Wir danken Homaira Nawabi, Frederic Moret und Isabelle Sanyas für ihre Hilfe. Diese Arbeit wird unterstützt von CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA bis V.C.; C.D-B und A.J werden von einem La Ligue contre le cancer bzw. Labex DevWeCan Stipendien unterstützt.

1. Cloning-Strategie zur Tag PlexinA1-Rezeptor mit pHluorin
<ol><li>Wählen Sie einen geeigneten Expressionsvektor als Rückgrat(z.B. der MausrezeptorplexinA1-Expressionsvektor, ein Freundliches Geschenk von Dr. Andreas Puschel11). Hinweis: Dieser PlexinA1-Vektor wurde entwickelt, um eine effiziente HA- oder VSV-markierte Rezeptor-Einfügung in die Plasmamembran zu erreichen.</li>
	<li>Amplify per PCR die ekliptische pHluorin-Codierungssequenz mit dem entsprechenden Plasmid als Vorlage(z.B. pHluorin-getaggter GABA-A-Rezeptor, ein Art Geschenk von Dr. Jacob2). Fügen Sie bei Bedarf eine Restriktionsstelle am 5' Ende des Primers hinzu, um den Klonschritt im Backbone zu erleichtern.</li>
	<li>Fügen Sie die pHluorin-Sequenz im Rahmen zwischen dem Signalpeptid und der Rezeptorcodierungssequenz mithilfe von Restriktionsstellen ein(z. B. NruI/Kpn2I-Restriktionsstellen, wie in Abbildung 1Bbeschrieben). Hinweis: Da das Signalpeptid, das die richtige Ausrichtung der Rezeptoren sicherstellt, gespaltet ist, sollte das pHluorin danach platziert werden. Dies rechtfertigt die Erkennung des Signalpeptids und verhindert eine Spaltung des pHluorins vom Rezeptor des Interesses.</li>
	<li>Sequenzieren Sie die erhaltenen Konstrukte, um sicherzustellen, dass keine Mutation durch PCR eingeführt wurde.</li>
</ol>2. Charakterisierung von pHluorin-getaggten Rezeptoren in vitro in COS7-Zellen
Die Fähigkeit des Fusionsproteins, die Plasmamembran zu erreichen, und sein reversibler Fluoreszenzverlust, wenn der pH-Wert gesenkt wird, können mit dem folgenden Verfahren bestätigt werden.
<ol><li>Tag 1. Platte 1,5 x 105 COS7-Zellen in einer glasunteren 35-mm-Schale in 2 ml komplettem Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM - 10% Fetal Bovine Serum - 1 mM Natriumpyruvat - 25 U/ml Penicillin/Stretomycin - 2,5 g/ml Amphotericin B - pH 7.4).</li>
	<li>Tag 2. Transfektien Zellen: Hinweis: Zellen sollten 70-80% konfluent sein.<ol>
<li>Bereiten Sie 200 l NaCl 150 mM vor und fügen Sie 3 g DNA, d.h. den vektorkodierenden pHluorin-getaggten Rezeptor hinzu. Sanft wirbeln und kurz nach unten drehen. Anmerkung: Eine Karte des in diesen Experimenten verwendeten pHluorin-plexinA1-Vektors ist in Abbildung 1Bdargestellt.</li>
		<li>Fügen Sie 10 l Transfektionsreagenz (oder die entsprechende Menge des verwendeten Reagenzes) hinzu. Wirbel sofort.</li>
		<li>10 min bei RT inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie den Zellen 200 l des Transfektionsreagenz/DNA-Mix hinzu.</li>
		<li>Bewegen Sie die Platte sanft, um eine Neuaufteilung der Mischung zu erreichen, und legen Sie die Zellen wieder auf den 37 °C-Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tag 3. Entfernen Sie das Transfektionsmedium und ersetzen Sie es durch 2 ml frisches komplettes DMEM.</li>
	<li>Tag 4. Durchführung einer Live-Zell-Bildgebung von COS7 pHluorin-plexinA1 transfizierten Zellen:<ol>
<li>Bereiten Sie zwei Aliquots des DMEM-Gesamtmediums vor und stellen Sie den pH-Wert auf 3,5 bzw. 9,5 ein. Hinweis: Für eine 35-mm-Platte werden 1,5 ml jeder Lösung benötigt, um das Experiment durchzuführen.</li>
		<li>Entfernen Sie das Zellmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml DMEM-Gesamtmedium pH 7.4.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 5 ml Spritze mit einem geeigneten Schlauchtyp vor, um verschiedene Komponenten direkt in das Zellkulturmedium zu injizieren, ohne die Mikroskopkammer zu öffnen.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Modul, das die Wartung einer 37 °C, 5%CO2 feuchten Arbeitsatmosphäre ermöglicht. Anmerkung: Ein alternativer Ansatz für die Verwendung einerCO2-Kammer ist die Verwendung von HEPES-gepufferten Medien (in der Regel im Bereich von 10-25 mM je nach Zelltyp).</li>
