Bu yayın ABD Ulusal Bilim Vakfı (DEB # 1021559) tarafından desteklenen Çevre Araştırma Koordinasyon Ağı Araştırma Enzimler tarafından finanse edildi. Bu araştırma ABD Ulusal Bilim Vakfı (DEB # 1021559) ve Bilim Enerji Dairesi (Biyolojik ve Çevresel Araştırma) ABD tarafından desteklenmiştir. Bu malzemenin ifade herhangi bir görüş, bulgular ve sonuçlar ve öneriler yazarların aittir ve ABD NSF görüşlerini yansıtmaz.

1.. Tahlil Set-up <ol><li> Etiket 3 derin kuyu plakaları: &quot;Örnek&quot;, &quot;MUB standart&quot; ve &quot;MUC standart&quot;. </li><li> Her bir standardı (0, 2.5, 5, 10, 25, 50, ve 100 mcM MUB) ve alt tabaka ayrı ayrı temiz, prelabeled rezervuarların içine (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) (satırlar) odaklı dökün . </li><li> MUB standart plaka (Tablo 1) karşılık gelen kuyu içine uygun MUB standart Pipet. <ol><li> MUB standart plaka sıra A içine 0 iM Mub Pipet 200 ul. </li><li> Pipet 200 MUB standart plaka sıra B içine 2.5 mcM Mub ul. </li><li> MUB standart plaka sıra C içine 5 mcM Mub Pipet 200 ul. </li><li> MUB standart plaka sıra D içine 10 mcM Mub Pipet 200 ul. </li><li> MUB standart plaka sıra E içine 25 mcM Mub Pipet 200 ul. </li><li> MUB standart plaka sıra F içine 50 iM Mub Pipet 200 ul. </li><li> 100 μ Pipet 200 ulMUB standart plaka sıra G içine M MUB. </li><li> MUC standart plaka ilgili kuyulara MUC standartları 1.3.8 - tekrarlayın 1.3.1 adımları. </li></ol></li><li> Her toprak örneği için hazırlık toprak çamurlar. <ol><li> Blender içine alan nemli toprakta 2.75 g tartılır. </li><li> 50 mM tampon 91 ml ilave edilir. 1 dakika boyunca yüksek üzerinde karıştırın. </li><li> En azından geniş bir karıştırma çubuğu ile 8-kanal pipet gibi temiz bir cam kasenin içine blender içeriğini dökün. </li><li> Düşük toprak çamurunu karıştırmak, heyecan plaka üzerine yerleştirin. </li><li> Pipet Örnek plakasının (Tablo 2) birinci sütuna toprak çamurunun 800 ul. </li><li> MUB standart ve MUC standart levhalar (Tablo 1) 1 st sütuna tekrar edin. </li><li> DI H 2 O ile blender, heyecan plaka ve karıştırma çubuğu durulayın veya toprak örneklerinin arasında tampon. </li><li> Sonraki her toprak örneği (Tablo 1 ile sonraki sütuna hareket, her bir örnek için) 1.4.7 ve - Tekrar 1.4.1 adımları2). </li></ol></li><li> Örnek plaka (Tablo 2) karşılık gelen oyuklarına (bu örnekte, 200 uM konsantrasyonu), uygun alt-tabakanın Pipet. <ol><li> Numune plaka sıra A içine BG substrat Pipet 200 ul. </li><li> Pipet Numune plaka sıra B içine CB substratın 200 ul. </li><li> Numune plaka satır C içine NAG substratı Pipet 200 ul. </li><li> Pipet Numune plaka sıra D içine PHOS substratın 200 ul. </li><li> Pipet Numune plaka satır E içine XYL substratın 200 ul. </li><li> Numune plaka satır F içine AG substrat Pipet 200 ul. </li><li> Numune plaka satır G içine LAP substrat Pipet 200 ul. </li><li> Her inkübasyon sıcaklığı numune plaka için 1.5.7 - tekrarlayın 1.5.1 adımları. </li></ol></li></ol> 2. Deney plakası inkübasyonu <ol><li> Derin kuyu plakaları (&quot;örnek&quot;, &quot;MUB standart&quot; ve &quot;MUC standart Seal4 ;) plaka paspaslar. </li><li> Çözelti iyice karıştırılır kadar elle her (mühürlü) plaka invert (~ 10x). </li><li> Gerekli inkübasyon süre (Tablo 3) uygun inkübatör tabak yerleştirin. </li><li> Zaman 0 olarak ilk defa kaydedin. Eğer inkübatör (Tablo 3) gelen plaka kaldırmak için ne zaman biliyor bu yüzden de uygun inkübasyon sürelerini kaydetmek. </li><li> Her bir kuluçka süresi, santrifüj ~ 2900 x g&#39;de 3 dakika boyunca sızdırmaz plakalar sonunda. </li><li> Sertifika sonra, (bir siyah plaka, her kuluçkalanmıştır derin kuyu plaka için kullanılacaktır), siyah düz tabanlı 96 oyuklu plakalar içinde karşılık gelen kuyu içine kuluçkaya derin sağlam plakanın her çukuruna 250 ul aktarın. Bu, siyah düz tabanlı 96 oyuklu plakalarda aynı kuyu (örneğin, A1, ... A12, vb) içine kuluçkaya derin kuyulu plakalarda numune aktarmak için önemli olan (Tablo 1, 2). </li></ol> 3. Floresan ölçümleri onMikrotabak Fluorometer <ol><li> Kullanılan fluorometrik plaka okuyucusu için üreticinin talimatlarına, 450 nm&#39;ye 365 nm ve emisyon dalga boyu eksitasyon dalga boyu: (veya uygun filtreler kullanın) sonra. </li><li> Florometre üzerinde üç tabak okuyun. Önemli: numuneler ve standart levhalar (yani MUB veya MUC) aynı kazancı kullanılarak okunması gerekir. <ol><li> Otomatik kazanç spektrofotometre ayarlayın ve MUC ve MUB Standart plakaları okuyun. </li><li> Set kılavuzuna kazanç ve optimum dan sonraki en düşük sayıya değeri azaltmak, her standart plaka için, en yakın beş yuvarlanır. Her bir plaka için 2x tekrarlayın. </li><li> Otomatiğe kazanç ayarlayın ve örnek plakayı. Standart plakaları (örneğin MUB ve MUC) her biri için en yüksek kazanç maç için elle örnek plaka yeniden çalıştırın. </li></ol></li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> MUB için tablo içine standart eğri floresan verilerini girin (Tablo 4a) Ve MUC standart (Tablo 4b) <ol><li> (Umol) &#39;den (uM) konsantrasyonları dönüştürme (Tablo 4a ve 4b). </li></ol></li><li> Her numunenin standart