Yazarlar, teknik yardım için Gilbert Yeşil ederiz. Bu çalışma MGP layık NIAMS / NIH (R01-AR060484) ve DOD (W81XWH-12-1-0555) SmY verilen gelen ve NIH (U24 CA92871 ve U54 CA151838) hibe tarafından desteklenmiştir

Tüm hayvan çalışmaları, Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu düzenlemelerine uygun olarak yapılmıştır. 1.. In vivo İskelet Kollajen Yaptırma Infrared (NIR) Floresans Görüntüleme civarında <ol><li> Kafesli CMP ve kuyruk ven enjeksiyon Foto-aktivasyon <ol><li> Transferi ve enjeksiyon sırasında muhtemel kaybı için ilave bir 10 ul yastık, dozlama için solüsyonun 100 ul: Her bir fare için kafesli CMP çözeltisinin 110 ul (20-30 g fare ağırlığı) hazırlayın. IR680-Ahx-NB (GPO) steril PBS çözeltisi içinde 100 uM sisteinin 11 ul 9 stok çözeltisi (400 uM) ve 11 ul karıştırın, daha sonra 1 x PBS tamponu ile 110 ul toplam hacmi getirmek. Nihai peptid solüsyonu IR680-Ahx-NB (GPO) 9 4 nmol ve 1x PBS çözeltisi 100 ul sisteinin 1 nmol içerir. </li><li> Yavaşça withdradikkatli bir şekilde peptit şeffaf varil ve küçük bir ölçüsü (G 28-30) iğne ile bir 0.5 ml şırıngaya insülin çözeltisi ve w hava kabarcıklarını çıkarmak. Lamba 2-5 dakika boyunca ısınmasını sağlamak için UV lambası açın. </li><li> Foto-aktivasyonuna izin doğrudan 5 dakika için UV lambası (365 nm,&gt; 25 mW / cm 2) altında peptit içeren şırınga yerleştirin. </li><li> Bu arada, ısıtılmış bir lambanın altında bir süzgeç içinde fare konumunu, kuyruk veya kulak etiketi veya ayak dövme gibi diğer tanımlama yöntemleri kalıcı bir kalem ile fare etiket, ve% 70 alkol ile kuyruk dezenfekte. </li><li> Hemen UV aktivasyonundan sonra, tercihen kuyruk arka kısmında, UV-aktif IR680-Ahx-NB (GPO) kuyruk damarına 9 çözeltisi 100 ul enjekte edilir. Enjeksiyondan sonra geri kafesine fare yerleştirin. </li></ol></li><li> Kollajen yeniden aktivite flüoresan NIR görüntüleme <ol><li> SetPearl Impulse 2.0 yazılımı kullanılarak 37 ° C darbe görüntüleyici görüntüleme yatağının ısıtıcı plaka. </li><li> Oksijen% 2 izofluran içeren anestezi indüksiyon odasına çıplak ya da traş fare koyun. Taşıma sırasında ve respirations sıklığını (~ 1/sn) izleyerek fare hareketinin olmaması ile anestezi düzlemde derinliği olun. </li><li> Fare anestezi sonra, İnci görüntüleyici çekmeceyi açın ve görüntüleme yatakta hayvan. Çabuk burun konisi kapağı çıkarıp, görüntüleme işlemi sırasında (burun konisi ile / dak 2 L teslim oksijen izofluran% 2 ile) anestezi altında fare tutmak için burun konisi içine fare namlu kaydırın. Fare yerleştirildikten sonra, çekmeceyi kapatın. </li><li> Enstrüman Image yazılımı panelde &quot;hazır&quot; gösterdiğinde, görüntü elde &quot;düğme&quot; ardından kutuları &quot;&quot; 700 kanal &quot;,&quot; beyaz ışık &quot;ve&quot; 85 mikron tıklayın. NUR (eksitasyon 685 nm, emisyon 720 nm) bird beyaz ışık fotoğraflar daha sonra otomatik odaklama ve pozlama kullanılarak alınacaktır. </li><li> Kayıt tamamlandığında, çekmeceyi açmak fare açın ve başka bir açıdan görüntü kazanır. Fare geri ön (ventral), (dorsal) ya da kamera bakan yanları ile yerleştirilebilir. Sınırlamalar ilgi bölgesi (örneğin göğüs kafesi, ayak bilekleri ve bilekler) en iyi görünümü elde etmek için onun bacaklarda germek gibi bant dar şeritler kullanılabilir. </li><li> IR680-CMP iskelet alımını gözlemlemek için uygun bir zaman dozda (~ 4 nmol / fare) dayalı, 24-96 saat sonrası enjeksiyon (HPI) arasındadır. , Yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde 72 hpi sonra, cerrahi forseps ve makas kullanılarak cilt (ve saç) kaldırmak derin anestezi altında iken servikal dislokasyon ile fare kurban, ve yukarıda anlatıldığı gibi NUR floresan tarafından görüntü o kadar. </li><li> Edinilen NUR floresan görüntüleri analiz. </li></ol></li></ol> 2. Ex vivo kolajenlerin Görselleştirme0; Doku Bölümler <ol><li> Malzeme hazırlığı <ol><li> % 10 1 ml deiyonize su (w / v) BSA çözeltisi hazırlayın. , Oda sıcaklığında bir su banyosu içinde keçi serumu içinde 1 ml çözülme. X 5 cm, yaklaşık 2 cm büyüklüğünde Parafilm birkaç parça kesin. </li><li> Keçi serumu ve 500 ul PBS 10x 1 mi ve iyonu giderilmiş su, 8.5 ml karıştırılarak blokaj tamponu 10 ml hazırlayın. Iyonu giderilmiş su ve 4.45 ml 500 ul PBS ile 10 kat (a / h) BSA,% 10, 50 ul seyreltilmesiyle CMP seyreltme tamponu içinde 5 ml hazırlayın. </li><li> CMP seyreltme tamponu ile 5 mcM, carboxyfluorescein etiketli kafesli CMP, CF NB (GPO) 9 (480 mM) stok çözümleri sulandırmak. Optimal konsantrasyon CMP dokuların tipi ve doku örneklerinin doğasına bağlı olarak 2.5-30 uM arasında değişmektedir. 