		<li>Legen Sie die Zellen in die Kammer und stellen Sie den Schlauch und die Spritze ein. Hinweis: Das Mikroskop sollte ausgeglichen werden, bevor es beginnt, mechanische Drift während der Aufnahme zu vermeiden.</li>
		<li>Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware, und wählen Sie das multidimensionale Erfassungsprogramm aus.</li>
		<li>Finden Sie transfizierte COS7-Zellen mit dem 40X-Objektiv und markieren Sie die Position in der Software für jede von ihnen.</li>
		<li>Konfigurieren Sie den Z-Stack so, dass eine Tiefenerfassung von 15 m erreicht wird (der Fokus kann sich beim Hinzufügen von Medien in der Platte ändern).</li>
		<li>Einrichten der Belichtung für den GFP-Filter und die Phase.</li>
		<li>Konfigurieren Sie das Erfassungstiming. Hinweis: Für das gesamte Experiment mit 5 Interessensgebieten sollte der Erwerb alle 20 Sek. für 10 min ausreichen.</li>
		<li>Starten Sie die Erfassung und nehmen Sie 5 Steuerbilder in DMEM pH 7.4 medium.</li>
		<li>Pause-Erfassung, injizieren 1,25 ml pH 3,5 komplette DMEM, um einen pH-Wert von 5,5 im Kulturmedium zu erreichen, markieren Ereignis in der Software und Wiederaufnahme der Erfassung für 5 weitere Zeitpunkte. Hinweis: Grüne Fluoreszenz sollte nach und nach verschwinden.</li>
		<li>Pause-Erfassung, injizieren 1,2 ml pH 9,5 komplette DMEM, um einen pH 7,4 im Kulturmedium zu erreichen, markieren Ereignis in der Software und Wiederaufnahme der Erfassung für 5 weitere Zeitpunkte. Hinweis: Grüne Fluoreszenz sollte an der Plasmamembran wieder auftauchen.</li>
		<li>Analysieren Sie Bilder. Abbildung 2 zeigt repräsentative Bilder, die mit einem solchen Protokoll mit dem pHluorin-plexinA1-Konstrukt erhalten wurden.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. In ovo Elektroporation von pHluorin-plexinA1 Konstrukt
<ol><li>Umgang mit Eiern vor der Elektroporation:<ol>
<li>Befruchtete Eier bis eine Woche vor der Inkubation bei 14 °C im Kühlschrank aufbewahren.</li>
		<li>Inkubieren Sie Eier bei 38,5 °C (101,3 °F) in einem Inkubator mit gesättigter Luftfeuchtigkeit für 50-52 stunden, bis die Embryonen das Stadium HH1412erreichen. Hinweis: Die Eier müssen während der Inkubation horizontal platziert werden, damit der Embryo für die Elektroporation richtig positioniert ist und auf der Oberseite des Dotters schwebt. DAS HH14-Stadium eignet sich zur Expression der Plasmide in differenzierten Neuronen im Rückenmark und im Dorsalwurzelganglimit mit einer angemessenen Überlebensrate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektroporate Embryonen8-10:<ol>
<li>Vorbereiten der Elektroporation:<ol>
<li>Bereiten Sie endotoxinfreie DNA-Plasmide mit einer Konzentration von mehr als 2 g/l vor, um sie als gewünschte Konzentration verdünnen zu können.</li>
			<li>Ziehen Sie genügend Glaskapillaren, um die verschiedenen DNA-Lösungen zu injizieren.</li>
			<li>Bereiten Sie steriles PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml Penicillin/Streptomycin und Gleichgewicht bei 38,5 °C vor.</li>
			<li>Sterilisieren Sie die Kapuze, gekrümmte Schere und feine Zange.</li>
			<li>Steuern Sie den Elektrodenabstand. Hinweis: Es wird in der Regel ein Abstand von 4 mm zwischen den Elektroden verwendet.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fenster das Ei13 (Abbildung 3A):<ol>
<li>Verwenden Sie eine gekrümmte Schere, um die Schale auf der stumpfen Seite des Eis zu durchbohren.</li>
			<li>2 ml Albumen mit einer 0,9 mm x 25 mm Nadel und einer 5 ml Spritze entfernen. Richten Sie die Nadel vertikal aus, um eine Beschädigung des Eigelbsacks zu vermeiden.</li>