eğri floresan veri, eğim, y-kesişim, ve R Mub ve MUC (ľmol) standart konsantrasyonları 2 değerlerini hesaplamak. Uygun R2 değerleri her bir numune için 0.98 aşmalıdır (Tablo 4a ve 4b). Floresan bağımlı değişken (y-ekseni) ve standart bir konsantrasyonu (umol) bağımsız değişken (x-ekseni) (Şekil 1) olarak grafiğe olarak çizilmiştir okumaları ile, bir dağılım arsa standart eğrileri görselleştirmek için yararlı olabilir. </li><li> Bu potansiyel EEAS içine numune + madde ham floresan verileri hesaplamak için MUB ve MUC standart eğrisi eğimi ve y kesişim noktası değerlerini kullanacaktır. Önce yeni bir elektronik tabloya örnek + tabaka ham floresan verileri girin (Tablo 5a gerekir </strong&gt;). Sen de her bir numune için inkübasyon süresi (saat) ve toprak kuru ağırlığı (Tablo 5b) girmeniz gerekir. Numuneler 25 ° C (Tablo 3) ile inkübe edildi çünkü bu örnekte girilen zaman değerleri, 3 saattir, dikkat edin. <ol><li> Karşılık gelen örnek floresans değerlerinden standart eğri kesişim noktası değerlerini çıkarma ve daha sonra karşılık gelen standart eğri (Tablo 5 C) eğimi ile bölün. [Y = numune floresan ham okuma; MUB veya MUC standart bir eğriden b = kesmek, m = MUB ikinci eğim: x = (Yb) / m; Bunu gerçekleştirmek için, örnek enzim konsantrasyonu (x) için çözmek için standart bir çizgi denklemi yeniden düzenlemek veya MUC Standart eğri]. </li><li> 91 ml (toprak harç madde içinde kullanılan tampon hacim) (Tablo 5d) ile, yukarıda adım 4.3.1 dan, örnek umol çarpın. </li><li> [Enzim AMT: bölmek değeri örnek özgü inkübasyon süresi ve kuru toprak kütlesi (Tablo 5e) adım 4.3.2 elde. (&amp; #956; mol) ml x 1.000 x 0,8 91 ml x inkübasyon (saat) kuru toprağı (g) x x] Not: 0.8 ml de her birinde kullanılan harç maddenin hacmi, 1000 ve de her bir gerçek toprak miktarı için düzeltir. </li><li> İstenilen birimleri (nmol aktivite / g kuru toprak / saat) (Tablo 5f) almak için 1000 adım 4.3.3 elde değerini çarpın. </li></ol></li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Potansiyel toprak EEAS laboratuvar tabanlı ölçüm ekosistem işleyişi için önemli abiyotik çevreye mikrobiyal yanıtları içine anlayışlar ve bunların sonuçlarını sağlayabilir. Bu örnekte, veri kümesinin sonuçları minimal bir fark iklim tedavi araziler arasında kir enzim aktivitesi veya kinetik var olduğunu göstermektedir. Ancak, araziler arasında ters eğilimler, toprak nemi, toprak pH veya bitki büyümesi gibi mikrobiyal EEAS üretimini etkileyebilecek değişkenlerin daha fazla araştırma teşvik ediyoruz. Genel olarak, topraklarda (1) genel EEA, (2) EEA stoikiometride (3) Arrhenius araziler / aktivasyon enerjisi, ve (4) Q 10 ekosistem düzeyinde süreçlerin göstergesi olabilir yaklaşımların geniş bir spektrum sağlar açısından EEAS değerlendirilmesi sağlam toprak ekosistem fonksiyonel dinamiğini karakterize etmek için hangi. Yüksek verim flüoresan bazlı deneyler, EEA yaygın topraklarda potansiyel EEAS incelemek için kullanılan ve yararlı bir araçtırdiğer ortamlar. Önemlisi, potansiyel aktiviteler enzim havuzu boyutunu yansıtmaktadır, ancak kendileri tarafından enzim üretimi veya ciro oranlarını 46 ölçmek değil. Tekniği oldukça basit olsa da, laboratuvar protokolleri arasında görünüşte küçük farklılıklar sonuçlarının 13 karşılaştırılabilir engelleyebilir. Ne yazık ki, şu anda EEAS için uygun standart pozitif kontrolleri yok. Stokiyometrik oranların kullanımı bu zorlukların üstesinden gelmek için, bir yaklaşımdır. Aksi takdirde, yüksek verimli teknikleri gelişiyle ortamında 4 enzimlerin çalışma ilerlemiştir. Bu tahliller tarafından üretilen verinin dikkatli yorumlanması mikrobiyal aktiviteye önemli eğilimleri izah edebilir. Protokolün sağlamlığı bireysel örnekler özel koşullar seçmek için ileri gelmektedir, ancak bu da bir sınırlama neden olabilir. Modifikasyonları bir dizi örnekleri doğru olarak ölçülür sağlamak için gerekli olacaktır<html> Ayrı alan siteler: Tampon Seçtiğiniz tampon toprağın pH değerine bağlı olacaktır. Tamponlama da 27,47 yüksek pH bağımlı olan floresan standartların floresan yoğunluğu, stabilize eder. Örnek pH seviyeleri - Normal olarak, topraklı çamurun yapmak için kullanılan tampon, pH en iyi eşleşme toprağa tamponunun, özellikle asit ayrışma sabiti (pKa) için seçilmiş olan bir 50 mM sodyum asetat, Tris tamponudur. Sodyum asetat 4,76 arasında bir pKa&#39;ya sahiptir ve Tris 8,06 bir pKa değerine sahiptir, bu nedenle, bu iki tampon miktarları, ayrı ayrı örnek için istenen pKa değerine ulaşmak için değişecektir. Fosfat tamponu (pKa = 7.2) nötr / hafif bazik topraklar için önerilmiştir. Ancak, yüksek fosfat konsantrasyonları enzim aktivitesi ile müdahale olabilir, bu tampon kullanmadan önce ön çalışmalarda analitik değişkenlik test etmek için dikkatli olun. Floresan yüzeylerde Taşıma ve depolama jove_content &quot;&gt; Flüoresan tahliller ışığa maruz kaldığında kirlilikler ve / veya birçok floresan bileşikler istikrarsızlık nedeniyle parazit muzdarip olabilir, bu nedenle floresan tabakaları kullanırken dikkatli olunmalıdır. Önemle floresan substratları ve Mub ve MUC standartlarını etiketli için