ونشكر هوميرا نوابي وفريدريك موريت وإيزابيل سانياس على مساعدتهم. ويدعم هذا العمل من قبل CNRS، جمعية فرانسيز contre ليه Myopathies (AFM)، ANR YADDLE، لابيكس DevWeCan، لابكس القشرة، ERC يودا إلى V.C. يتم دعم C.D-B و A.J من قبل La Ligue contre le cancer وزمالات Labex DevWeCan على التوالي.

1. استراتيجية الاستنساخ إلى علامة مستقبلات PlexinA1 مع pHluorin
<ol><li>اختيار ناقل التعبير المناسب باعتباره العمود الفقري(على سبيل المثال مستقبلات الماوس plexinA1 التعبير عن ناقلات، هدية نوع من الدكتور أندرياس Puschel11). ملاحظة: تم تصميم هذا المتجه plexinA1 لتحقيق كفاءة HA- أو VSV الموسومة مستقبلات الإدراج في غشاء البلازما.</li>
	<li>تضخيم بواسطة PCR تسلسل الترميز pHluorin ecliptic باستخدام البلازميد كافية كقالب (على سبيل المثال pHluorin الموسومة GABA A مستقبلات, هدية نوع من الدكتور يعقوب2). إذا لزم الأمر، إضافة موقع تقييد إلى نهاية 5 من التمهيدي من أجل تسهيل خطوة الاستنساخ في العمود الفقري.</li>
	<li>إدراج تسلسل pHluorin في إطار بين الببتيد إشارة وتسلسل الترميز مستقبلات باستخدام مواقع تقييد(على سبيل المثال NruI/Kpn2I مواقع تقييد كما هو موضح في الشكل 1B). ملاحظة: لأن الببتيد إشارة يضمن هو مشقوق الاستهداف الصحيح للمستقبلات، وينبغي وضع pHluorin بعد ذلك. وهذا يبرر الاعتراف الببتيد إشارة ويمنع انشقاق من pHluorin من مستقبلات الفائدة.</li>
	<li>تسلسل البنى التي تم الحصول عليها لضمان عدم إدخال أي طفرة من قبل PCR.</li>
</ol>2. توصيف مستقبلات pHluorin الموسومة في المختبر في خلايا COS7
يمكن تأكيد قدرة بروتين الانصهار للوصول إلى غشاء البلازما وفقدانه القابل للعكس للفلورسينس مع خفض درجة الحموضة باستخدام الإجراء التالي.
<ol><li>اليوم الأول. لوحة 1.5 × 105 خلايا COS7 في طبق 35 ملم الزجاج القاع في 2 مل من كامل Dulbecco تعديل النسر المتوسط (DMEM - 10٪ مصل البقر الجنيني - 1 mM الصوديوم بيروفات - 25 U/ml البنسلين / السترومايسين - 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B - pH 7.4).</li>
	<li>اليوم الثاني. خلايا العدوى: ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا التقاء 70-80٪.<ol>
<li>إعداد 200 ميكرولتر NaCl 150 mM وإضافة 3 ميكروغرام DNA أي مستقبلات ترميز المتجهات الموسومة بالهلوورين. دوامة بلطف وتدور لفترة وجيزة. ملاحظة: تظهر خريطة لمتجه pHluorin-plexinA1 المستخدم في هذه التجارب في الشكل 1B.</li>
		<li>إضافة 10 ميكرولتر من كاشف العدوى (أو الكمية المناسبة من الكاشف المستخدم). دوامة على الفور.</li>
		<li>احتضان 10 دقيقة في RT.</li>
		<li>إضافة 200 ميكرولتر من خليط الكاشف/ الحمض النووي إلى الخلايا.</li>
		<li>حرك اللوحة برفق لتحقيق إعادة تقسيم المزيج ووضع الخلايا مرة أخرى إلى حاضنة 37 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>اليوم الثالث. إزالة متوسطة transfection واستبداله 2 مل من DMEM كاملة جديدة.</li>
	<li>اليوم الرابع إجراء تصوير حي للخلايا من الخلايا المصابة COS7 pHluorin-plexinA1:<ol>
<li>إعداد اثنين من aliquots من متوسطة كاملة DMEM وضبط درجة الحموضة إلى 3.5 و 9.5، على التوالي. ملاحظة: بالنسبة إلى لوحة واحدة مقاس 35 مم، يلزم 1.5 مل من كل محلول لإجراء التجربة.</li>
		<li>إزالة الخلية المتوسطة واستبدالها 1 مل من DMEM كاملة متوسطة الحموضة 7.4.</li>
		<li>إعداد حقنة 5 مل مع نوع مناسب من الأنابيب من أجل حقن مكونات مختلفة مباشرة في وسط ثقافة الخلية دون فتح غرفة المجهر.</li>
		<li>استخدم وحدة تسمح بصيانة جو عمل رطب 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. ملاحظة: هناك نهج بديل لاستخدامغرفة ثاني أكسيد الكربون هو استخدام وسيطة ذات تخزين مؤقت HEPES (عادة في نطاق 10-25 mM وفقا لنوع الخلية).</li>
		<li>ضع الخلايا في الحجرة وضبط الأنابيب والمحقنة. ملاحظة: يجب أن يكون المجهر متساويا قبل البدء في تجنب الانجراف الميكانيكي أثناء التسجيل.</li>
		<li>افتح برنامج التصوير وحدد برنامج الاستحواذ متعدد الأبعاد.</li>
		<li>العثور على خلايا COS7 المصابة مع الهدف 40X ووضع علامة في البرنامج لكل واحد منهم.</li>
		<li>تكوين مكدس Z من أجل الحصول على عمق 15 ميكرومتر (يمكن أن يتغير التركيز عند إضافة وسائط في اللوحة).</li>
		<li>إعداد التعريض الضوئي لمرشح GFP والمرحلة.</li>
		<li>تكوين توقيت الاستحواذ. ملاحظة: للتجربة بأكملها مع 5 مجالات الاهتمام، واقتناء كل 20 ثانية لمدة 10 دقيقة ينبغي أن تكون كافية.</li>
		<li>ابدأ عملية الاستحواذ واضبط 5 صور تحكم في درجة الحموضة DMEM 7.4 متوسطة.</li>