100 ul&#39;lik bir hacmi, bir doku kesiti slayt lekeleme için tavsiye edilir. Formüle CMP solut MağazaKaranlıkta iyonları. </li><li> Fare kornea dokusu slaytlar oda sıcaklığına muvazene edelim. 5 dakika boyunca 1x PBS tamponu içinde kuluçkaya bırakın. Bu tasvirde kullanılan fare kornea dokular 8 um kalınlığa cryosectioned Tissue-Tek OCT içinde cryo-korunmuş bir ortamda 1 saat, PBS çözeltisi içinde% 4 paraformaldehit ile öneki ve yüklü cam slaytlar üzerine monte edilmiştir. </li></ol></li><li> Doku boyama ve görüntüleme <ol><li> Nemlendirilmiş bir odada slaytlar yerleştirin. Her bir slayt için, bloke etme çözeltisi, 0.5 ml uygulanır ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca slaytlar inkübe edin. Bir kağıt havlu üzerinde kurutma kağıdı ile slaytlar bloke çözüm çıkarın. </li><li> Her slayt doku bölümleri kapsayacak şekilde CF NB (GPO) 9 çözümler yaklaşık 100 ul uygulayın. CMP çözelti dokulara nüfuz izin vermek için 2 dakika boyunca kuluçkaya bırakın. </li><li> UV lambasını açmak. Lamba ısınmış olduğunda, CMP-kaplı doku ortaya seKafesli CMPS korumasını kaldırmak amacıyla, 6 dakika (365 nm, ~ 8 mW / cm 2) için, UV ışığına seksiyonlar. UV maruz kaldıktan sonra, kurumasını önlemek için Parafilm bir parça ile, her slaydın doku bölümleri kapsamaktadır. Nemli bir bölmede slaytlar yerleştirin ve 2 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe. </li><li> 1x PBS DAPI çözeltisinin bir 1:3,000 seyreltme hazırlayın. CMP boyama sonra, forseps ile yavaşça Parafilm kaldırmak ve aşırı CMP çözüm kaldırmak için bir kağıt havlu üzerine slaytlar kurulayın. Her bir doku slayta seyreltildi DAPI çözeltiler, yaklaşık olarak 100 ul uygulanır ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Boyama işleminden sonra, 5 dk için bir boyama kavanoza 1x PBS tamponu içinde slaytlar bırakın. Ilişkisiz boyama ajanları yıkayın taze 1x PBS içinde bu 3x tekrarlayın. </li><li> Doku bölümünde montaj orta bir damla ekleyin ve hava kabarcıklarını yakalama kaçınarak bir cam kapak slip ile örtün. Işıktan korumak için bir karton slayt tepsiye slaytlar koyun. </li><li>Görüntü kolajen şeritleri (FITC kanal) ve hücre çekirdekleri (DAPI kanalı), bir floresans mikroskobu kullanılarak doku slaytlar. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+collagen+strands+by+photo-triggered+triple-helix+hybridization.">Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).</li><li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis:+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease.">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K:+its+skeletal+actions+and+role+as+a+therapeutic+target+in+osteoporosis.">Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).</li><li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts.">et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).</li><li>Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-synthesis+of+a+protease-activatable+collagen+targeting+probe.">Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe.</a> Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+modification+of+collagen+scaffolds+mediated+by+triple+helical+propensity.">Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity.</a> Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).</li><li>B&#228;chinger, H. P., Morris, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+thermal+stability+of+type+II+collagen+in+various+solvents+used+for+reversed-phase+high+performance+chromatography.">Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography.</a> Matrix. 10, 331-338 (1990).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+collagenous+proteins+by+fluorescently+labeled+collagen+mimetic+peptides.">Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides.</a> Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).</li><li>Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-tethered+collagen+mimetic+peptides+for+studying+heterotrimeric+triple-helical+interactions.">Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions.</a> Biopolymers. 95, 94-104 (2011).</li><li>Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-the-resin+N-terminal+modification+of+long+synthetic+peptides.">On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).</li><li>Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+modification+of+collagen+directed+by+collagen+mimetic+peptides.">Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+growth+factors+on+collagen+scaffolds+mediated+by+polyanionic+collagen+mimetic+peptides+and+its+effect+on+endothelial+cell+morphogenesis.">Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis.</a> Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).</li><li>Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-assisted+visualization+of+binding+interactions+between+collagen+mimetic+peptide+and+collagen+fibers.">Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).</li><li>Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-bound+VEGF+mimetic+peptides:+design+and+endothelial+cell+activation+in+collagen+scaffolds.">Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds.</a> Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).</li><li>van Hagen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+radiolabelled+cyclic+DTPA-RGD+analogue+for+tumour+imaging+and+radionuclide+therapy.">Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy.</a> Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).</li><li>Boudko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+propagation+of+the+collagen+triple+helix+in+single-chain+and+trimerized+peptides:+transition+from+third+to+first+order+kinetics.">Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics.</a> J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).</li><li>Ackerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+dependence+of+the+folding+of+collagen-like+peptides.">Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides.</a> J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Brodsky, B., Persikov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+collagen+triple+helix.">Molecular structure of the collagen triple helix.</a> Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Bu protokolde görülebileceği gibi kafesli cmps UV-etkinleştirme ortak kuyruk damarından enjeksiyon protokolleri 19 için tek ek bir adım olduğu için, CMP teslim basittir. Anahtar bir Uncaged ve meta-kararlı tek kordonlu halde peptit probları enjekte etmektir. Kafes grup kendi kendine düzeneğinden CMP engeller ve CMP üçlü sarmal halinde katlanmasına başladığı noktada UV ışığı ile çıkarılır kadar kolajenler (Şekil 2B) bağlanması. Enjeksiyon formülasyon hızlı bir şekilde en aza indirmek için bir toksisite şekilde UV ışınlaması sırasında yarılmış kafes grubu ile tepkimeye girebilen, sistein içerir. Farklı suşları (örneğin, SKH-1 ve DR-1) ile çok sayıda farenin bu formülasyon kullanılarak test edilmiş ve altı aya kadar bu farelerde herhangi bir davranış ya da sağlık kusurları tespit etmedi. Enjeksiyon UV ışınlarına maruz hemen sonra takip etmezse, CMPS hiçbir melezleme kapasitesine sahip olduğu, homotrimeric üçlü sarmaldan içine kat edecek. Şekil 2C enjeksiyondan önce CMPS tamamen uzun gecikme süresi (&gt; 2 gün) ile üçlü sarmaldan takıldı edildi aşırı durum göstermektedir. Bu sorunu aşmak için, CMP solüsyon nispeten düşük bir konsantrasyonda (örneğin ~ 40 uM) hazırlandı ve hemen UV-decaging sonra farelere enjekte edilmelidir. Çünkü seyreltik koşullarda