseptör yerleştirmesi elde etmek için tasarlanmıştır.</li>
	<li>PCR tarafından, şablon olarak yeterli plazmid kullanarak ekliptik pHluorin kodlama dizisini güçlendirin(örneğin pHluorin etiketli GABA A reseptörü, Dr. Jacob2'ninbir tür hediyesi). Gerekirse, omurgadaki klonlama adımını kolaylaştırmak için astarın 5' ucuna bir kısıtlama bölgesi ekleyin.</li>
	<li>pHluorin dizisini, kısıtlama sitelerini kullanarak sinyal peptidi ile reseptör kodlama sırası arasına çerçeveye ekleyin(örneğin, Şekil 1B'deaçıklandığı gibi NruI/Kpn2I kısıtlama siteleri). Not: Reseptörlerin doğru hedeflanmasını sağlayan sinyal peptidi bölündüğünden, pHluorin bunun üzerine yerleştirilmelidir. Bu, sinyal peptidinin tanınmasını garanti eder ve pHluorin'in ilgi çekiciden bölünmesini önler.</li>
	<li>PCR tarafından herhangi bir mutasyona uğramamasını sağlamak için elde edilen yapıları sıralayın.</li>
</ol>2. COS7 Hücrelerinde pHluorin Etiketli Reseptör In vitro karakterizasyonu
Füzyon proteininin plazma zarı ilebilme yeteneği ve pH düşürüldükçe geri dönüşümlü floresan kaybı aşağıdaki prosedür kullanılarak doğrulanabilir.
<ol><li>1. Gün. Plaka 1.5 x 105 COS7 hücreleri cam tabanlı 35 mm'lik bir tabakta 2 ml tam Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM - % 10 Fetal Sığır Serumu - 1 mM sodyum piruvat - 25 U/ml penisilin/stretomisin - 2,5 μg/ml Amfoterisin B - pH 7,4).</li>
	<li>2. Gün. Hücreleri transfect: Not: Hücreler %70-80 bir arada olmalıdır.<ol>
<li>200 μl NaCl 150 mM hazırlayın ve 3 μg DNA ekleyin, yani vektör kodlama pHluorin etiketli reseptör. Yavaşça girdap ve kısa bir süre aşağı döndürün. Not: Bu deneylerde kullanılan pHluorin-pleksinA1 vektörün haritası Şekil 1B'de gösterilmiştir.</li>
		<li>10 μl transfeksiyon reaktifi (veya kullanılan reaktifin uygun miktarını) ekleyin. Vortex hemen.</li>
		<li>RT'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>Hücrelere 200 μl transfeksiyon reaktifi/DNA karışımı ekleyin.</li>
		<li>Karışımın yeniden bölümlenmesini sağlamak için plakayı hafifçe hareket ettinin ve hücreleri 37 °C inkübatöre geri yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3. gün. Transfeksiyon ortamını çıkarın ve 2 ml taze komple DMEM ile değiştirin.</li>
	<li>4. gün. COS7 pHluorin-pleksinA1 transfected hücrelerinin canlı hücre görüntülemesini gerçekleştirin:<ol>
<li>İki aliquots DMEM komple orta hazırlayın ve pH'ı sırasıyla 3,5 ve 9,5'e ayarlayın. Not: Bir 35 mm plaka için, deneyi gerçekleştirmek için her çözeltinin 1,5 ml'si gereklidir.</li>
		<li>Hücre ortamını çıkarın ve 1 ml DMEM komple orta pH 7.4 ile değiştirin.</li>
		<li>Mikroskop odasını açmadan çeşitli bileşenleri doğrudan hücre kültürü ortamına enjekte etmek için uygun bir boru tipine sahip 5 ml'lik bir şırınga hazırlayın.</li>
		<li>37 °C, %5 CO2 nemli çalışma atmosferinin bakımına izin veren bir modül kullanın. Not: CO2 odasının kullanımına alternatif bir yaklaşım HEPES tamponlu ortam kullanmaktır (genellikle hücre tipine göre 10-25 mM aralığında).</li>
		<li>Hücreleri odaya yerleştirin ve boruyu ve şırınnayı ayarlayın. Not: Kayıt sırasında mekanik sürüklenmeyi önlemeye başlamadan önce mikroskop dengelenmelidir.</li>
		<li>Görüntüleme yazılımını açın ve çok boyutlu alım programını seçin.</li>
		<li>40X hedefine sahip transfected COS7 hücrelerini bulun ve her biri için yazılımdaki konumunu işaretleyin.</li>
		<li>Z yığınını 15 μm derinlik alımına sahip olacak şekilde yapılandırın (plakaya ortam eklerken odak değişebilir).</li>
		<li>GFP filtresi ve Faz için pozlamayı ayarlayın.</li>
		<li>Edinme zamanlamasını yapılandırın. Not: 5 ilgi alanı olan tüm deney için, 10 dakika boyunca her 20 saniyede bir alım yeterli olmalıdır.</li>
		<li>Satın almaya başlayın ve DMEM pH 7.4 ortamında 5 kontrol görüntüsü alın.</li>
		<li>Satın almayı duraklatın, kültür ortamında 5,5 pH elde etmek için 1,25 ml pH 3,5 komple DMEM enjekte edin, yazılımda olayı işaretleyin ve 5 daha fazla zaman puanı için edinimi sürdürin. Not: Yeşil floresan giderek kaybolmalıdır.</li>
		<li>Satın almayı duraklatın, kültür ortamında bir pH 7.4 elde etmek için 1.2 ml pH 9.5 komple DMEM enjekte edin, yazılımda olayı işaretleyin ve 5 zaman puanı daha almaya devam edin. Not: Yeşil floresan plazma zarında tekrar ortayalanmalıdır.</li>