			<li>Bedecken Sie die Oberseite des Eis mit Klebeband, um die Integrität der Schale zu erhalten.</li>
			<li>Mit einer gekrümmten Schere die Schale in der Mitte des Bandes durchstechen, um den Druck auszugleichen, wenn 2 ml Albumen aus dem Ei entfernt werden. Schneiden Sie dann ein Fenster, das groß genug ist, um den Embryo zu visualisieren und daran arbeiten zu können.</li>
			<li>Fügen Sie 2 ml sterile warme PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml Penicillin/Streptomycin hinzu, um eine Austrocknung des Embryos zu vermeiden und ihn dem Manipulator zugänglicher zu machen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>DNA injizieren und den Embryo elektropoatieren<ol>
<li>Verdünnung des Plasmids in PBS (-Ca2+; -Mg2+)auf eine Konzentration zwischen 0,5-2 g/l und schnelle grüne Farbstoffe hinzufügen, um eine endgültige 0,025% Konzentration zu erreichen. Laden Sie den DNA-Mix in eine Kapillare. Die Verwendung eines Injektors wird empfohlen. Anmerkung: Überprüfen Sie, ob die Kapillarresistenz weder zu groß (d. h. es könnte Schwierigkeiten bei der Injektion von Embryonen geben) noch zu klein ist (d. h., die Kapillare könnte zu groß sein und den Embryo beschädigen). Auch die Konzentration von Nukleinsäuren von mehr als 2 g/l kann unspezifische Wirkungen verursachen und muss kontrolliert werden.</li>
			<li>Punktieren Sie den Eigelbsack und das Neuralrohr an der kaudalen Seite mit der geladenen Kapillare. Betreten Sie das Neuralrohr mit einem flachen Winkel und füllen Sie das Lumen vom Schwanz bis zum Kopf mit dem DNA-Mix (Abbildung 3B). Hinweis: Schnelles Grün ermöglicht die Steuerung der Genauigkeit der Injektion.</li>
			<li>Stellen Sie die 4 mm Platinelektroden schnell auf beiden Seiten des Neuralrohrs auf die Ebene, die Sie elektroporatieren möchten, und wenden Sie 3 Impulse bei 31 V für 50 msec mit 500 msec Intervallen auf (Abbildung 3C). Hinweis: Vermeiden Sie es, die Elektroden auf das Herz oder auf große extra embryonale Gefäße zu legen, um eine Beschädigung des sich entwickelnden Embryos zu vermeiden. Blasen sollten sich auf den Elektroden bilden.</li>
			<li>Mit der Nadel, entfernen Sie 2 ml Albumen, um den Pegel in der Schale zu verringern.</li>
			<li>Versiegeln Sie das Fenster und die stumpfe Seite hermetisch mit Klebeband.</li>
			<li>Legen Sie die Eier wieder bei 38,5 °C in den Brutkasten, bis sie das gewünschte Stadium erreichen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Einbetten und Kryosektionen von Embryonen
<ol><li>48 Stunden nach Elektroporation, sorgfältig elektorierte Embryonen (HH24-Stadium) ernten. Schneiden Sie das Band und die Hälfte der Chorioallantoidmembran. Um zu verhindern, dass Embryonen im Eigelb versinken, positionieren Sie einen Kolander unter dem Embryo und schneiden Sie die zweite Hälfte der Chorioallantoidmembran.</li>
	<li>Übertragen Sie den Embryo in eine Mitesektionsschale gefüllte Mit eiskaltem PBS.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Elektroporationseffizienz, indem Sie mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop nach Fluoreszenz im Neuralrohr suchen. Hinweis : Die Koelektroporation eines Kontrollplasmids, das für das RFP kodiert, kann helfen, den elektroporated Bereich zu visualisieren.</li>
	<li>Sezieren Sie Embryonen mit einem Mikroskalpell, um den elektropoierten Bereich des Rückenmarks auszuwählen.</li>
