Bu çalışma AMK Choi NIH hibe P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, tarafından desteklenmiştir. S. Ryter Lovelace Solunum Araştırma Enstitüsü maaş destek aldı.

Not: Brigham ve Kadın Hastanesi / Harvard Tıp Fakültesi Bölgesinde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu aşağıdaki prosedürleri onayladı. 1.. Çekal ligasyon ve Delinme Aynı arka plan fareler kullanın (C57BI / 6), 8-10 haftalık erkek. Erkek fareler sepsis tarafından başlatılan ölümlerden karşı erkeklere göre daha dayanıklıdır. 8 haftadan daha eski Fareler ÇLD&#39;den sağkalım açısından genç farelerde daha az değişken sonuçlar üretir. Yaklaşık N karşılaştırıldığında, grup başına 10 fare hayatta kalma analizleri için kullanılmalıdır =. N = 3-5 farenin autophagy deneyleri için yeterlidir. <ol><li> Kemirgen cerrahi için uygun olmalıdır steril küçük cerrahi aletler (yani neşter, makas ve künt anatomik forseps) kullanın. </li><li> Anestezi karışım hazırlayın: PBS içinde 7.95 ml&#39;lik Xylazine (AnaSed enjeksiyonu 100 mg / ml) 150 ul ve Ketamine (Ketaset 700 ul ekle &#160; CIII, 100 mg / ml). </li><li> İşlem sırasında aseptik koşulların sağlanması için, eldiven, yüz maskesi ve cerrahi önlük giyerler. </li><li> Hayvanlar tartılır. Intraperitoneal yolla enjekte bunları anestezi (ip) ul (10x g vücut ağırlığı) arasında bir dozda uygulanması için adım 3&#39;te söz konusu karışım,. Örneğin, 22 g ağırlığında bir fare için, anestezi karışımın 10x22 = 220 ul yönetmek. Bu nedenle, Xylazine ve Ketamin nihai doz 17 ve 80 mg / kg vücut ağırlığı, sırasıyla. Bu anestezi yeterli olduğundan emin; ekstremite hiçbir fleksiyon ayak tutam sonra üretilen gerektiğini unutmayın:. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri oftalmik merhem kullanın. </li><li> Sırtlarında temiz bir çalışma yüzeyi üzerine hayvanları yerleştirin. Kuyruklar ve arka pençeleri araştırmacının yöneliktir. . Alkol (% 70 EtOH çözelti) Not kullanılarak karın cildi dezenfekte: Cerrahi alan tamamen temas yoluyla yaranın kirlenmesini önlemek için, traş edilmelidirkürk. Ayrıca, en iyi şekilde, bir sıcak su sirkülasyon ped ameliyat sırasında, anestezi uygulanmış farelerde normotermi korumak için kullanılmalıdır. </li><li> Bir neşter kullanılarak, küçük bir cilt kesisi boyuna paralel yapmak ve yaklaşık 1 cm orta hat bıraktı. Periton boşluğu içine henüz nüfuz etme. Ilk kesi uzatmak için küçük bir makas kullanın. </li><li> Karın kasları tanımlamak ve periton boşluğuna erişmek için bunları incelemek. </li><li> Künt anatomik forseps kullanarak, çekum belirlemek ve periton boşluğuna dışına taşıyın. (Bu öldürücü kanamaya yol açabilir) mesenteryal kan damarlarına zarar vermemek için dikkatli olun. </li><li> Bir orta dereceli sepsis ulaşmak için çekum% 60 Arter. Eşit veya düşük dereceli sepsiste çekum sonuç az% 25 bağlanması ise eşit veya çekum fazla% 75 bağlanması genel olarak, yüksek dereceli sepsis ile sonuçlanır. Ileoçekal valf (bu bağırsak devamlılığını engellemek olabilir) bağlanması için değil dikkatli olun. </li><li> A kullanarak21 G iğne, ligasyon yakın bir ile-ve-through delinme (iki delik) tarafından çekum perfore. Perforasyon yönü mezenterik gelen çekum anti-mezenterik tarafında olmalıdır. Mesenteryal kan damarlarını delmek için dikkatli olun. </li><li> İğneyi çıkarın. Yavaşça iki deliklerden açıklığını onaylamak için lige çekum sıkmak; dışkıların sadece küçük bir miktar bunların ekstrüde olmalıdır. </li><li> Periton boşluğu içine bağlanmış olan ve delinir çekum hareket ettirin. Not: sahte fareler için, adımları 1,10-1,12 atlayın. </li><li> Karın kaslarını kapatmak için kesici iğne ile ipek cerrahi dikişlerle 6-0 kullanın. Karın cilt kapatmak için kesici iğne ile ipek cerrahi dikişlerle 6-0 kullanın. </li><li> Isı ve işlem sırasında kaybolan hidrasyon yerine önceden ısıtılmış 1 ml (37 ° C) serum fizyolojik ip enjekte edilir. Onların resüsitasyon kadar bir ısı lambası altında fareler yerleştirin Not:. Optimal, daha güvenli bir ısınma cihazı (sudolaşımlı bir sıcak su pedi) ve ch yerine bir ısı lambası kullanılabilir. </li><li> Postoperatif analjezi elde etmek için (. 