		<li>Görüntüleri analiz edin. Şekil 2, pHluorin-pleksinA1 yapısı ile böyle bir protokolle elde edilen temsili görüntüleri göstermektedir.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. pHluorin-pleksinA1 Yapısı ovo Elektroporasyon içinde
<ol><li>Elektroporasyondan önce yumurtaların işlenmesi:<ol>
<li>Döllenmiş yumurtaları kuluçkadan bir hafta öncesine kadar 14 °C'de bir buzdolabında saklayın.</li>
		<li>Embriyolar HH14 12 aşamasına ulaşana kadar 50-52 saat doymuş neme sahip bir inkübatörde 38,5 °C'de(101,3°F) yumurta kuluçkaya yatırın. Not: Yumurtalar kuluçka sırasında yatay olarak yerleştirilmelidir, böylece embriyo elektroporasyon için uygun şekilde konumlandırılmalı ve sarısının üstünde yüzmelidir. HH14 evresi, omurilikteki farklılaşmış nöronlarda ve dorsal kök ganglionunda plazmidlerin uygun sağkalım oranı ile ekspresyonunun ifadesini elde etmek için uygundur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektroporat embriyoları8-10:<ol>
<li>Elektroporasyon hazırlayın:<ol>
<li>İstenilen konsantrasyon olarak seyreltebilmek için 2 μg/μl'den daha yüksek konsantrasyona sahip endotoksin içermeyen DNA plazmidleri hazırlayın.</li>
			<li>Farklı DNA çözeltilerini enjekte etmek için yeterli cam kılcal damarı çekin.</li>
			<li>Steril PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penisilin/streptomisinin hazırlayın ve 38,5 °C'de dengeyi sağla.</li>
			<li>Kaputu, kavisli makası ve ince asaları sterilize edin.</li>
			<li>Elektrot aralığını kontrol edin. Not: Elektrotlar arasında genellikle 4 mm'lik bir boşluk kullanılır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pencere yumurta13 (Şekil 3A):<ol>
<li>Yumurtanın kör tarafındaki kabuğu delmek için kavisli makas kullanın.</li>
			<li>0,9 mm x 25 mm iğne ve 5 ml şırınga kullanarak 2 ml albümen çıkarın. Yumurta sarısı kesesine zarar vermemek için iğneyi dikey olarak yönlendirin.</li>
			<li>Kabuğun bütünlüğünü korumak için yumurtanın üstünü bantla örtün.</li>
			<li>Kavisli makas kullanarak, yumurtadan 2 ml albümen çıkarırken basıncı eşitlemek için bandın ortasındaki kabuğu delin. Daha sonra, embriyoyu görselleştirecek ve üzerinde çalışabilecek kadar büyük bir pencere kesin.</li>
			<li>Embriyonun susuz kalmamasını önlemek ve manipülatör için daha erişilebilir hale getirmek için~2ml steril sıcak PBS (-Ca 2+ ; -Mg2+) - 100 U/ml penisilin/streptomisilin ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>DNA enjekte edin ve embriyoyu elektroporat edin<ol>
<li>PBS'de plazmid (-Ca2+; -Mg2+) 0,5-2 μg/μl arasında bir konsantrasyonda seyreltin ve son % 0,025 konsantrasyona ulaşmak için Hızlı yeşil boya ekleyin. DNA karışımını kılcal damara yükleyin. Bir enjektör kullanılması önerilir. Not: Kılcal damar direncinin ne çok büyük (embriyo enjekte ederken zorluklar olabileceği anlamına gelir) ne de çok küçük (kılcal damarın çok büyük olabileceği ve embriyoya zarar verebileceği anlamına gelir) olduğunu kontrol edin. Ayrıca, 2 μg/μl'den yüksek nükleik asitlerin konsantrasyonu spesifik olmayan etkilere neden olabilir ve kontrol edilmesi gerekir.</li>
			<li>Sarnıç kesesini ve kaudal taraftaki sinir tüpünü yüklü kılcal damarla delin. Sinir tüpünü sığ bir açıyla girin ve lümeni kuyruktan başa DNA karışımı ile doldurun (Şekil 3B). Not: Hızlı yeşil, enjeksiyonun doğruluğunu kontrol etmeyi sağlar.</li>
			<li>4 mm platin elektrotları sinir tüpünün her iki tarafına elektroporat vermek istediğiniz seviyeye hızla yerleştirin ve 50 msec aralıklarla 50 msec için 31 V'ta 3 darbe uygulayın (Şekil 3C). Not: Gelişmekte olan embriyoya zarar vermemek için elektrotları kalbe veya büyük ekstra embriyonik damarlara yerleştirmekten kaçının. Elektrotlarda kabarcıklar oluşmalıdır.</li>
			<li>İğne ile kabuktaki seviyeyi azaltmak için 2 ml albümen çıkarın.</li>
			<li>Pencereyi ve künt tarafı bantla hermetik olarak kapatın.</li>
			<li>Yumurtaları istenen aşamaya gelene kadar inkübatöre 38,5 °C'de geri koyun.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Embriyoların Gömülmesi ve Kriyoseksiyon
<ol><li>Elektroporasyondan 48 saat sonra, elektroporlu embriyoları dikkatlice hasat edin (HH24 aşaması). Bandı ve koryovantoid zarın yarısını kesin. Embriyoların yumurta sarısına batmasını önlemek için embriyonun altına bir kevgir yerleştirin ve koryallantoid zarın ikinci yarısını kesin.</li>