herhangi bir ışık maruziyeti en aza indirilmesi tavsiye . amber cam şişe kullanılması veya floresan substratları ve standartları yapmak ve saklamak için kullanılan cam ve kapları kapsayan önerilen; cam ve kapları sarmak için alüminyum folyo iyi çalışıyor Aynı şekilde, verimli bir tabak aşılanması ve karanlık inkübatörlere aktarılması en iyi uygulamadır. öneririz. (-20 ° C) için artık iki aydan (ışık onları korurken) substratları ve standartları depolanması ve çözülme yüzeyler (5 ° C) ~ öncesinde enzim tahlili (ler) başlamadan 24-48 saat. Tasarım ve Çoğaltma Iyi iyi örnek varyasyonları, negativ uygulanması için en iyi hesape tahlil kontrolleri ve tahlil çoğaltır (eğer mümkünse) önerilir. Varyasyon tipik olarak her bir oyuğa toprak parçacıklarının miktarı farklılıklar ve pipetleme hataları oluşur. Bu nedenle, güçlü karıştırma ve iyi pipetleme tekniği ölçüde iyi varyasyon iyi en aza indirecektir. Ayrıca, biz şiddetle zamanla yüzey tutarsızlıkları izlemek için negatif bir tahlil denetimi (tampon + substrat çözeltisi) uygulanması öneririz. (Normal olarak, 96-yuvalı plakalar üzerinde son sütunu kullanımı) negatif kontrol kuyuları karşılaştırarak enzim plakaları okurken bu kolayca izlenebilir. Negatif kontroller substrat bu nedenle de saptama sınırının üzerinde sinyal artar, bu alt-tabaka ve / veya standart çözeltilerin değiştirilmesini gerektiren kirlenme ya da alt-tabaka istikrarsızlık göstergesidir, tipik olarak stabildir. Diğer protokolleri bir tür gerçekleştirin rağmen verimi maksimize etmek için, bizim protokol, tek bir derin kuyu mikrotablada birkaç potansiyel EEAS içerirFarklı EEAS beri plaka (plaka başına yani bir alt tabaka) başına deney farklı hızlarda meydana gelir. Ne olursa olsun, enzim optimizasyonu yaklaşım ya da tek plaka yaklaşımı boyunca yüksek bu gerçekleştirmeden önce topraklar üzerinde yapılmalıdır. Reaksiyon hızları İnkübasyonun süre içinde, her bir enzim için nispeten tutarlı, birden çok alt-tabakalar, tek bir plaka üzerinde kullanılabilir. ~ 1 gram diğer protokoller 24 tavsiye edilirken Bizim protokol, ~ bulamaç, çözelti elde etmek için 2.75 g toprak önerir. Biz daha fazla toprak (eğer mümkünse) kullanarak içinde-örnek enzim aktivite düzeyleri toprak değişimi iyi yakalamak için etkili bir yaklaşım olduğunu göstermektedir. Diğerleri sadece alt-tabakalar, 50 ul toprak çamurunun 200 ul inkübe edilir ise, bu protokolde, 200 ul substrat ile toprak çamurunun 800 ul inkübe edin. Bu sadece en sonunda ölçülen aktivitesi değişmez ölçekleme bir fonksiyonudur. Pratik avantajları da vardırDaha büyük hacimli kullanmak için. Bir, florometre üzerinde yoğunluklarına kayıt işleminden önce siyah düz tabanlı 96 oyuklu plakalar karşılık gelen pipetleme ise toprak partikülleri önlemek için daha kolaydır. Enzim ile ilgili floresan şiddetleri kayıttan önce florometre için siyah düz tabanlı 96 oyuklu plakalar aktarımı İkinci olarak, ek bir hacim kazara dökülmesi durumunda yararlıdır. Hacim bile küçük sapmalar önemli ölçüde kuyuların arasında floresan azalacaktır. Son olarak, bu nedeniyle protokolün yüksek kapasiteli yapısı nedeniyle, genellikle oldukça tahlil çoğaltır gerçekleştirerek daha enzim aktivite düzeyleri değişimi temsil etmek deneysel çoğaltma güvenmek seçerler. Her zaman analitik çoğaltır dahil etmek iyi bir uygulamadır, ama pratikte, bizim protokol sınırlı kaynaklar göz önüne alındığında, analitik ve deneysel suretin arasında dengeli bir dengeyi sağlar hissediyorum. Aynı şekilde, bizim yaklaşımımız doğasında olan, tahlil başına 25 görece daha iyi homojenize toprak (2.75 g) kullanırntly içi toprak varyasyonları azalır. Analitik çoğaltır kullanmak için karar dikkatle ön çalışmalarda 48 analitik hata için test tarafından kabul edilmelidir. Ancak, biz az 4 tedavi grubu çoğaltır deneysel tasarımlar güçlü deneyi çoğaltır kullanarak düşünmelisiniz öneririz. Toprak, Tampon Ciltler ve Substrat konsantrasyonu optimizasyonu Toprak tamponu: alt tabaka konsantrasyonu oranı, enzim tahlilleri gerçekleştirirken güçlü ölçülen floresan etkileyen önemli bir değişkendir. Bulamacın toprak miktarı tahlil ya da alt-tabaka konsantrasyonunun, bir toprak numunesi için enzim aktivitesine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir ilave edildi. Bu örnek için seçilen miktarları için alt-tabaka elverişliliğini deney koşulları (V max) altındaki maksimum potansiyel oranlarının ölçümü olduğu sınırlandırıcı olmayan, ve daha emin olmak için bu toprakların önceki test dayanmaktadır 44,45. Bununla birlikte, enzimlerin yüksek konsantrasyonlarda toprak örnekleri için, toprak ya da alt-tabaka konsantrasyonunun miktarı artırılmalıdır. Bu alt-tabaka, artan konsantrasyonlarda (ve buna uygun olarak standart eğri ayarlama) eğrinin lineer etkileyebilir bulduk. Bu nedenle, gerekli hacimleri tampon toprak miktarları ve / veya oransal ayarlamaları azaltılması önerilir. Ne olursa olsun, ölçülen EEAS doymuş ve alt doymuş substrat konsantrasyonları 26 arasında daha fazla bir büyüklük sırasına göre değişiklik olabilir, çünkü tahlil her toprak türü için substrat konsantrasyonu optimize etmek