CMPS yavaş üçlü sarmal katlanır oranı (sarmallamanın yarım saati:&gt; 50 dk) ve kısa UV ışınlarına maruz kalma ve enjeksiyon süresi (5 ~ 7 dakika toplam), CMPS çoğunda tek kan dolaşımına Bu protokol takip edildiğinde formu iplikçik. Konsantrasyon, yeniden toplama oranı 18 dramatik azalmasına yol açan, kan havuzu içinde 20 kat azaltılır gibi bir kez enjekte edilmiş, CMPS, tek şeritler olarak kalması beklenmektedir. Enjeksiyon gecikir (örn. hayvan taşıma için) ve homotrimeric doğallaşım şüpheleniliyorsa, kısmen monte peptidler 70 üzerinde ısıtılarak sokulabilir76; C istemi soğutma ve enjeksiyon ardından tek-lifler, için CMPS ayırmak. Daha az elverişli olsa da, bu tür ısı ile ayrışmış cmps da (Şekil 2B) in vivo hedeflenmesinde beklenen sonuçları göstermektedir. NIR sinyalin% 50&#39;ye varan saç tarafından bloke edilebilir, çünkü bu tanıtımda, çıplak farenin NIR flüoresan görüntüleme için kullanılmıştır. Saçlı fare modellerinde (siyah kıllar özellikle olanlar) ile çalışırken, biz bir elektrikli tıraş makinesi veya saç çıkarıcı kullanarak önce görüntüleme ilgi bölgesinde fareyi tıraş öneririz. Şekil 1 &#39;de, hayvan diyet klorofil otomatik floresans neden olduğu hayvanın karın bölgesi, yanlış pozitif sinyaller vardır. Bu arka plan sinyalleri önemli ölçüde yaklaşık 4 gün önce görüntüleme saflaştırılmış diyetler için fareyi geçerek düşürülebilir. Şekiller 1 ve 2A &#39;de görüldüğü gibi, güçlü CMP yutaklar kuyruk spin vardıre. Bu nedenle, mükemmel olmayan bir kuyruk ven enjeksiyonları kaynaklanan sonuçları engellemek için, enjeksiyon yerinde floresan görüntü yakalanan değildir, böylece kuyruk arka kısmında enjekte önerilir. Etiketli CMP başka yöntemler kullanılarak tespit edilmesi zor olan in vivo kolajen yeniden belirli konumların hedefleme ve görüntüleme sağlar. Örneğin, ELISA-temelli kan ve idrar analizleri yarılmış telopeptid kollajen fragmanları için duyarlıdır ancak bu Çözülebilir antijenleri hedef için bir yöntem olup, kolajen devir kaynağını tespit edemez. NIR kullanarak in vivo görüntüleme tekniğinin temel sınırlamalar hemoglobin 680/710 nm NIR boyaların bir endojen söndürücü olarak CMPS yakın toplanmış kırmızı hücreleri tarafından derinliği penetrasyon zayıflama ve söndürme işaretlenmiştir. In vivo görüntüleme CMP geleceği uygulamaları doğrudan gama yayan radyoaktif ya da pozitron emi ile etiketlenmiş cmps kullanılarak SPECT veya PET görüntüleme dahiltters, kollajen remodeling (örneğin osteoporoz, artrit, ateroskleroz, ve fibrozis) ilgili hastalık durumlarının teşhis için. Bu radyo-etiketli CMP analoglan doku derinliği ve toplanmış kırmızı hücrelerin varlığı nedeniyle sinyal kaybı sınırlamaları ortadan kaldırır ve hastalıklı dokuların niceliksel ölçümler sağlayacaktır. Buna ek olarak, görece geç görüntüleme süresi (örneğin 48-96 HPI) CMPS yavaş bağlanma ve açıklık kaynaklanan zor kollajenin yeniden hızlı değişimleri takip yapabilir. Böyle bir sınırlama bağlayıcı kinetik ve CMP görüntüleme ajanları afinite daha mühendisliği ile aşılabilir. CMP küçük bir yapıya sahip denatüre kolajenlerin bağlanan bu yana, CMP-kollajen bazlı görüntüleme yalnızca görüntü kolajen lifleri 5 ikinci harmonik üretimi mikroskopi tamamlayıcıdır. Floresan etiketli CMPS ile doku bölümleri boyama, biz bunu yararlı kuluçkaya bulundu4 ° C de UV-aktif peptit Çözeltilerin örnekleri üçlü sarmal melezleştirme düşük bir sıcaklıkta 1,20 da kolaylaşır çünkü. Ayrıca, boyama kavanoza taze PBS tamponu içinde slaytlar çeker sadece örnek üzerinde yıkama tamponları pipetle çok daha iyi çalıştığı, bağlanmamış cmps yıkamak için en etkili yol olduğu bulunmuştur. CMP-kollajen lif hibridizasyon çok özel ve sağlam olan ve bu nedenle bu video yer alan basit boyama protokolü kolaylıkla ilave belirteçler costaining değiştirilmiş ve sabitlenmemiş doku bölümlerinde bozulmuş kolajenleri belirlenmesi için olabilir. Bu çeşitli histolojik örneklerde lifli kolajenleri tespit etmek için bir anti-kollajen antikorların kullanıldığı için etkili ve uygun bir alternatiftir.