	<li>Embriyoyu buz gibi PBS ile dolu bir diseksiyon kabına aktarın.</li>
	<li>Floresan stereo mikroskop ile nöral tüpte floresan arayarak elektroporasyon verimliliğini kontrol edin. Not: RFP'yi kodlayan bir kontrol plazmidinin koelektroporasyonu elektroporlu alanın görselleştirilmesine yardımcı olabilir.</li>
	<li>Omuriliğin elektropore bölgesini seçmek için embriyoları bir mikroskalpel kullanarak parçalara ayrıştırın.</li>
	<li>Parçalanmış embriyoları 24 kuyulu bir tabağa aktarın ve pH%7,4 4 Paraformaldehit (PFA) - Fosfat Tampon Salin (PBS), 4 °C'de O/N'de sabitlenin. Not: Fiksasyon adımı, pHluorin'in "canlı" konformasyonunda stabilizasyonuna izin vermek ve böylece sabit /permeabilize dokuda pHluorin kullanabilmek için çok önemlidir. Fiksasyon, floresanların pH'a bağlı değişimini büyük ölçüde yavaşlatsa da, fiksasyondan sonra konformasyon/protonasyon değişikliklerinin hala gerçekleşebileceğini dikkate almak gerekir. Bu nedenle, aşağıdaki protokol (gömme, kriyoseksiyon ve gözlem) sabitleme adımından sonraki 3 gün içinde, tüm tamponlar pH 7'de olacak şekilde yapılmalıdır. Fiksasyon gerekli değilse, canlı doku bölümlerinde gözlem yapılması önerilir.</li>
	<li>%4 PFA'yı çıkarın ve embriyoları pH 7.4 PBS'de yıkayın.</li>
	<li>PBS-% 15 sakkarozda embriyoları kuluçkaya yatırın ve embriyolar batana kadar 4 °C'de tutun.</li>
	<li>Sabit embriyoları pH 7.4%7.5 jelatin- %15 sakkarozda 37 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırarak embriyolar tamamen gömülür.</li>
	<li>Yerleştirme kalıplarını buza yerleştirin ve sağlam bir 2 mm taban elde etmek için 400 μl pH 7.4% 7.5 jelatin -% 15 sakkaroz ekleyin.</li>
	<li>Gömülü embriyoyu kesik uçla aspire edin ve embriyoyu katı jelatin tabanına yerleştirin.</li>
	<li>pH 7.4% 7.5 jelatin - % 15 sakkaroz ile örtün ve jelatin katılaştırılmadan önce embriyoyups ile konumlandırın.</li>
	<li>Jelatin katılaştıktan sonra, -40 °C izopropanol banyosu hazırlayın (kuru buz veya sıvı azot kullanın) ve jelatin bloğunu 5 dakika dondurun.</li>
	<li>Donmuş blokları -80 °C'de tutun.</li>
	<li>Donmuş bloğu 1 saat boyunca -20 °C'ye yerleştirin.</li>
	<li>Kalıbı çıkarın ve bloğu polietilen glikol ortamına sahip bir aynaya sabitleyin.</li>
	<li>Blok sıkıca sabitlendikten sonra, mandreni kriyostat sistemine yerleştirin. Not: Boyama sırasında doku kaybını önlemek için kaplamalı kaydıraklar kullanın.</li>
	<li>Seri kriyoseksiyonlar gerçekleştirin (genellikle 20 μm kriyoseksiyonlar gerçekleştirilir).</li>
	<li>Rt'de kriyoseksiyonların 15 dakika kurumasına izin verin. Not: GFP floresanının ağartılmasını önlemek için kriyoseksiyonlar gereksiz ışığa maruz kalmaktan korunmalıdır.</li>
</ol>5. Kriyoseksiyonların Mikroskobik Analizi
<ol><li>RT'de pH 7.4 PBS'de kriyoseksiyonları 10 dakika boyunca yeniden sulatır. Not: Gerekirse, çekirdek Hoechst ile boyanabilir.</li>
	<li>PBS'de 0,5 μg/ml Hoechst çözeltisi kullanın ve kriyoseksiyonları 15 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Slaytları 5 dakika boyunca pH 7,4 PBS ile 3x durulayın.</li>
	<li>Slayt montajına devam edin. O/N'yi sertleyen bir pH 7.4 (veya daha temel) polivinil alkol montaj çözeltisi kullanılabilir: slayt ve kapak arasında hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için kapak kapağını dikkatlice yerleştirin.</li>
	<li>Montaj ortamının karanlıkta 4 °C'de O/N sertleşmesine izin verin.</li>
	<li>pHluorin-pleksinA1 füzyon proteinini hassas bir şekilde görselleştirmek için ters konfokal mikroskop kullanın: en uygun iğne deliği ve optik çözünürlükte z-stack gerçekleştirin ve 20X (NA 0.75) veya 40X (NA 1.3) lens kullanın. Not: pHluorin, GFP'yi (yani 509 nm'deki emisyon zirvesini) tespit etmek için kullanılan parametrelerle tespitedilebilir. Dalga boyu ekscitasyon ve algılama filtresi ayarları görüntüleme yazılımı tarafından en iyi şekilde tanımlanır. Hoechst 425-460 nm (ekscitasyon 405 nm'de), GFP veya pHluorin 485-54 arasında tespit edilir 5 nm (ekscitasyon 473 nm'de) ve RFP 575-675 nm arasında saptanır (heyecan 559 nm'dedir).</li>
</ol>Civciv embriyosu omuriliğinde pHluorin-pleksinA1 ve eGFP ekspresyonunun temsili görüntüleri Şekil 4'tegösterilmiştir.