için önemlidir. Bu nedenle deneysel tedaviler (vb) arasındaki farklar tip II istatistiksel hata ve alt-doyurarak koşullarda tespit edilecek daha az olasıdır ve istatistiksel hata 27,35 duyarlıdır. Alt tabaka konsantrasyonları uygun hale getirmek için, ön enzim tahlilleri alt-tabaka konsantrasyonları geniş bir yelpazede kullanarak temsili toprak numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir gerekir. Sonrafloresan kayıt, sadece (benzer şekilde, standart eğri örnek, Şekil 1) veri arsa aktivitesi (y-ekseni) enzim karşılık gelen alt-tabaka konsantrasyonu (x-ekseni) tanımlamak için burada eğim seviyesi kapalı (0 ~). Aynı şekilde, eğim seviyesi kapalı (~ 0) o toprak için uygun alt-tabaka konsantrasyonunun bir göstergesi olduğunu noktasına karşılık gelen alt-tabaka konsantrasyonu. Bu deney, sonuçta enzim aracılı substrat depolimerizasyon bir sonucu olarak alt-tabaka yarılır flüorojenik kısmı tarafından üretilen belirli bir zaman içinde floresan ölçer. Bu nedenle, aşama 5 (alt-tabaka ekleme) kritiktir ve alt tabaka kirlerin eklendiğinde ve deneyler enkübe edildiği zaman arasındaki süreyi en aza indirmek için mümkün olduğu kadar etkin gerçekleştirilmelidir. Alt-tabaka, numune ile temas bir kez benzer şekilde, enzimatik reaksiyonlar meydana başlayacaktır. Biz bir çok kanalı kullanarak tavsiyeBu nedenle pipetle. Kuvvetle önce gün size enzim tahlilleri performans çok kanallı pipet kullanarak verimli olmak için önerilmektedir. Kolayca pipet ile 96-kuyu tabak içine birimleri aktarmak kadar bu başarmak için, su ile pipetlenmesini pratik yapabilirsiniz. Toprak Islah Su ile soğutma, toprak bulamaçlar-inkubasyon 26 parçacık ve / veya organik madde tarafından neden olunan floresan yoğunluğunun azaltılması anlamına gelir. Tampon oranları 25: söndürme toprak ayarlayarak etkilenmiş olabilir. Nedeniyle tek örneklerinden eşiğe için, bu arka plan (söndürme) floresan için hesap numuneleri ile standartları çalıştırmak için çok önemlidir. Bazı protokoller, sinyal doğrusal olduğu test edildikten sonra, tek bir konsantrasyonda kullanımı olsa da, şiddetle su verme etkilerinden en iyi kontrolü için her bir örnek için standart soğutma kontrol uygulanması önerilir. Aksi takdirde bir stand neden olacaktırörnek için geçerli değildir ard eğrisi ve enzimatik aktivite, yanlış bir kestirimi. Standart ekleme numunenin floresan arka plan etkilemez gibi kir bulamaçlara standartların eklenmesi, zamana duyarlı değildir. NaOH ilavesi NaOH ilavesi, sentetik alt tabakalardan salınan fluoresan boya&gt; pH 9.0 26,49 floresan tepe sergileyen için florimetrik enzim etkinlik ölçümleri optimize etmek için bir protokol kullanılır. Bu öneri göz önüne alındığında, toprak çamuru pH değerinde (örneğin pH&gt; 9) için gerekli olan NaOH konsantrasyonu belirli toprağa bağlı olarak değişir ve pH, tampon 26 kullanılır. Ancak, diğerleri sinyal yoğunluğu daha düşük pH değeri genellikle çok yüksektir, çünkü bu ölçüm hatası ek bir kaynak sunuyor çünkü NaOH gerekli olmayabilir savunuyorlar. Örneğin, çamur pH ve böylece MUB veya MUC fluore üzerinde NaOH ilavelerin etkisizaman üzerinde 25 scence değişir. Kadar 60 dakika boyunca 26 floresan azalma MUC sabit göstermiştir etmektedir; MUB bağlanmış alt-tabakalar seviyeleri koniklik önce NaOH ekleme takip eden 20 dakika boyunca sürekli artan flüoresans göstermek için gösterilmiştir. Bu nedenle, NaOH ilavesi ve floresan ölçümü arasındaki süre, standardize etmek önemlidir. Floresan seviyeleri NaOH eklemeden tahliller yapmak, eklenmeden yeterince tespit edilebilir, alternatif olarak, aynı şekilde kabul edilebilir bir alternatif olarak 26 önerilmiştir. Sıcaklık Inkübasyon sıcaklığı karar verirken sıcaklık duyarlılığı göz önüne alınmalıdır. Birincil ilgi gösterildiği gibi (sonuç bölümünde) Arrhenius araziler kullanarak üç veya daha fazla sıcaklıklar kullanılarak, enzim kinetiği anlayış ise sağlam bir yaklaşımdır. Örnek site gibi sonra buzlanma toprak, duratio karakteristik olarak düşük sıcaklık varsainkübasyon n soğuk inkübasyon sıcaklıklarda tepkimeye enzimler için izin vermek için uzatılabilir gerekebilir. Geleneksel enzim kinetiği sıcaklığındaki bir artış, enzim aktivitesi ile sonuçlanmalıdır göstermektedir birlikte, enzimler, sıcaklık 50 duyarlılık açısından belirli bir site olabileceğini bulduk. Bu nedenle alana özgü enzim aktivitesi potansiyelini anlamak için bu inkübasyon sıcaklığı ve süresi alan yeri değerlerini yansıtacak şekilde ayarlanması önemlidir. Sonuç EES topraklarda biyokimyasal süreçlerin kritik sürücüleri, ve böylece biz onların faaliyetlerini ölçmek gerekiyor. Girişim ve engellenmesi dahil topraklarda EEAS, ölçüm için pek çok zorlukları vardır. Bu zorluklara rağmen, (burada tarif edilen gibi) standart protokolleri evrensel enzimleri geniş bir yelpazede EEAS ölçülmesi için tatbik edilebilir. O, bu protokoller aşağıdaki kalite verilerini oluşturmak oldukça kolay olsaekolojik bağlamda bu rakamların tef si bu tahlilleri gerçekten ölçüm şeyin dikkatli bir değerlendirme gerektirir ve nasıl tahlil koşulları altında EEAS yerinde koşulları altında farklı olabilir.