	<li>Sezierte Embryonen auf eine 24-Well-Platte übertragen und in pH 7,4 4% Paraformaldehyd (PFA) - Phosphatpuffer-Saline (PBS), O/N bei 4 °C fixieren. Hinweis: Der Fixationsschritt ist entscheidend, um die Stabilisierung von pHluorin in seiner "lebenden" Konformation zu ermöglichen und somit pHluorin in festem/permeabilisiertem Gewebe verwenden zu können. Obwohl die Fixierung die pH-abhängige Fluoreszenzveränderung drastisch verlangsamt, muss berücksichtigt werden, dass Konformations-/Protonationsänderungen auch nach der Fixierung auftreten können. Daher muss das folgende Protokoll (Einbettung, Kryosektionen und Beobachtung) innerhalb von 3 Tagen nach dem Fixierungsschritt mit allen Puffern bei pH 7 durchgeführt werden. Wenn keine Fixierung erforderlich ist, wird die Durchführung von Beobachtungen an LebendenGewebeabschnitten empfohlen.</li>
	<li>4% PFA entfernen und Embryonen in pH 7,4 PBS waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Embryonen in PBS-15% Saccharose und halten Sie bei 4 °C, bis die Embryonen sinken.</li>
	<li>Inkubieren Sie feste Embryonen in pH 7,4 7,5% Gelatine - 15% Saccharose für 45 min bei 37 °C, so dass Embryonen vollständig eingebettet sind.</li>
	<li>Einbettformen auf Eis legen und 400 l pH 7,4 7,5% Gelatine - 15% Saccharose hinzufügen, um eine solide 2 mm Basis zu erreichen.</li>
	<li>Den eingebetteten Embryo mit einer geschnittenen Spitze ansaugen und den Embryo auf die feste Gelatinebasis legen.</li>
	<li>Abdeckung mit pH 7,4 7,5% Gelatine - 15% Saccharose und positionieren Sie den Embryo mit Zangen, bevor die Gelatine erstarrt.</li>
	<li>Sobald die Gelatine fest ist, bereiten Sie ein -40 °C Isopropanolbad (trockenes Eis oder flüssigen Stickstoff verwenden) und frieren Sie den Gelatineblock für 5 min ein.</li>
	<li>Halten Sie die gefrorenen Blöcke bei -80 °C.</li>
	<li>Legen Sie den gefrorenen Block 1 Std. auf -20 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie die Form und fixieren Sie den Block auf einem Futter mit einem Polyethylenglykolmedium.</li>
	<li>Sobald der Block fest befestigt ist, legen Sie das Futter in das Kryostatsystem. Hinweis: Verwenden Sie beschichtete Dias, um Gewebeverluste während der Färbung zu vermeiden.</li>
	<li>Führen Sie serielle Kryosektionen durch (in der Regel werden 20 m Kryosektionen durchgeführt).</li>
	<li>Lassen Sie die Kryosektionen 15 min bei RT trocknen. Hinweis: Kryosektionen sollten vor unnötiger Lichtexposition geschützt werden, um eine Bleichenung der GFP-Fluoreszenz zu vermeiden.</li>
</ol>5. Mikroskopische Analyse von Kryosektionen
<ol><li>Rehydrat-Kryosections in pH 7,4 PBS bei RT für 10 min. Hinweis: Bei Bedarf können Kerne mit Hoechst befleckt werden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 0,5-mm/ml-Hoechst-Lösung in PBS und inkubieren Sie Kryosektionen für 15 min.</li>
	<li>Spülen Sie die Dias 3x mit pH 7,4 PBS für 5 min.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Schiebemontage fort. Eine pH 7,4 (oder mehr grundlegende) Polyvinyl-Alkohol-Montagelösung, die O/N aushärtet, kann verwendet werden: Positionieren Sie den Deckelrutsch sorgfältig, um die Bildung von Luftblasen zwischen dem Schlitten und dem Deckelschlupf zu vermeiden.</li>
	<li>Lassen Sie das Montagemedium O/N bei 4 °C im Dunkeln aushärten.</li>
	<li>Verwenden Sie ein invertiertes konfokales Mikroskop, um das pHluorin-plexinA1-Fusionsprotein präzise zu visualisieren: Führen Sie z-stack bei optimaler Loch- und optischer Auflösung durch und verwenden Sie eine 20X (NA 0.75) oder 40X (NA 1.3) Linse. Hinweis: pHluorin ist mit den gleichen Parametern nachweisbar, die zur Detektion von GFP verwendet werden(d. h. Emissionsspitzen bei 509 nm). Die Einstellungen für Wellenlängenanregungs- und Detektionsfilter werden durch die Bildverarbeitungssoftware optimal definiert. Hoechst wird zwischen 425-460 nm (Erregung ist bei 405 nm), GFP oder pHluorin zwischen 485-545 nm (Erregung liegt bei 473 nm) und RFP zwischen 575-675 nm (Erregung liegt bei 559 nm) nachgewiesen.</li>
</ol>Repräsentative Bilder von pHluorin-plexinA1 und eGFP-Expression im Küken-Embryo-Rückenmark sind in Abbildung 4dargestellt.