<ol>
	<li>Winckler, B., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+guidance+receptors.">Trafficking guidance receptors.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li><li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).</li><li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system:+how+to+cross+the+midline.">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li><li>Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comm+function+in+commissural+axon+guidance:+cell-autonomous+sorting+of+Robo+in+vivo.">Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).</li><li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates.">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapto-pHluorins:+genetically+encoded+reporters+of+synaptic+transmission.">Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).</li><li>Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+axonal+pathways+of+genetically+defined+groups+of+neurons+in+the+chick+neural+tube+utilizing+in+ovo+electroporation.">Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation.</a> J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos.">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), (2007).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+of+miRNA-based+plasmids+in+the+developing+neural+tube+and+assessment+of+phenotypes+by+DiI+injection+in+open-book+preparations.">In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li><li>Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin/neuropilin+complexes+mediate+repulsion+by+the+axonal+guidance+signal+semaphorin+3A.">Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A.</a> Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J. Vis. Exp. (8), (2007).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+actin+control+polarized+expression+of+TI-VAMP+vesicles+to+neuronal+growth+cones+and+their+fusion+with+the+plasma+membrane.">Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+endosomes:+how+many+varieties+and+why.">Evolving endosomes: how many varieties and why.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li><li>Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+clathrin-mediated+endocytosis+drives+repulsive+growth+cone+guidance.">Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance.</a> Neuron. 66, 370-377 (2010).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).</li><li>Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+role+for+synaptojanin+1+in+rod+and+cone+photoreceptors.">Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors.</a> J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).</li><li>Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+local+circuits+and+their+implications+for+olfactory+processing+in+the+fly+antennal+lobe.">Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe.</a> Cell. 128, 601-612 (2007).</li><li>Dittman, J. S., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+regulating+the+abundance+and+localization+of+synaptobrevin+in+the+plasma+membrane.">Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).</li><li>Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+neuronal+activity+by+targeted+expression+of+a+genetically+encoded+probe+in+the+mouse.">In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse.</a> Neuron. 42, 9-21 (2004).</li><li>Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+vesicle-SNARE+recycling+in+synapses+of+the+central+nervous+system.">Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system.</a> Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).</li><li>Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+cell+labeling+for+cell+tracing+in+avian+development.">Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development.</a> CSH Protoc.. 2008, (2008).</li><li>Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+variants+as+ratiometric+dual+emission+pH+sensors.+1.+Structural+characterization+and+preliminary+application.">Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application.</a> Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).</li><li>Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+refinement+of+vesicle+cycling+at+schaffer+collateral+synapses.">Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses.</a> Neuron. 77, 1109-1121 (2013).</li><li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pHTomato,+a+red,+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity.">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).</li><li>de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, hem hücre kültüründe hem de civciv embriyo omuriliğinin gelişimsel bağlamında bir akson kılavuz reseptörü dinamiklerini takip etmek için adım adım bir prosedür sağlar.
Bir de novo pHluorin etiketli protein tasarlamak için klonlama stratejisi ile ilgili iki noktanın göz önünde bulundurulması gerekir. İlk olarak, pHluorin etiketi, plazma membran reseptör havuzunu görselleştirmek için asidik endozomların lümenine ve dolayısıyla hücre dışı b...