		<li>وقفة الاستحواذ، وحقن 1.25 مل من درجة الحموضة 3.5 DMEM كاملة لتحقيق درجة الحموضة من 5.5 في وسط الثقافة، بمناسبة الحدث في البرنامج واستئناف الاستحواذ على 5 نقاط زمنية أخرى. ملاحظة: يجب أن تختفي الفلورسينس الخضراء تدريجيا.</li>
		<li>وقفة اقتناء، وحقن 1.2 مل من درجة الحموضة 9.5 DMEM كاملة لتحقيق درجة الحموضة 7.4 في وسط الثقافة، بمناسبة الحدث في البرنامج واستئناف الاستحواذ على 5 نقاط زمنية أخرى. ملاحظة: يجب أن يظهر الفلورسينس الأخضر مرة أخرى في غشاء البلازما.</li>
		<li>تحليل الصور. ويبين الشكل 2 الصور التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول من هذا القبيل مع بناء pHluorin-plexinA1.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. في أوفو الكهربائية من pHluorin-plexinA1 بناء
<ol><li>التعامل مع البيض قبل الكهرومporation:<ol>
<li>تخزين البيض المخصب في الثلاجة في 14 درجة مئوية حتى أسبوع واحد قبل الحضانة.</li>
		<li>احتضان البويضات عند 38.5 درجة مئوية (101.3 درجة فهرنهايت) في حاضنة ذات رطوبة مشبعة لمدة 50-52 ساعة حتى تصل الأجنة إلى المرحلة HH1412. ملاحظة: يجب وضع البويضات أفقيا أثناء الحضانة بحيث يتم وضع الجنين بشكل صحيح للكهرومporation ، العائمة على الجزء العلوي من الصفار. HH14 المرحلة مناسبة للحصول على التعبير عن البلازميدات في الخلايا العصبية المتمايزة في الحبل الشوكي وفي العقدة الجذر الظهري مع معدل البقاء على قيد الحياة المناسبة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الأجنة الكهربائية8-10:<ol>
<li>إعداد الكهرومبورات:<ol>
<li>إعداد البلازميدات الحمض النووي خالية من السموم الداخلية مع تركيز متفوقة على 2 ميكروغرام / ميكرولتر، لتكون قادرة على تمييعه كما التركيز المطلوب.</li>
			<li>سحب ما يكفي من الشعيرات الدموية الزجاجية لحقن حلول الحمض النووي المختلفة.</li>
			<li>إعداد برنامج تلفزيوني معقم (-Ca2+؛ -Mg2+) - 100 U/ml البنسلين/الستربتومايسين والاعتدال عند 38.5 درجة مئوية.</li>
			<li>تعقيم غطاء محرك السيارة، مقص منحني والمملقط الدقيق.</li>
			<li>التحكم في تباعد القطب الكهربائي. ملاحظة: يتم استخدام مسافة 4 مم بين الأقطاب الكهربائية بشكل عام.</li>
		</ol>
</li>
		<li>نافذة البيض13 (الشكل 3A):<ol>
<li>استخدام مقص منحني لثقب قذيفة على الجانب الحاد من البيض.</li>
			<li>إزالة 2 مل من الألبومين باستخدام إبرة 0.9 ملم × 25 ملم وحقنة 5 مل. توجيه الإبرة عموديا من أجل تجنب إتلاف كيس صفار.</li>
			<li>تغطية الجزء العلوي من البيض مع الشريط للحفاظ على سلامة قذيفة.</li>
			<li>باستخدام مقص منحني، اخترق قذيفة في منتصف الشريط لتحقيق المساواة في الضغط عند إزالة 2 مل من الألبومين من البيض. ثم، قطع نافذة كبيرة بما يكفي لتصور الجنين وتكون قادرة على العمل على ذلك.</li>
			<li>إضافة ~ 2 مل عقيمة برنامج تلفزيوني دافئ (-Ca2+؛ -Mg2+) - 100 U/ml البنسلين / streptomycin لتجنب جفاف الجنين وجعله أكثر سهولة للمتلاعب.</li>
		</ol>
</li>
		<li>حقن الحمض النووي و electroporate الجنين<ol>
<li>تمييع البلازميد في برنامج تلفزيوني (-Ca2+; -Mg2+) إلى تركيز بين 0.5-2 ميكروغرام / ميكرول وإضافة صبغة خضراء سريعة للوصول إلى تركيز نهائي 0.025٪. قم بتحميل مزيج الحمض النووي في الشعرية. ينصح باستخدام حاقن. ملاحظة: تحقق من أن مقاومة الشعرية ليست كبيرة جدا (مما يعني أنه قد تكون هناك صعوبات عند حقن الأجنة) ولا صغيرة جدا (مما يعني أن الشعرية يمكن أن تكون كبيرة جدا ويمكن أن تلحق الضرر بالجنين). أيضا، تركيز الأحماض النووية أعلى من 2 ميكروغرام / ميكرولتر قد يسبب آثار غير محددة ويحتاج إلى السيطرة عليها.</li>
			<li>ثقب كيس الصفار والإنبوب العصبي في الجانب caudal مع الشعيرات الدموية المحملة. أدخل الأنبوب العصبي بزاوية ضحلة وملء التجويف من الذيل إلى الرأس بمزيج الحمض النووي(الشكل 3B). ملاحظة: يسمح اللون الأخضر السريع بالتحكم في دقة الحقن.</li>
			<li>بسرعة وضع أقطاب البلاتين 4 ملم على جانبي الأنبوب العصبي في المستوى الذي ترغب في electroporate وتطبيق 3 نبضات في 31 V لمدة 50 msec مع فترات 500 msec (الشكل 3C). ملاحظة: تجنب وضع الأقطاب الكهربائية على القلب أو على الأوعية الجنينية الإضافية الكبيرة لتجنب إتلاف الجنين النامي. يجب أن تتشكل الفقاعات على الأقطاب الكهربائية.</li>
			<li>مع الإبرة، وإزالة 2 مل من الألبومين لتقليل مستوى في قذيفة.</li>
			<li>ختم النافذة والجانب حادة بإحكام مع الشريط.</li>
			<li>ضع البيض مرة أخرى عند 38.5 درجة مئوية في الحاضنة حتى تصل إلى المرحلة المطلوبة.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. تضمين الأجنة والتبريد