Kollajen, memelide en bol bulunan protein, proliferasyonunu ve hücre farklılaşmasını destekleyerek doku gelişimi ve rejenerasyonda önemli bir rol oynar. Lifli kolajenler (örneğin tip I, II), bağ dokularda dokulara mekanik mukavemet verirken, ağ-benzeri kolajen (IV tipi) hücreleri takmak ve organize dokulardan bazal membran temel iskelesi oluşturur. Kolajen kollajen yeniden bozulmasını (proteazlar tarafından) ve sentez (büyüme faktörleri tarafından teşvik) hem de içerir. Kollajen yeniden, kemik, örneğin, normal doku yenileme işlemi, fazla yeniden aktivitesi veya anormal yerlerde oluşun bir parçası olmasına rağmen, genellikle yara gösteren bir yaralanma ya da kanser, osteoporoz, artrit gibi kronik patolojik koşullara yanıt iyileştirici ve fibroz 1-4. Doğrudan görüntü kollajenleri in vivo biçimlenme geçiyor yeteneği ilerleme anlaşılmasına neden olabilirBu hastalıkların iyon, hem de yeni teşhis ve tedavi. Örneğin, canlı bir görüntüleme şiddeti ve hastalıkların konumu hakkında bilgi sağlar ve aynı zamanda yeni terapötik ajanların etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Multiphoton lazer tarama mikroskobu ve ikinci harmonik üretimi canlı farelerde 5 tümör hücre dışı matris yeniden izlenmesi için görüntü fibril kolajenlerin uygulanmıştır. Ancak, bu teknik invaziv bir işlemdir ki, şeffaf dorsal deri kıvrım odaları ile monte edilecek hayvanlar gerektirir. Kollajenin yeniden Doğrudan ve noninvaziv görüntüleme özellikle biçimlenme geçiyor kolajen hedefleyen bir prob yararlanacaktır. Bu prob bu da normal dokular 6 bol olan sağlam ve olgun kolajenlerin gelen yeniden kolajenleri ayırt etmek gerekir çünkü hazırlamak zordur. Kollajen olan üçlü helis adlandırılan son derece nadir protein yapısı oluşurörneğin kollajen yeniden sırasında matris metaloproteinaz (MMP) olarak proteazlar tarafından ayrılır. Ayrıldı, kollajen fragmanlarının kendi üçlü sarmal yapısını kaybeder ve daha özel olmayan proteazlar tarafından sindirilir 1 katlanmamış şeritler (jelatin) hale gelir. Yakın zamanda, üçlü sarmal yapısına katlanması için bir eğilime sahip olması, kollajen taklit peptid (CMP) özel olarak bir ya da ısı denatürasyonu ile ya da enzimatik bozulmaya 1.7 tarafından üçlü sarmal durumundan ayrışmış kollajen ipliklerini hedef olabilir keşfedilmiştir. Bağlanma, birincil olarak monomerik cmps ve denatüre edilmiş kolajen şeritlerin arasındaki üçlü sarmal hibridizasyonu ile tahrik edilir. CMPS kollajen melezleme, bir kafes CMP için biraz itici kuvvet ile oda sıcaklığında homotrimeric üçlü sarmaldan içine kendini monte çünkü [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, NB (GPO) 9 olarak belirlenmiş, O: hidroksiprolin] geliştirildi hangi fotoğraf bölünebilir nitrobenzili içeriyorgrubu (NB) peptidin merkezi glisin eklenmiş. NB kafes grubu sterik olarak üçlü sarmal içine katlanır gelen CMP önler, ama UV ışınlaması ile kafes grubunun çıkarılması hemen üçlü sarmal kollajen katlama ve hibridizasyon 1 tetikler. Yakın kızılötesi (NIR) flüoroforlar ile etiketlenmiş monomerik CMPS sistemik fareler model teslim edilir, onlar özellikle hedef ve normal (örneğin kemik ve kıkırdak) geçiren dokularda ve patolojik (örn. tümörlerde) 1 remodellinglerinde denatüre kolajenlerin in vivo görüntüleme izin verebilir . Floresan etiketli CMPS, aynı zamanda histolojik doku kesitlerinde in kolajenleri görüntülenmesi için kullanılabilir. Histolojik çalışmada, hasat dokusu sık sık hücresel bileşenleri ve bozulmalara karşı genel doku morfolojisi tutmak için tespit ile korunur. Isı ve organik çözücüler ile tedavi, kimyasal çapraz linkin içerir sabitleme işlemleri,g reaktifler (örneğin paraformaldehit), kolajen 8&#39;deki üçlü sarmal yapısını denatüre. Bu, denaturasyon CMP hibridizasyon için bölgeler oluşturur. O floresan etiketli cmps spesifik olarak, hatta daha etkili bir fibrotik karaciğer dokularında 9 patolojik koşulların belirlenmesi kolay izin verilen bir anti-kollajen antikoru, daha sabit bir doku kesitlerinde in kolajenlerin için (örneğin, deri, kornea, kemik ve) bağlanabildiği gösterilmiştir. CMP kolajenlerin her türlü için ortak olan üçlü helis motifi amino asit sekansını ihtiva eden denatüre kolajen şeritleri hedefliyor. Bu nedenle CMP geniş spektrumlu bir kolajen boyama madde olarak kabul edilebilir. Burada, floresan etiketli kafesli cmps kullanılarak in vivo denatüre kolajen şeritleri ve ex vivo doku kesitlerinde in ii) görselleştirme kolajenleri görüntüleme i) için ayrıntılı deneysel prosedürler mevcut. A NUR etiketi, IR680, canlı görüntüleme, whil için kafesli CMP konjuge edildiE carboxyfluorescein (CF), standart floresan mikroskoplar ile uyumluluk için doku boyama çalışmalarında kullanılmıştır. Bu protokol kollajenin yeniden ile ilgili olarak CMPS görüntüleme uygulaması üzerinde duruluyor. CMP sentezi için yöntemler, daha önceki raporlarda 1,7,9-15 bulunabilir. Bu ekran raporda, normal farelerde ve fare kornea dokusu bölümlerinde görüntüleme iskelet dokular gösteri amacıyla seçilmiştir, burada sunulan yöntemler hali hazırda olduğu gibi, kollajen yeniden (örneğin, tümörler, yara iyileşmesi) içeren pek çok patoloji ve biyolojik modeller uygulanabilir Ancak iyi kolajenleri içeren hemen hemen her öneki doku numunesi olarak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IRdye 680RD Maleimide (IR680)</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">929-71050</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5(6)-Carboxyfluorescein</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">21877-5G-F</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Advanced Chemtech</td>
			<td style="width:137px;">YC2200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Butler Veterinary Supply</td>
			<td style="width:137px;">4/4/5260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">G9023-10ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:137px;">10236276001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluoroshield mounting medium</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">F6182-20ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:643px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:137px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:123px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:137px;">1447T17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Pearl impulse imager</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">9400</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Surgical forceps and scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EasyDip slide staining system</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;">M900-12B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">20-place cardboard microscope slide tray</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-545-c</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;">Eclipse TE2000-E</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides

Kollajen doku oluşumu ve bakım destekleyen hücre dışı matrisin önemli bir yapısal bileşendir. Kollajen yeniden normal doku yenilenmesi ayrılmaz bir parçası olmasına rağmen, yeniden aktivitesinin aşırı miktarda tümörler, artrit ve diğer birçok patolojik şartlarda yer almaktadır. Kollajen yeniden sırasında, kollajen moleküllerinin üçlü sarmal yapının hücre dışı ortamda proteazlar tarafından bozulur. Buna ek olarak, pek çok histolojik doku numuneleri içinde bulunan kollajen kısmen sabitleme ve muhafaza işlemleri ile denatüre edilir. Bu nedenle, bu denatüre kolajen iplikler biyolojik görüntüleme için etkin hedefler olarak hizmet edebilir. Daha önce verilmedi tetiklenen kolajenlerin özgüdür üçlü sarmal yapı oluşturarak denatüre kollajen şeritler ile hibridize olabilir kafesli bir kollajen peptidini mimetik (CMP) geliştirdi. Bu işlemin genel hedefler denatüre kollajen iplikçikler r görüntüye) i vardırin vivo olarak, normal yeniden faaliyetlerinden esulting ve ii) verilmedi tetiklenen kafesli cmps kullanılarak ex vivo doku kesitlerinde in kolajenleri görselleştirmek için. Etkili melezleme ve in vivo ve ex vivo görüntüleme başarılı elde edilmesi için, floresan etiketli Kafesli CMPS verilmedi-aktif ya da damar içi enjeksiyon hemen önce, ya da doğrudan doku bölümleri üzerinde aktif hale gelir. Sabitlenmiş bir fare kornea doku kesitlerinde çıplak fareler ve kollajen liflerin normal iskelet kollajen remolding bu prosedürde görüntülenmiş. Burada yer alan CMP-kollajen hibridizasyon teknolojisine dayalı bir görüntüleme yöntemi, doku yeniden modelleme süreci daha iyi anlaşılmasına yol açan, hem de yüksek bir kollajen yeniden aktivitesi ile bağlantılı hastalıklar için yeni teşhis geliştirilmesini izin verebilir.