Navigasyonları sırasında, aksonlar onları hedeflerine yönlendiren birden fazla çevresel ipucu entegre eder. Bu ipuçları, axon terminallerinin yüzeyindeki kılavuz reseptörlerini, büyüme konilerini aktive eder ve bu da uygun bir sinyal yolu başlatır. Bu nedenle, reseptörlerin hücre yüzey dağılımının zamansal ve mekansal regülasyonu, büyüme konisinin hassasiyetini ayarlamak için kritik öneme sahiptir1. Bu bağlamda, kommissural aksonlar tarafından orta çizgi geçişi, reseptör hücre yüzey seviyelerinin düzenlenmesini araştırmak için mükemmel bir modeldir. Gelişen omurilikte, kommissural aksonlar başlangıçta orta çizgiyi geçtikleri ventral zemin plakasına doğru çekilir. Geçtikten sonra, zemin plakası çekicilerine yanıtlarını kaybederler ve zemin plakası kovuculara yanıt kazanırlar, böylece zemin plakasından çıkabilirler ve sinir sisteminin karşıt tarafında son hedeflerine doğru gidebilirler2,3. Büyüme konisi yüzeyinde reseptör kullanılabilirliğinin düzenlenmesi, yanıt vermenin orta hat ipuçlarına geçişinin altında kalan mekanizmalardan biridir4,5. Bu nedenle, büyüme konilerinin plazma zarında bulunan reseptörlerin seçici izlenmesi birincil öneme sahiptir. Burada, gelişmekte olan civciv omuriliğinde plazma zarı in vitro ve in vivoyahitap eden akson kılavuz reseptörlerini özellikle görselleştirmek için yeşil bir floresan protein (GFP) varyantının pH'a bağımlı floresan özelliğine dayanan bir yöntemi açıklıyoruz.
Rothman ve meslektaşları, ekliptik pHluorin 6 da dahil olmak üzere GFP'nin nokta mutasyonları pH'a duyarlı varyantları tarafındantasarlanmıştır. Ekliptik pHluorin, asidik pH'a (<6) maruz kaldığında, nötr pH'da floresan iken, nonfluorescent olma özelliğine sahiptir. Bu, hücre içi asidik bölmelerde lokalize olan nonfluoresan reseptörlerin(yani endozomlar, kaçakçılık veziklinleri) plazma membranına dahil edilen floresan reseptörlerden ayırt etmesine ve böylece hücre dışı nötr pH7'yemaruz kalmalarına izin verir. Orta hat kovucu semaforin 3B5'e (Şekil 1A)büyüme konisi tepkisine aracılık eden bir akson kılavuz reseptörü olan pleksinA1'in plazma membran lokalizasyonunu izlemek için bundan yararlandık. Burada, gelişmekte olan civciv omuriliğinde bu yapının8-10 no'luk ovo elektroporasyonunun yanı sıra bir pHluorin-pleksinA1 yapının in vitro karakterizasyonunu ve ardından hem mekansal hem de zamansal çözünürlüklerle akson kılavuz reseptör dinamiklerini in vivo olarak takip etmeyi sağlayan kriyoseksiyonların mikroskobik analizini açıklıyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1007">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">COS7 cells</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:219px;">CRL-1651</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">DMEM GlutaMAX</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:264px;">Exgen500 reagent</td>
			<td style="width:147px;">Euromedex Fermentas</td>
			<td style="width:219px;">ET0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">PBS -Ca2+ -Mg2+</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fast green dye</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">32% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscopy</td>
			<td style="width:219px;">15714-S</td>
			<td>Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryomount</td>
			<td style="width:147px;">Histolab</td>
			<td style="width:219px;">00890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Hoechst 34580</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:219px;">H21486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:219px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Bottom-glass 35 mm dish</td>
			<td style="width:147px;">MatTek</td>
			<td style="width:219px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">5 ml Syringe</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">SS-05S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Needles 0.9 mm x 25 mm</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">NN-2025R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Capillaries</td>
			<td style="width:147px;">CML</td>
			<td style="width:219px;">PP230PO</td>
			<td>capillaries are stretched manually in the flame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4951PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Microscalpel</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">10316-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">Dumont #5 REF#11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Equipment/software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Time lapse microscope</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:219px;">Observer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Temp module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">CO2 module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:147px;">Metamorph</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Eggs incubator</td>
			<td style="width:147px;">Sanyo</td>
			<td style="width:219px;">MIR154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electroporator apparatus</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electrodes</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY611P7-4</td>
			<td>4 mm platinum electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td style="width:147px;">LEICA</td>
			<td style="width:219px;">MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryostat</td>
			<td style="width:147px;">MICROM</td>
			<td style="width:219px;">HM550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;">FV1000, X81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluoview software</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CLC Main Workbench software</td>
			<td style="width:147px;">CLC Bio</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of phluorin to assess the dynamics of axon guidance receptors in cell culture and in the chick embryo