<ol><li>48 ساعة بعد الكهرومporation، حصاد الأجنة الكهربائية بعناية (مرحلة HH24). قطع الشريط ونصف من غشاء المشيمية. لمنع الأجنة من الغرق في صفار، وضع مصفاة تحت الجنين وقطع النصف الثاني من غشاء chorioallantoid.</li>
	<li>نقل الجنين إلى طبق تشريح مليئة الجليد البارد PBS.</li>
	<li>تحقق من كفاءة الكهرومporation من خلال البحث عن الفلورسينس في الأنبوب العصبي مع مجهر ستيريو مضان. ملاحظة: قد يساعد الكهروضوئية من بلازميد التحكم ترميز RFP لتصور المنطقة electroporated.</li>
	<li>تشريح الأجنة باستخدام ميكروسكالبيل من أجل تحديد المنطقة الكهربية من الحبل الشوكي.</li>
	<li>نقل الأجنة تشريح إلى لوحة 24 جيدا وإصلاح في درجة الحموضة 7.4٪ بارافورمالديهايد (PFA) - الفوسفات العازلة المالحة (PBS)، O / N في 4 درجة مئوية. ملاحظة: خطوة التثبيت أمر بالغ الأهمية للسماح بتثبيت pHluorin في تشكيل "العيش" ، وبالتالي لتكون قادرة على استخدام pHluorin في الأنسجة الثابتة / permeabilized. على الرغم من أن التثبيت يبطئ التغيير المعتمد على الرقم الهيدروجيني بشكل كبير في الفلورسينس ، يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار أن التغيرات التوافقية / البروتونات لا تزال تحدث بعد التثبيت. وهكذا، يجب تنفيذ البروتوكول التالي (تضمين و cryosections و المراقبة) في غضون 3 أيام بعد خطوة التثبيت، مع كافة المخازن المؤقتة في 7 pH. إذا لم يكن التثبيت مطلوبا ، يوصى بإجراء مراقبة على أقسام الأنسجة الحية.</li>
	<li>إزالة 4٪ PFA وغسل الأجنة في pH 7.4 PBS.</li>
	<li>احتضان الأجنة في برنامج تلفزيوني-15٪ السكروز والحفاظ على 4 درجة مئوية حتى تغرق الأجنة.</li>
	<li>احتضان الأجنة الثابتة في درجة الحموضة 7.4 7.5٪ الجيلاتين- 15٪ السكروز لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية حتى يتم تضمين الأجنة تماما.</li>
	<li>وضع قوالب تضمين على الجليد وإضافة 400 ميكروغرام من درجة الحموضة 7.4 7.5٪ الجيلاتين- 15٪ السكروز لتحقيق قاعدة صلبة 2 ملم.</li>
	<li>يستنشق الجنين المضمن بطرف مقطوع ووضع الجنين على قاعدة الجيلاتين الصلبة.</li>
	<li>تغطية مع pH 7.4 7.5٪ الجيلاتين- 15٪ السكروز ووضع الجنين مع ملقط قبل الجيلاتين يقوي.</li>
	<li>مرة واحدة الجيلاتين الصلبة، وإعداد -40 درجة مئوية حمام ايزوبروبانول (استخدام الثلج الجاف أو النيتروجين السائل) وتجميد كتلة الجيلاتين لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>إبقاء الكتل المجمدة عند -80 درجة مئوية.</li>
	<li>ضع الكتلة المجمدة عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.</li>
	<li>إزالة القالب وإصلاح كتلة على تشاك مع متوسط غليكول البولي ايثيلين.</li>
	<li>مرة واحدة يتم إصلاح كتلة بإحكام، ووضع تشاك في نظام cryostat. ملاحظة: استخدم الشرائح المغلفة لتجنب فقدان الأنسجة أثناء التلطيخ.</li>
	<li>إجراء عمليات بكاء تسلسلية (عادة ما يتم إجراء عمليات 20 ميكرومترا من عمليات التبريد).</li>
	<li>دع عمليات التبريد تجف لمدة 15 دقيقة في RT. ملاحظة: يجب حماية عمليات الشفط بالتبريد من التعرض للضوء غير الضروري لتجنب تبييض مضان GFP.</li>
</ol>5. التحليل المجهري للكريوزات
<ol><li>إعادة ترطيب cryosections في رقم الحموضة 7.4 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن تكون ملطخة نواة مع Hoechst.</li>
	<li>استخدام محلول Hoechst 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني واحتضان cryosections لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>شطف الشرائح 3x مع pH 7.4 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>انتقل إلى تصاعد الانزلاق. يمكن استخدام محلول تركيب الكحول البولي فينيل 7.4 (أو أكثر أساسية) الذي يصلب O / N: ضع غطاء الغطاء بعناية لتجنب تكوين فقاعات الهواء بين الشريحة والأغطية.</li>
	<li>السماح للتصاعد المتوسطة تصلب O / N في 4 درجة مئوية في الظلام.</li>
	<li>استخدم مجهرا كونفوكوكال مقلوبا لتصور بروتين الاندماج pHluorin-plexinA1 بدقة: قم بإجراء z-stack عند الثقب الأمثل والدقة البصرية واستخدم عدسات 20X (NA 0.75) أو 40X (NA 1.3). ملاحظة: يمكن اكتشاف الهولورين بنفس المعلمات المستخدمة للكشف عن GFP(أي ذروة الانبعاثات عند 509 نانومتر). يتم تعريف إعدادات الإثارة الموجية ومرشح الكشف بشكل مثالي من خلال برنامج التصوير. يتم الكشف عن Hoechst بين 425-460 نانومتر (الإثارة في 405 نانومتر), يتم الكشف عن GFP أو pHluorin بين 485-545 نانومتر (الإثارة في 473 نانومتر) ويتم الكشف عن RFP بين 575-675 نانومتر (الإثارة في 559 نانومتر).</li>
</ol>وتظهر الصور التمثيلية لpHluorin-plexinA1 والتعبير eGFP في الحبل الشوكي الجنين فرخ في الشكل 4.