Toprak bakteri, mantar, ve arkelerin tarafından üretilen hücre dışı enzimler (EES) sayısız biyokimyasal süreçlerde ve işleme, istikrar, ve karasal ekosistemler 1 toprak organik madde ve besin döngüsü istikrarsızlık merkezi vardır. EES üreterek, toprak mikroplar ayrıştırmak ve böylece bitki ve mikroplar toprakta mevcut besin asimile sağlar önce bağlı mikro ve makro besinleri, özgürleştirici, daha küçük çözünür moleküller halinde polimerik organik madde dönüşümü. Doğrudan enzimleri tespit ve ölçmek çok zordur çünkü EES, öncelikle laboratuvar deneylerinde 2-4 faaliyetlerini ölçerek, yıllardır çalışılmıştır. Hücre dışı enzim aktivitesi (EEA), en kuvvetli enzimler ve karşılık gelen alt-tabakaların konsantrasyonu ile kontrol edilir. Bolluğu, farklı C-, N-ve P-topraklarda bozundurucu enzimler, çok sayıda faktör tarafından kontrol edilir imikrobiyal biyokütle, topluluk kompozisyonu, yüzey kullanılabilirliği, mikroklima ve stokiyometrik taleplerini 5,6 ncluding. Ancak, toprak ortamı içinde in situ EEAS da boyut, yüzey kullanılabilirliği açısından, sıcaklık 7,8, toprak killeri ve hümik özellikleri 2&#39;ye enzimlerin bağlayıcı ve sonuçta aktif enzim havuzu düzenleyen difüzyon kısıtlamaları 9, etkilenir ve devir oranları 10-12. Farklı çevre siteler arasında toprak mikrobiyal şekilde yorumlamak için laboratuvar enzim testiyle nedenle, yerinde toprak koşullarında kabul önemlidir. EEA Birçok farklı sınıflar (daha fazla detay için &quot;Reaktifler Tablo Listesi&quot; bakınız) sentetik yüzeylerde kullanarak çeşitli laboratuar deneylerinde belirlenebilir. Bazı protokoller w, bir spektrofotometre ile tespit edilebilir bir kolorimetrik reaksiyon kuple edilir deneylerde alt tabakaları kullanırbir floresan parçasına bağlanmıştır alt tabakaları kullanır, burada tarif protokol de dahil olmak hile diğerleri. Floresan EE deneyler tipik haliyle kolorimetrik analizler göre (büyüklük sırasına göre) daha hassastır (sentetik alt-tabaka ile bağlanmış bir kromojenik grubu kullanan) 12-14. Bir ilgi bileşiğinin miktarı ile ilgilidir tespit ve en tespit potansiyel enzim aktivitesi için diğer ilgili: EEA saptanmasında duyarlılık iki yönü içerir. Kolorimetrik p-nitrofenol için yöntemler, (PnP) dayalı tahliller geçmişte bulunabilir 15,16 çalışır. Kısaca, toprak içinde en iyi ya da alan uygun sıcaklık ve pH inkübe edilir (tipik olarak &lt;2 mm ve hava ile kurutularak için elenmiş). Serbest reaksiyon ürünü bir spektrofotometre 14 ile kolorimetrik tespit edildiği hızı. Floresan enzim deneylerinin yüksek hassasiyet substr ilişkili fluorojenik parçası ayırma daha hassas bir şekilde tespit kısmen kaynaklanmaktadırBelirli bir dalga boyundaki bir spesifik kromojenik kısmının ayrılmasından sonra bozulmasını yerine kayıt absorbans yedi. En yaygın olarak kullanılan sentetik floresan göstergeleri 4-metilumbelliferon (MUB) 17 ve 7-amino-4-metilkumarin (MUC) 18,19 vardır. MUC-bağlanmış alt tabakalar genellikle bu tür proteinlerin ve / veya amino asitler gibi N-zengin sentetik alt-tabakalar ile ilişkilidir. Floresan teknikleri ilk su numuneleri 20,21 için geliştirilen ve topraklara uygulama sinyal söndürme ve müdahale 22,23 için denetimler gerektirir edildi. Deneyler Ya büyük hacimli geleneksel &quot;masa üstü&quot; kimyası kullanılarak yapılabilir, veya artmış verim, ancak muhtemelen daha yüksek ölçüm hatası ile, mikro göre protokollerinde de kullanılabilecektir. Topraklarda 24 EEAS floresan tespiti için çeşitli yaygın olarak anılan protokoller olsa da, birçok laboratuvar genellikle yanlışlıkla veya bağlı farkı, bu protokoller üzerinde ince varyasyonları istihdamlaboratuar ekipmanları veya reaktiflerdeki s. Protokollerinin ayrıntıları görünüşte küçük farklılıklar şiddetle EEAS 25,26 ölçülebilir etkiler ve standart enzimlerin eksikliği, farklı laboratuarlar arasında deneyleri kalibre zorlaştırmaktadır. Böylece, EEA testlerin standardizasyonu teşvik detaylı protokollerin yayılması için önemli bir ihtiyaç vardır. Protokolde, toprak numuneleri, bir pH tampon maddesi ile toprak örnekleri birleştiren ve bir karıştırıcı ile homojenize edilmesi suretiyle hazırlanır. Bulamaçlar daha sonra, floresanla işaretlenmiş sınırlayıcı olmayan bir miktarı ile aşılanır = C-,-N ya da P açısından zengin alt tabaka, ilgi konusu özel bir araştırma söz bağlı olarak seçilir. Enzim deneylerde toprak bulamaçları kullanarak alt-tabaka difüzyon sınırlamaları en aza indirmek için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Flüoresan kısımları kendi ilgili bir substrattan ayrılmaktadır kadar söndürüldü, ve floresan boya alt-tabaka b serbest olarak bu şekilde enzim aktivitesi tespit edilebiliry bir enzim katalizli reaksiyon. Zaman içinde artan flüoresan yoğunluğu, enzim-katalizörlü reaksiyon oranını yansıtır. Floresans enzim tahlilinin genel kavramı flüorojenik yarımı (flüoresan boya) ile bağlı sentetik alt-tabakalar, toprak örneği 27 eklenir olmasıdır. Enzim-alt tabaka katalize bozulması sırasında bağ floresan boya ve alt-tabaka arasında keser. Substrattan serbest floresan boya sonuç olarak enzim aktivitesinin dolaylı bir değerlendirme olarak kullanılır ve boyanın floresans yoğunluğunu tespit etmek için bir mikro-plaka okuyucu kullanarak ölçülebilir. Serbest kalan boya farklı bir dalga boyunda ışık emici sonra bir dalga boyunda ışık yayan olarak Kısaca, floresan ölçümü gerçekleştirilir. Floresan yoğunluğu uyarı ve tespit hem edebilen bir plaka okuyucu tarafından kaydedilir. Enzim aktivitesi, daha sonra bilinen bir floresan boya conce göre tayin edilebilirDeneyde (örneğin 4-metilumbelliferon (MUB) ya da 7-amino kullanılan alt-tabakanın özgül flüorojenik kısmı için floresan yoğunlukları standart bir seyreltme eğrisi referans ile birlikte alt-tabaka (örneğin, sentetik bir alt tabakanın bilinen bir miktarda toprak numunelere ilave edilen) ntrations -4-metilkumarin (MUC)). (Enzim aktivitesi ölçümü ile ilgili özel ayrıntılar için protokol bölümüne bakınız). Laboratuvar toprak enzim tahlilleri mikrobiyal topluluk fonksiyonunu değerlendirmek için yararlıdır, ancak kullanıcılar 10 tanıması gereken birkaç teknik sınırlamalar vardır. Floresan deneyleri ışığa maruz kaldığında kirlilikler ve / veya birçok floresan bileşikler istikrarsızlık nedeniyle parazit muzdarip olabilir, bu nedenle floresan Alt tabakalar 25 tutarken dikkatli olunmalıdır. Toprak çamurlarında kir tanecikleri ve / veya organik madde de söndürme etkisi 26 olarak bilinen floresan yoğunlukları, engelleyebilir.Bundan başka, laboratuar deneyleri, enzim sadece laboratuar koşulları altında potansiyel EEAS değerlendirir. In vitro deneyler, alt-tabaka ve bolluk difüzyon sınırlayıcı olmayan koşullar altında EEAS ölçer. Bu nedenle, bu deneyleri tarafından sağlanan veri in situ toprak koşulları altında 10 EEAS için iyi bir vekil olmayabilir. Genel olarak, enzim aktivitesi, toprak tipi benzer olan nispi karşılaştırması için çok yararlıdır. Fiziksel ya da kimyasal özellikleri açısından farklılık gösteren etkinlikleri kirlerin arasındaki karşılaştırma, bu yöntem kullanılarak, ancak, dikkatli kullanılmalıdır. Bu, toprak tipi, sıcaklık farklılıkları büyük ölçüde yerinde enzim kinetik durumunu değiştirebilir olmasından kaynaklanmaktadır. Diğer bir sınırlama, nispeten az sayıda alt-tabakalar (doğal ortamı ile karşılaştırıldığında) ticari olarak temin edilebilir olmasıdır. Ayrıca, enzim deneyleri için kullanılan alt-tabakalar, sentetik doğru mevcut veya availabl toprak tabakaları temsil etmeyebilir (kolay eriyen) nispeten basitin situ e. Dikkate alınacak diğer bir faktör toprak bulamaçlarından kullanılarak in situ koşullarında 2 altında aktif olmayabilir (yani organik madde ya da killerin hareketsiz) bazı stabilize enzimlerin aktivitesini dahil olacaktır. Laboratuvar enzim tahlilleri de toprak (enzim ciro oranları) veya toprak enzimleri üreten özel mikrobiyal türler konusunda bilgiler enzimlerin kalıcılığı ile ilgili bilgi vermemektedir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents: </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#945;-D-glucopyranoside (AG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9766</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-glucopyranoside (BG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3633</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside (CB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6018</td>
			<td>Cellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2145</td>
			<td>Protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl N-acetyl-&#946;-D-glucosaminide (NAG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2133</td>
			<td>Chitin degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8883</td>
			<td>Phosphorus mineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl-&#946;-D-xylopyranoside (XYL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7008</td>
			<td>Hemicellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferone (MUB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-4-methylcoumarin (MUC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Sodium acetate anhydrous buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>acidic and neutral soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris base buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td>basic soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-65</td>
			<td>pipetting reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-684-265</td>
			<td>8-channel pipette, range: 50-1,200 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 101-1,250 &#956;l extended length natural tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1112 - 1720</td>
			<td>10 racks of 96 tips (960 tips)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-100SH</td>
			<td>Lab disc magnetic stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring blender</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-509-7P</td>
			<td>Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Dispensette III bottle-top dispensers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-688-231</td>
			<td>Dispenser; range: 5-50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Unispense &#956;P peristaltic pumps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683-7</td>
			<td>Optional dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1451363SIX</td>
			<td>Used to stirr soil slurry afer blending</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass bowls</td>
			<td>World Kitchen</td>
			<td>5304218</td>
			<td>Pyrex 10 oz rimmed custard cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well black solid plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-590</td>
			<td>Used for plate reader step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well assay blocks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-700</td>
			<td>V-bottom; 2 ml; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-387-93</td>
			<td>Sterile 96-well cap mat for square wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge equipped with holders for deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3121</td>
			<td>Centra-GP8 (this model is no longer available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30016058</td>
			<td>Plate reader (this model is no longer available)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities

Kirlerin ve diğer ortamlarda mikroplar için enerji ve besin asimile edilebilir, böylece organik makromolekülleri depolimerize ve hidrolize etmek için hücre dışı enzimler üretir. Toprak mikrobiyal enzim aktivitesini ölçmek toprak ekosistem işlevsel dinamiklerini anlamak çok önemlidir. Floresans enzim tahlilinin genel kavramı sentetik C-, N-, veya bir floresan boya ile bağlı P açısından zengin alt tabakalar toprak örneklerinin eklenir olmasıdır. Zaman sağlam, etiketli substratlar floresan değildir. Enzim etkinliği fluoresan boyalar onları floresan sağlar kendi alt-tabakalar, ayrıldı olarak floresansta artış olarak ölçülür. Enzim ölçümleri molarite veya etkinliğinin birimleri olarak ifade edilebilir. Bu tahlili gerçekleştirmek için, toprak harç maddeleri, pH tampon maddesi ile toprak birleştirerek hazırlanır. PH tampon maddesi (genellikle 50 mM sodyum asetat ve 50 mM Tris tamponu), en iyi kir sa eşleştirmek için tamponunun belirli asit ayrışma sabiti (pKa) için seçilmiştirmple pH. Toprak bulamaçlar floresan (yani C-N-ya da P-zengin) alt-tabaka olarak etiketlenmiş bir sınırlayıcı olmayan bir miktarı ile aşılanır. Deneyde toprak harç maddelerin kullanılması, enzim ve alt tabaka difüzyon sınırlamaları en aza indirmek için hizmet eder. Bu nedenle, alt-tabaka bir sınırlama farklılıklara, difüzyon oranları, ve toprak pH koşulları için, bu deney, kontroller, bu yüzden (örnek başına) enzim konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak potansiyel bir enzim aktivitesi oranlarının saptanması. Floresan enzim tahlilleri genellikle spektrofotometrik (yani kolorimetrik) tahlillerinde daha duyarlı, ancak kirlilikler ve ışığa maruz birçok floresan bileşikler istikrarsızlık nedeniyle parazit muzdarip olabilir; böylece floresan tabakaları kullanırken dikkatli olunmalıdır. Alt tabakalar sınırlayıcı değildir Benzer şekilde, bu yöntem sadece laboratuar koşulları altında potansiyel enzim aktivitesini değerlendirir. Haçı temsil eden verileri yorumlarken dikkatli kullanılmalıdırYerinde toprak tipi ve sıcaklık gibi farklı sıcaklıklar veya toprak türleri ile-site karşılaştırmalar enzim kinetiği etkileyebilir.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities at JoVE.com