Şekil 1 fotoğraf tetiklenen IR680-Ahx-(GPO) 9 24-96 saat sonrası enjeksiyondan sonra sağlıklı bir kadın SKH1 fareye nasıl dağıtır tipik bir sonucu gösterir. Bu bağlanmamış peptidler en büyük ölçüde temizlendi edildiği noktada, 24 hpi sonra iskelette belirgin CMP birikimini gösterir. Kollajen yeniden şeritlerin ile hibridize CMP bir işlem, özellikle, diğer peptid görüntüleme problar (örneğin, RGD 16) aksine olarak, nispeten düşük görünmektedir. Bu, büyük ihtimalle, çünkü üçlü sarmal kollajen 17,18 yavaş katlama oranına sahiptir. Sadece hafif bir azalma sinyal HPI 24 (Şekil 1) sonra görüldüğü gibi Ancak, bir kez hibridize, CMP şeritler güçlü, kollajen dokularının bağlanmıştır. 96 hpi anda, deri çıkarıldıktan sonra fare NUR floresan görüntü net IR680-Ahx-(GPO) ve iskelet alımım omurga ve kaburga de, yanı sıra dizlerinin içindeki 9, ayak bilekleri,Bilekler ve alt çene kemiklerini (Şekil 2A). Ex vivo doku lekeleme olarak verilmedi tetiklenen floresan etiketli kafesli cmps özellikle doku kesitlerinde in denatüre kollajen şeritlerin hibridize olur. Şekil 3&#39;te, CMP boyama açık bir şekilde spesifik boyama kolajen ajan olarak kullanımını gösterir kornea stroma, en ince paralel kolajen fibrilleri ortaya koymaktadır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> Şekil 1. Çıplak fare Seri NUR floresan görüntüler 9 dört gün boyunca iskelet alımını gösteren fotoğraf-decaged IR680-Ahx-(GPO) ile intravenöz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width fo = &quot;4in:&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2. Fotoğraf-decaged IR680-Ahx-(GPO) uygulanan farelerin NUR floresan görüntüleri 9 (A), UV ışınlarına maruz kalma (B) olmadan IR680-Ahx-NB (GPO) 9 kafesli, üçlü sarmal [IR680-Ahx-(GPO önceden katlanmış CMP ile çıkarılmasından sonra cilt 96 HPI at) 9] 3 (C), ya da ısı ayrışmış tek kordonlu IR680-Ahx-(GPO) 9 (D). İskelet hedefleme sadece A ve D&#39;de gözlemlenebilir. NUR floresan sinyalleri gökkuşağı cetvelinde gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> Şekil 3,. Fare co Floresan mikrograflarrneal doku bölümünde paraformaldehitte öneki ve DAPI ve fotoğraf tetiklenen CF (GPO) ile boyandı 9, Protokolü 2 kullanılarak (yeşil CMP ile boyandı) yoğun kollajen dokudan görüntüleme yanı sıra mavi hücresel epitel ve endotel (DAPI ile boyanmış, ) (ölçek çubuğu: 100 mikron).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides at JoVE.com