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+variants+as+ratiometric+dual+emission+pH+sensors.+1.+Structural+characterization+and+preliminary+application.">Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application.</a> Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).</li><li>Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+refinement+of+vesicle+cycling+at+schaffer+collateral+synapses.">Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses.</a> Neuron. 77, 1109-1121 (2013).</li><li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pHTomato,+a+red,+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity.">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).</li><li>de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren, um die Dynamik eines Axon-Führungsrezeptors sowohl in der Zellkultur als auch im Entwicklungskontext des Kükenembryonals Rückenmarks zu verfolgen.
Um ein de novo pHluorin-markiertes Protein zu entwerfen, müssen zwei Punkte in Bezug auf die Klonstrategie berücksichtigt werden. Zunächst sollte das pHluorin-Tag dem Lumen der sauren Endosomen und damit dem extrazellulären Fach ausgesetzt werden, um den Plasmamembranrezeptorpool z...

Während ihrer Navigation integrieren Axone mehrere Umwelthinweise, die sie zu ihrem Ziel führen. Diese Hinweise aktivieren Leitrezeptoren an der Oberfläche von Axonklemmen, den Wachstumskegeln, die wiederum einen geeigneten Signalweg initiieren. Daher ist die zeitliche und räumliche Regulation der Zelloberflächenverteilung der Rezeptoren entscheidend, um die Empfindlichkeit des Wachstumskegels1einzustellen. In diesem Zusammenhang ist die Mittellinienüberquerung durch kommissarische Axone ein ausgezeichnetes Modell, um die Regulierung der Oberflächenebenen von Rezeptorzellen zu untersuchen. Im sich entwickelnden Rückenmark werden kommissarische Axone zunächst zur ventralen Bodenplatte hin angezogen, wo sie die Mittellinie überqueren. Nach der Überquerung verlieren sie ihre Reaktionsfähigkeit auf die Bodenplatten-Anziehungsmittel und gewinnen an Reaktion auf Bodenplattenabweisende, so dass sie die Bodenplatte verlassen und in Richtung ihres Endziels in der kontralateralen Seite des Nervensystems navigieren können2,3. Die Regulierung der Rezeptorverfügbarkeit an der Wachstumskegeloberfläche ist einer der Mechanismen, die dem Wechsel der Reaktionsfähigkeit auf Mittellinienhinweise 4,5zugrunde liegen. Daher ist die selektive Überwachung der Rezeptoren, die an der Plasmamembran von Wachstumskegeln vorhanden sind, von größter Bedeutung. Wir beschreiben hier eine Methode, die auf der pH-abhängigen Fluoreszenzeigenschaft einer grünen Fluoreszenzproteinvariante (GFP) basiert, um speziell die Axon-Führungsrezeptoren zu visualisieren, die an die Plasmamembran in vitro und in vivoim sich entwickelnden Kükenrückenmark adressiert sind.
Rothman und Kollegen entwickelt durch Punktmutationen pH-sensitive Varianten von GFP einschließlich der Ekliptik pHluorin6. Ekliptisches pHluorin hat die Eigenschaft, nicht fluoreszierend zu sein, wenn es einem sauren pH-Wert (<6) ausgesetzt ist, während es bei neutralem pH-Wert fluoreszierend ist. Dies ermöglicht die Unterscheidung von nichtfluoreszierenden Rezeptoren, die in intrazellulären sauren Kompartimenten lokalisiert sind(d.h. Endosomen, Handelsvesikeln) von fluoreszierenden Rezeptoren, die in die Plasmamembran integriert und somit dem extrazellulären neutralen pH7ausgesetzt sind. Wir nutzten dies, um die Plasmamembranlokalisierung von plexinA1 zu überwachen, einem Axon-Führungsrezeptor, der die Wachstumskegelreaktion auf das Mittellinien-repellens Semaphorin 3B5 vermittelt (Abbildung 1A). Wir beschreiben hier die In-vitro-Charakterisierung eines pHluorin-plexinA1-Konstrukts, zusammen mit der ovo Elektroporation8-10 dieses Konstrukts im sich entwickelnden Kükenrückenmark, gefolgt von der mikroskopischen Analyse von Kryosektionen, die es ermöglichen, die Axon-Führungsrezeptordynamik in vivo mit räumlichen und zeitlichen Auflösungen zu verfolgen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1007">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">COS7 cells</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:219px;">CRL-1651</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">DMEM GlutaMAX</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:264px;">Exgen500 reagent</td>
			<td style="width:147px;">Euromedex Fermentas</td>
			<td style="width:219px;">ET0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">PBS -Ca2+ -Mg2+</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fast green dye</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">32% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscopy</td>
			<td style="width:219px;">15714-S</td>
			<td>Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryomount</td>
			<td style="width:147px;">Histolab</td>
			<td style="width:219px;">00890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Hoechst 34580</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:219px;">H21486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:219px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Bottom-glass 35 mm dish</td>
			<td style="width:147px;">MatTek</td>
			<td style="width:219px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">5 ml Syringe</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">SS-05S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Needles 0.9 mm x 25 mm</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">NN-2025R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Capillaries</td>
			<td style="width:147px;">CML</td>
			<td style="width:219px;">PP230PO</td>
			<td>capillaries are stretched manually in the flame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4951PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Microscalpel</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">10316-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">Dumont #5 REF#11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Equipment/software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Time lapse microscope</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:219px;">Observer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Temp module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">CO2 module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:147px;">Metamorph</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Eggs incubator</td>
			<td style="width:147px;">Sanyo</td>
			<td style="width:219px;">MIR154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electroporator apparatus</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electrodes</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY611P7-4</td>
			<td>4 mm platinum electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td style="width:147px;">LEICA</td>
			<td style="width:219px;">MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryostat</td>
			<td style="width:147px;">MICROM</td>
			<td style="width:219px;">HM550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;">FV1000, X81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluoview software</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CLC Main Workbench software</td>
			<td style="width:147px;">CLC Bio</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of phluorin to assess the dynamics of axon guidance receptors in cell culture and in the chick embryo