<ol>
	<li>Winckler, B., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+guidance+receptors.">Trafficking guidance receptors.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li><li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).</li><li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system:+how+to+cross+the+midline.">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li><li>Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comm+function+in+commissural+axon+guidance:+cell-autonomous+sorting+of+Robo+in+vivo.">Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).</li><li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates.">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapto-pHluorins:+genetically+encoded+reporters+of+synaptic+transmission.">Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).</li><li>Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+axonal+pathways+of+genetically+defined+groups+of+neurons+in+the+chick+neural+tube+utilizing+in+ovo+electroporation.">Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation.</a> J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos.">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), (2007).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+of+miRNA-based+plasmids+in+the+developing+neural+tube+and+assessment+of+phenotypes+by+DiI+injection+in+open-book+preparations.">In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li><li>Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin/neuropilin+complexes+mediate+repulsion+by+the+axonal+guidance+signal+semaphorin+3A.">Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A.</a> Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J. Vis. Exp. (8), (2007).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+actin+control+polarized+expression+of+TI-VAMP+vesicles+to+neuronal+growth+cones+and+their+fusion+with+the+plasma+membrane.">Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+endosomes:+how+many+varieties+and+why.">Evolving endosomes: how many varieties and why.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li><li>Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+clathrin-mediated+endocytosis+drives+repulsive+growth+cone+guidance.">Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance.</a> Neuron. 66, 370-377 (2010).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).</li><li>Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+role+for+synaptojanin+1+in+rod+and+cone+photoreceptors.">Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors.</a> J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).</li><li>Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+local+circuits+and+their+implications+for+olfactory+processing+in+the+fly+antennal+lobe.">Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe.</a> Cell. 128, 601-612 (2007).</li><li>Dittman, J. S., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+regulating+the+abundance+and+localization+of+synaptobrevin+in+the+plasma+membrane.">Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).</li><li>Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+neuronal+activity+by+targeted+expression+of+a+genetically+encoded+probe+in+the+mouse.">In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse.</a> Neuron. 42, 9-21 (2004).</li><li>Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+vesicle-SNARE+recycling+in+synapses+of+the+central+nervous+system.">Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system.</a> Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).</li><li>Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+cell+labeling+for+cell+tracing+in+avian+development.">Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development.</a> CSH Protoc.. 2008, (2008).</li><li>Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+variants+as+ratiometric+dual+emission+pH+sensors.+1.+Structural+characterization+and+preliminary+application.">Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application.</a> Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).</li><li>Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+refinement+of+vesicle+cycling+at+schaffer+collateral+synapses.">Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses.</a> Neuron. 77, 1109-1121 (2013).</li><li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pHTomato,+a+red,+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity.">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).</li><li>de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لمتابعة ديناميكيات مستقبلات توجيه المحور في كل من زراعة الخلايا وفي السياق التنموي للنخاع الشوكي للجنين الفرخ.
لتصميم بروتين دي نوفو pHluorin الموسومة، هناك نقطتين تحتاج إلى النظر فيما يتعلق باستراتيجية الاستنساخ. أولا، يجب أن تتعرض ?...