Geliştirme sırasında, akson kılavuz reseptörleri, aksonların hem çekici hem de itici ipuçlarına duyarlılığını düzenlemede çok önemli bir rol oynar. Gerçekten de, kılavuz reseptörlerinin aktivasyonu, akson uçlarının, büyüme konilerinin ligandlara yanıt vermesine izin veren sinyal mekanizmalarının ilk adımıdır. Bu nedenle, hücre yüzeyindeki kullanılabilirliklerinin modülasyonu, büyüme konisi duyarlılığının ayarlanmasına katılan mekanizmalardan biridir. Burada, gelişmekte olan civciv omurilikte hem in vitro hem de in vivo bir akson kılavuz reseptörün mekansal-zamansal hücre yüzey dinamiklerini tam olarak görselleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Plazma zarına hitap eden akson kılavuz reseptörünün fraksiyonunu özellikle tespit etmek için yeşil floresan protein (GFP) varyantının pH'a bağımlı floresan özelliğinden yararlandık. İlk olarak bu tür pH'a bağımlı yapıların in vitro doğrulamasını açıklıyoruz ve akson kılavuz reseptörün mekansal-zamansal dinamiklerini değerlendirmek için in vivo, civciv omurilik akorunda kullanımlarını daha ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1.jpg"> Şekil 1. A. Hücresel bağlamda pHluorin-pleksinA1 floresan özelliklerinin şeması. PHluorin, pH'ın kaçakçılık veziküllerinde veya endozomlarda olduğu gibi asidik (<6) olduğu hücre içi bölmelerde ve pH'ın nötr olduğu hücre dışı ortama maruz kaldığında floresan değildir. Bu, pHluorin-...