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Bu prosedür, IR floresan in farelerde kollagen yeniden faaliyetleri görüntüleme hem de denatüre edilmiş kolajen sarmalları ile melezleşmek için verilmedi tetiklenen olabilir kafesli kollajen mimetik peptitler kullanılarak, doku kesitlerinde kolajenlerin ex vivo boyanması yakın in vivo gösterilmiştir.

Doğallığı Kollajen Tellerinin Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kafesli Kollajen Mimetik Peptidlerinin Fotoğraf-tetiklenen Hybridization yoluyla

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

imaging-denatured-collagen-strands-vivo-ex-vivo-via-photo-triggered

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

11.8K Görüntüleme.  University of Utah.  Bu prosedür, IR floresan in farelerde kollagen yeniden faaliyetleri görüntüleme hem de denatüre edilmiş kolajen sarmalları ile melezleşmek için verilmedi tetiklenen olabilir kafesli kollajen mimetik peptitler kullanılarak, doku kesitlerinde kolajenlerin ex vivo boyanması yakın in vivo gösterilmiştir. 

Video: Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Biyomühendislik

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

Normal ve Anormal İnsan Hematopoezin ex vivo Mimicry

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

Yerli, Fibröz Uzun Aralığı ve Bölümlere Uzun Aralığı Kollajen in vitro sentezi olarak

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Microtissue Sabitleme için mikroakışkan Cihazlar Katman-katman Kolajen Biriktirme

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Curvelet Transform Tabanlı Araçlarla Fibrillar Kollajen Organizasyonunu Ölçme

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...

The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies

The chicken embryo and the blood-vessel rich chorioallantoic membrane (CAM) is a valuable in vivo model to investigate biomedical processes, new ultrasound pulsing schemes, or novel transducers for contrast-enhanced ultrasound imaging and microbubble-mediated drug delivery. The reasons for this are the accessibility of the embryo and vessel network of the CAM as well as the low costs of the model. An important step to get access to the embryo and CAM vessels is to take the egg content out of the eggshell. In this protocol, three methods for taking the content out of the eggshell between day 5 and&#160;8 of incubation are described thus allowing the embryos to develop inside the eggshell up to these days. The described methods only require simple tools and equipment and yield a higher survival success rate of 90% for 5-day, 75% for 6-day, 50% for 7-day, and 60% for 8-day old incubated eggs in comparison to ex ovo cultured embryos (~50%). The protocol also describes how to inject cavitation nuclei, such as microbubbles, into the CAM vascular system, how to separate the membrane containing the embryo and CAM from the rest of the egg content for optically transparent studies, and how to use the chicken embryo and CAM in a variety of short-term ultrasound experiments. The in vivo&#160;chicken embryo and CAM model is extremely relevant to investigate novel imaging protocols, ultrasound contrast agents, and ultrasound pulsing schemes for contrast-enhanced ultrasound imaging, and to unravel the mechanisms of ultrasound-mediated drug delivery.

This protocol describes three methods on how to obtain and use 5 to 8-day old chicken embryos and their chorioallantoic membrane (CAM) as an in vivo&#160;model to study contrast-enhanced ultrasound imaging and microbubble-mediated drug delivery.

Kontrastlı Ultrason Görüntüleme ve Mikrokabarcık Aracılı İlaç Dağıtım Çalışmaları için Tavuk Ex Ovo Embriyolarının ve Korioallantoik Membran Damarlarının In Vivo Model Olarak Hazırlanması