أثناء الملاحة، تدمج المحاور إشارات بيئية متعددة توجهها نحو هدفها. هذه الإشارات تنشيط مستقبلات التوجيه على سطح محطات المحور، والمخاريط النمو، والتي بدورها بدء مسار الإشارات المناسبة. وهكذا، فإن التنظيم الزمني والمكاني لتوزيع سطح الخلية من المستقبلات أمر بالغ الأهمية لضبطحساسية مخروطالنمو 1 . في هذا السياق، عبور خط الوسط بواسطة محاور المحور commissural هو نموذج ممتاز للتحقيق في تنظيم مستويات سطح الخلية مستقبلات. في الحبل الشوكي النامي ، تنجذب المحاور المفوضة في البداية نحو لوحة الأرضية البطنية حيث تعبر خط الوسط. بعد العبور ، يفقدون استجابتهم لمجذبات لوحة الأرضية ويكتسبون استجابة لطاردات لوحة الأرضية حتى يتمكنوا من الخروج من لوحة الأرضية والتنقل نحو وجهتهم النهائية في الجانب المقابل من الجهاز العصبي2،3. تنظيم توافر مستقبلات على سطح مخروط النمو هي واحدة من الآليات الكامنة وراء التحول من الاستجابة إلى العظة خط الوسط4,5. وهكذا، الرصد الانتقائي للمستقبلات الموجودة في غشاء البلازما من المخاريط النمو هو من الأهمية بمكان. نحن نصف هنا طريقة تستند إلى خاصية الفلورية المعتمدة على الرقم الحموضة لمتغير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لتصور مستقبلات توجيه المحور المحوري التي يتم توجيهها إلى غشاء البلازما في المختبر وفي الجسم الحي، في الحبل الشوكي الفرخ النامي.
روثمان وزملاؤه هندستها نقطة الطفرات المتغيرات الحساسة لHP من GFP بما في ذلك pHluorin الكسوف6. PHluorin Ecliptic لديه خاصية كونها غير فلورية عندما تتعرض لhh الحمضية (<6)، في حين يجري الفلورسنت في درجة الحموضة محايدة. وهذا يسمح التمييز بين مستقبلات nonfluorescent المترجمة في المقصورات الحمضية داخل الخلايا(أي الاندوسومات، والاتجار الحويصلات) من مستقبلات الفلورسنت أدرجت في غشاء البلازما وبالتالي تتعرض لHH محايدة خارج الخلية7. لقد استفدنا من ذلك لمراقبة توطين غشاء البلازما من plexinA1 ، وهو مستقبل توجيه محور التوسط استجابة مخروط النمو لطارد خط الوسط سيمافورين 3B5 (الشكل 1A). نحن نصف هنا التوصيف المختبري لبناء pHluorin-plexinA1 ، جنبا إلى جنب مع في ovo electroporation8-10 من هذا البناء في الحبل الشوكي الفرخ النامية تليها التحليل المجهري للخلايا المبردة التي تمكن من اتباع ديناميات مستقبلات التوجيه المحوري في الجسم الحي مع كل من القرارات المكانية والزمنية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1007">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">COS7 cells</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:219px;">CRL-1651</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">DMEM GlutaMAX</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:264px;">Exgen500 reagent</td>
			<td style="width:147px;">Euromedex Fermentas</td>
			<td style="width:219px;">ET0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">PBS -Ca2+ -Mg2+</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fast green dye</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">32% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscopy</td>
			<td style="width:219px;">15714-S</td>
			<td>Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryomount</td>
			<td style="width:147px;">Histolab</td>
			<td style="width:219px;">00890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Hoechst 34580</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:219px;">H21486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:219px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Bottom-glass 35 mm dish</td>
			<td style="width:147px;">MatTek</td>
			<td style="width:219px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">5 ml Syringe</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">SS-05S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Needles 0.9 mm x 25 mm</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">NN-2025R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Capillaries</td>
			<td style="width:147px;">CML</td>
			<td style="width:219px;">PP230PO</td>
			<td>capillaries are stretched manually in the flame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4951PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Microscalpel</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">10316-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">Dumont #5 REF#11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Equipment/software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Time lapse microscope</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:219px;">Observer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Temp module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">CO2 module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:147px;">Metamorph</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Eggs incubator</td>
			<td style="width:147px;">Sanyo</td>
			<td style="width:219px;">MIR154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electroporator apparatus</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electrodes</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY611P7-4</td>
			<td>4 mm platinum electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td style="width:147px;">LEICA</td>
			<td style="width:219px;">MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryostat</td>
			<td style="width:147px;">MICROM</td>
			<td style="width:219px;">HM550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;">FV1000, X81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluoview software</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CLC Main Workbench software</td>
			<td style="width:147px;">CLC Bio</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of phluorin to assess the dynamics of axon guidance receptors in cell culture and in the chick embryo