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Toprak dışı enzim faaliyetlerinin muhtemel değerlerini ölçmek için, bir floresan boya bağlanmıştır sentetik alt-tabakalar toprak örneklerinin eklenir. Floresan boya yüksek flüoresans daha fazla alt bozulmasını gösteren bir enzim-katalizörlü reaksiyonu ile alt-tabakadan salınmaktadır gibi enzim aktivitesi ölçülmüştür.

Potansiyel Toprak Ekstrasellüler Enzim Aktivitelerinin Yüksek verim Florimetrik Ölçme

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

high-throughput-fluorometric-measurement-potential-soil-extracellular

Research

JoVE Journal

Environment

46.0K Görüntüleme.  Colorado State University.  Toprak dışı enzim faaliyetlerinin muhtemel değerlerini ölçmek için, bir floresan boya bağlanmıştır sentetik alt-tabakalar toprak örneklerinin eklenir. Floresan boya yüksek flüoresans daha fazla alt bozulmasını gösteren bir enzim-katalizörlü reaksiyonu ile alt-tabakadan salınmaktadır gibi enzim aktivitesi ölçülmüştür. 

Video: High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

Yüksek Verimli Mikroplate Tahliller kullanarak Waters, Topraklar ve tortulları Mikrobiyal Ekstrasellüler Enzim Aktivitesi Belirlenmesi

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Çevre

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

Sürekli Tasarımı ve İşletilmesi<sup&gt; 13</sup&gt; C ve<sup&gt; 15</supÜniformalı veya Diferansiyel için&gt; N Etiketleme Odası, Metabolik ve Yapısal, Bitki İzotop Etiketleme

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

Toprak Örnekleme ve Entomopatojenik Nematodlar İzolasyonu (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the biogeochemical drivers of climate change and to the development and evaluation of GHG mitigation strategies based on modulation of landscape management practices. The static chamber-based method described here is based on trapping gases emitted from the soil surface within a chamber and collecting samples from the chamber headspace at regular intervals for analysis by gas chromatography. Change in gas concentration over time is used to calculate flux. This method can be utilized to measure landscape-based flux of carbon dioxide, nitrous oxide, and methane, and to estimate differences between treatments or explore system dynamics over seasons or years. Infrastructure requirements are modest, but a comprehensive experimental design is essential. This method is easily deployed in the field, conforms to established guidelines, and produces data suitable to large-scale GHG emissions studies.