Watch this Scientific Journal Video about Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo at JoVE.com

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Hücre yüzeyindeki akson kılavuz reseptörlerinin mekansal-zamansal dinamiklerini incelemek için pH'a duyarlı yeşil floresan protein varyantı pHluorin'in kullanımını burada açıklıyoruz. pHluorin etiketli reseptör hem hücre kültüründe hem de in vivoolarak ifade edilir Civciv embriyosunun elektroporasyonunu kullanarak.

Hücre Kültüründe ve Civciv Embriyosunda Akson Kılavuz Reseptörlerinin Dinamiklerini Değerlendirmek için pHluorin Kullanımı

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

use-phluorin-to-assess-dynamics-axon-guidance-receptors-cell-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Görüntüleme.  University of Lyon. Hücre yüzeyindeki akson kılavuz reseptörlerinin mekansal-zamansal dinamiklerini incelemek için pH'a duyarlı yeşil floresan protein varyantı pHluorin'in kullanımını burada açıklıyoruz. pHluorin etiketli reseptör hem hücre kültüründe hem de in vivoolarak ifade edilir Civciv embriyosunun elektroporasyonunu kullanarak.

Video: Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Nörobilim

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

Hipokampal disfonksiyon Fetal alkol spektrum bozuklukları, fare modeli değerlendirmek için izleme Eyeblink Klasik koşullanma kullanımı

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

Axon İlk Segmentlerinin Montajını İncelemek için Birincil Kültürlü Hipokampal Nöronların Kullanımı

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Chick Ciliary Ganglion Nöronların İzolasyon ve Kültür

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...