أثناء التطوير ، تلعب مستقبلات التوجيه المحوري دورا حاسما في تنظيم حساسية المحاور للإشارات الجذابة والبغيضة على حد سواء. في الواقع ، تفعيل مستقبلات التوجيه هو الخطوة الأولى من آليات الإشارات التي تسمح نصائح المحور المحور ، والمخاريط النمو ، للرد على ligands. على هذا النحو، وتعديل توافرها على سطح الخلية هي واحدة من الآليات التي تشارك في وضع حساسية مخروط النمو. نحن نصف هنا طريقة لتصور بدقة ديناميات سطح الخلية الصدغية من مستقبلات التوجيه المحوري على حد سواء في المختبر وفي الجسم الحي في الحبل الشوكي الفرخ النامية. لقد استفدنا من خاصية الفلورية المعتمدة على الحموضة لمتغير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) للكشف على وجه التحديد عن جزء مستقبلات توجيه المحور الذي يتم توجيهه إلى غشاء البلازما. نحن أول وصف التحقق من صحة في المختبر من هذه البنى التي تعتمد على الحموضة ونحن مزيد من التفصيل استخدامها في الجسم الحي، في وتر العمود الفقري الفرخ ، لتقييم ديناميات spatio الزمنية لمستقبلات التوجيه المحورية من الفائدة.