Während der Entwicklung spielen Axon-Beratungsrezeptoren eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Empfindlichkeit der Axone sowohl gegenüber attraktiven als auch abstoßenden Hinweisen. Tatsächlich ist die Aktivierung der Leitrezeptoren der erste Schritt der Signalmechanismen, die es Axonspitzen, den Wachstumskegeln, ermöglichen, auf die Liganden zu reagieren. Daher ist die Modulation ihrer Verfügbarkeit an der Zelloberfläche einer der Mechanismen, die an der Einstellung der Wachstumskegelempfindlichkeit beteiligt sind. Wir beschreiben hier eine Methode zur präzisen Visualisierung der räumlich-zeitlichen Zelloberflächendynamik eines Axon-Führungsrezeptors sowohl in vitro als auch in vivo im sich entwickelnden Kükenrückenmark. Wir nutzten die pH-abhängige Fluoreszenzeigenschaft einer Grünen Fluoreszenzproteinvariante (GFP), um gezielt den Anteil des Axon-Führungsrezeptors zu detektieren, der an die Plasmamembran adressiert ist. Wir beschreiben zunächst die In-vitro-Validierung solcher pH-abhängigen Konstrukte und beschreiben deren Verwendung in vivo,im Küken-Rückenakkord, um die räumlich-zeitliche Dynamik des Axon-Leitrezeptors von Interesse zu bewerten.