This article showcases the static chamber-based method for measurement of greenhouse gas flux from soil systems. With relatively modest infrastructure investments, measurements may be obtained from multiple treatments/locations and over timeframes ranging from hours to years.

Statik Chambers kullanma Tarım Topraklarının Sera Gazı Flux Ölçümü

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

Marul Potansiyel Kuraklığa tolerans Yarı-Yüksek Verim Tarama (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) Germplazm Koleksiyonlar

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

Bir Körüklü Thermogradient Tablo Toprak Süreçleri Bitki Büyüme değerlendirilmesi ve İzleme Toprak Sıcaklıklar Denetim

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

3 boyutlu (3D)-yüksek işlem hacmi zebra balığı diziliyor embriyo için şablon basılı

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Use of Principal Components for Scaling Up Topographic Models to Map Soil Redistribution and Soil Organic Carbon

Landscape topography is a critical factor affecting soil formation and plays an important role in determining soil properties on the earth surface, as it regulates the gravity-driven soil movement induced by runoff and tillage activities. The recent application of Light Detection and Ranging (LiDAR) data holds promise for generating high spatial resolution topographic metrics that can be used to investigate soil property variability. In this study, fifteen topographic metrics derived from LiDAR data were used to investigate topographic impacts on redistribution of soil and spatial distribution of soil organic carbon (SOC). Specifically, we explored the use of topographic principal components (TPCs) for characterizing topography metrics and stepwise principal component regression (SPCR) to develop topography-based soil erosion and SOC models at site and watershed scales. Performance of SPCR models was evaluated against stepwise ordinary least square regression (SOLSR) models. Results showed that SPCR models outperformed SOLSR models in predicting soil redistribution rates and SOC density at different spatial scales. Use of TPCs removes potential collinearity between individual input variables, and dimensionality reduction by principal component analysis (PCA) diminishes the risk of overfitting the prediction models. This study proposes a new approach for modeling soil redistribution across various spatial scales. For one application, access to private lands is often limited, and the need to extrapolate findings from representative study sites to larger settings that include private lands can be important.

Landscape processes are critical components of soil formation and play important roles in determining soil properties and spatial structure in landscapes. We propose a new approach using stepwise principal component regression to predict soil redistribution and soil organic carbon across various spatial scales.

Toprak yeniden dağıtım ve toprak organik karbon eşlemek için topografik modellerini ölçekleme için asıl bileşenlerinin kullanımı

Landscape topography is a critical factor affecting soil formation and plays an important role in determining soil properties on the earth surface, as it ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling in soils, to pathogen competition, plant growth promotion, and cross-kingdom signaling. Furthermore, siderophores are also of commercial interest in bioleaching and bioweathering of metal-bearing minerals and ores. A rapid, cost effective, and robust means of quantitatively assessing siderophore production in complex samples is key to identifying important aspects of the ecological ramifications of siderophore activity, including, novel siderophore producing microbes. The method presented here was developed to assess siderophore activity of in-tact microbiome communities, in environmental samples, such as soil or plant tissues. The samples were homogenized and diluted in a modified M9 medium (without Fe), and enrichment cultures were incubated for 3 days. Siderophore production was assessed in samples at 24, 48, and 72 hours (h) using a novel 96-well microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, an adaptation of the traditionally tedious and time-consuming colorimetric method of assessing siderophore activity, performed on individual cultivated microbial isolates. We applied our method to 4 different genotypes/Lines of wheat (Triticum aestivum L.), including Lewjain, Madsen, and PI561725, and PI561727 commonly grown in the inland Pacific Northwest. Siderophore production was clearly impacted by the genotype of wheat, and in the specific types of plant tissues observed. We successfully used our method to rapidly screen for the influence of plant genotype on siderophore production, a key function in terrestrial and aquatic ecosystems. We produced many technical replicates, yielding very reliable statistical differences in soils and within plant tissues. Importantly, the results show the proposed method can be used to rapidly examine siderophore production in complex samples with a high degree of reliability, in a manner that allows communities to be preserved for later work to identify taxa and functional genes.

We present a protocol for rapid screening of environmental samples for siderophore potential contributing to micronutrient bioavailability and turnover in terrestrial systems.

Yüksek işlem hacmi Siderophore filtreleme dışında çevre örnekleri: bitki doku, toplu topraklar ve rizosferde topraklar

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a significant role in plant growth and development by providing strength, rigidity, rate and direction of cell growth, cell shape maintenance, and protection from biotic and abiotic stressors. The cell wall is primarily composed of cellulose, lignin, hemicellulose and pectin. Recently plant cell walls have been targeted for the second-generation biofuel and bioenergy production. Specifically, the cellulose component of the plant cell wall is used for the production of cellulosic ethanol. Estimation of cellulose content of biomass is critical for fundamental and applied cell wall research. The Updegraff method is simple, robust, and the most widely used method for the estimation of crystalline cellulose content of plant biomass. The alcohol insoluble crude cell wall fraction upon treatment with Updegraff reagent eliminates the hemicellulose and lignin fractions. Later, the Updegraff reagent resistant cellulose fraction is subjected to sulfuric acid treatment to hydrolyze the cellulose homopolymer into monomeric glucose units. A regression line is developed using various concentrations of glucose and used to estimate the amount of the glucose released upon cellulose hydrolysis in the experimental samples. Finally, the cellulose content is estimated based on the amount of glucose monomers by colorimetric anthrone assay.

The Updegraff method is the most widely used method for the cellulose estimation. The main purpose of this demonstration is to provide a detailed Updegraff protocol for estimation of cellulose content in plant biomass samples.

Updegraff Yöntemi Kullanılarak Bitki Biyokütlesinin Kristal Selüloz İçeriğinin Tahmini

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...