<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1.jpg"> الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 أ. مخطط خصائص الفلورية pHluorin-plexinA1 في سياق خلوي. PHluorin غير فلوورسينت في المقصورات داخل الخلايا حيث درجة الحموضة حمضية (<6) مثل في الحويولات الاتجار ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo at JoVE.com

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

ونصف هنا استخدام متغير البروتين الفلوري الأخضر الحساس ل درجة الحموضة، وهو pHluorin، لدراسة الديناميات الزمانية للبصق لمستقبلات توجيه المحور العصبي التي تتاجر على سطح الخلية. يتم التعبير عن مستقبلات pHluorin الموسومة في كل من زراعة الخلايا وفي الجسم الحي، باستخدام الكهرومporation من جنين الفرخ.

استخدام pHluorin لتقييم ديناميات مستقبلات الإرشاد أكسون في زراعة الخلايا وفي الجنين الفرخ

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

use-phluorin-to-assess-dynamics-axon-guidance-receptors-cell-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Views.  University of Lyon. ونصف هنا استخدام متغير البروتين الفلوري الأخضر الحساس ل درجة الحموضة، وهو pHluorin، لدراسة الديناميات الزمانية للبصق لمستقبلات توجيه المحور العصبي التي تتاجر على سطح الخلية. يتم التعبير عن مستقبلات pHluorin الموسومة في كل من زراعة الخلايا وفي الجسم الحي، باستخد?...

Video: Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Electroporation من الدماغ المؤخر لتتبع مسارات محور عصبي والأهداف متشابك في الجنين الفرخ

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

استخدام الاشراط الكلاسيكي اييبلينك تتبع لتقييم هيبوكامبال الخلل في نموذج الفئران من اضطرابات طيف الكحول الجنيني

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

استخدام الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة الأولية لدراسة تجميع الأجزاء الأولية أكسون

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

العزلة والثقافة من الفرخ Ciliary الخلايا العصبية جانجليون

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...