<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1.jpg"> Abbildung 1. A. Schema der pHluorin-plexinA1-Fluoreszenzeigenschaften in einem zellulären Kontext. PHluorin ist nicht fluoreszierend in intrazellulären Kompartimenten, in denen der pH-Wert sauer ist (<6), z. B. bei Handelsvesikeln oder in Endosomen, und fluoreszierend, wenn es dem extrazellulären Medium a...

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Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Wir beschreiben hier die Verwendung einer pH-empfindlichen grünen fluoreszierenden Proteinvariante, pHLuorin, um die räumlich-zeitliche Dynamik des Axon-Beratungsrezeptorenhandels an der Zelloberfläche zu untersuchen. Der pHluorin-markierte Rezeptor wird sowohl in der Zellkultur als auch in vivomit Elektroporation des Kükenembryons exprimiert.

Verwendung von pHluorin zur Bewertung der Dynamik von Axon-Leitrezeptoren in der Zellkultur und im Küken-Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

use-phluorin-to-assess-dynamics-axon-guidance-receptors-cell-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.1K Aufrufe.  University of Lyon. Wir beschreiben hier die Verwendung einer pH-empfindlichen grünen fluoreszierenden Proteinvariante, pHLuorin, um die räumlich-zeitliche Dynamik des Axon-Beratungsrezeptorenhandels an der Zelloberfläche zu untersuchen. Der pHluorin-markierte Rezeptor wird sowohl in der Zellkultur als auch in vivomit Elektroporation des Kükenembryons exprimiert.

Serie: Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Elektroporation des Hinterhirn zu Axonal Trajectories und Synaptic Treffer in der Embryo-Küken Trace

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

Die Verwendung von Trace Eyeblink klassische Konditionierung hippocampale Funktionsstörung in einem Rattenmodell der Fetal Alcohol Spectrum Disorders bewerten

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

Verwendung von primär kultivierten Hippocampus-Neuronen zur Untersuchung der Anordnung von Axon-Anfangssegmenten

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Isolation und Kultur von Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...