0.05 mg / kg vücut ağırlığı sc) Buprenorphin enjekte Not:. O sternum yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar bir hayvan sahipsiz bırakılmamalıdır. Bir cerrahi tedavi geçirmiş bir hayvan tamamen iyileşti kadar diğer hayvanların şirkete iade edilmemelidir. </li><li> Yiyecek ve su sınırsız erişim ile tekrar kafeslerine hayvanlar koyun. Onlar (örneğin dokunduğunda hareket başarısızlık veya siyanoz gibi klinik belirtiler ile gösterilir) can çekişmekte zaman fareler ötenazi olacaktır. Onları önce ötanazi ölmek zorunda kalmamak için, farelere her 4 saat edin. </li></ol> 2. Doku Hasat ve Fiksasyon <ol><li> % 4 paraformaldehid (PFA) çözeltisi hazırlayın: 889 ml için PBS% 37 PFA 111 ml ekleyin. </li><li> CO 2-kaynaklı narkoz veya Ketamin / Xylazine s kullanarak fareler Kurbanyüksek dozda olution. </li><li> Temiz bir çalışma yüzeyi üzerine fareler hareketsiz. Bunu dezenfekte etmek için% 70 EtOH solüsyonu ile karın ve torasik cilt püskürtün. </li><li> Karın ve göğüs cilt yanı sıra trakeal alanı kapsayan cilt kaldırmak için bir neşter ve küçük bir makas kullanın. </li><li> Çevresindeki dokular (kas ve bağ dokusu) kaldırarak trakea ortaya koymaktadır. </li><li> Trakea etrafında (kesici iğne olmadan) bir dikiş yerleştirin. Henüz sıkmayın. </li><li> &#39;Entübe&#39; trakea küçük bir periferik venöz kateter (20 G) kullanın. Trakeal gözyaşı önlemek için kateter yerleştirilmesi sırasında dikkatli olun. Trakea en büyük çapı sadece Krikoid kıkırdak altında olduğuna dikkat edin. </li><li> Trakea / kateter etrafında dikiş sıkın. Trakea içine kateterin sadece plastik kanül bırakarak iğne çıkarın. İğne plastik kanül yerleştirilmesi için bir kılavuz teli olarak sadece görev yaptı. </li><li> Trakea içine plastik kanül tespit ettikten sonra, Şe abdominal kas, karın açmak ve diyaframı ortaya. </li><li> Bir iğne kullanarak, pnömotoraks (plevra boşluğuna havanın yani ekleme) üretmek için diyaframı delinme. Akciğerler sonra çökmüş olmalıdır. </li><li> Küçük bir makas kullanarak, sternum (sternotomi) boyunca kesilir diyafram, kaldırmak, göğüs kafesini çıkarmak ve kalp ve akciğerler ortaya. </li><li> Trakea içine yerleştirilen plastik kanül aracılığıyla, 30 cm H2O basınç altında formaldehid çözeltisi ile akciğerlere sabitleyin. </li><li> Akciğerleri çıkarın ve 24 saat ve daha sonra% 70 EtOH çözüm için% 4 PFA içine yerleştirin işleme kadar. </li><li> Kalp, karaciğer ve böbrekleri belirlemek ve kaldırmak. Aynı şekilde, işlenene kadar% 70 EtOH solüsyonu, daha sonra, 24 saat için% 4 PFA içine yerleştirin ve. </li></ol> 3. GFP Fareler ve GFP Slaytlar görüntüleniyor <ol><li> Adım 1 ve postoperatif prosedürde açıklandığı gibi GFP-LC3 fareler üzerinde CLP ve sahte ameliyatıs protokol aşama 2&#39;de tarif edildiği gibi. </li><li> Parafin içinde dokular (yani akciğerler, kalp, karaciğer ve böbrekler) gömmek ve seri 5 mikron bölümlerde onları kesti. </li><li> Parafin erir ve doku yarı saydam görünür kadar, 30-60 dakika boyunca 60 ° C&#39;de inkübe zaman GFP boyanması için hazır. </li><li> Ksilen veya ksilen yerine, 5 dakika ksilen 1, ksilen, 2, 3 ve ksilen standart kademeli dizi Deparaffinize sonra kademeli EtOH içinde seri 3 dakika bekletme: sonra% 100,% 95,% 75, ve distile su ile yıkayın. Not: Parafinden arındırma lamların örnek background artar doku kuruma, kaçının sonra. </li><li> 10-20 dakika boyunca mikrodalga ile, sitrik asit tamponu (10 mM sodyum sitrat asit,% 0.05 Tween 20, pH 6.0) kullanılarak antijen alma yapın. Doku kuruma önlemek için periyodik tampon değiştirmek için dikkatli olun. </li><li> Çözüm antijen alımı tamamlamak için bankta 20 dakika soğumasını bekleyin. </li><li> PBS ile 2-3 kez yıkayın. Aşırı tamponu ve tra kaldırnsfer slayt kutusu ya da kuruma önlemek için başka bir nemlendirilmiş bir odada yatay konuma raftan kayar. </li><li> % 10 normal eşek serumu (ayrıca% 5 sığır serumu albümini ya da ikincil antikor elde edildiği hayvan, tercihen serum) PBS içinde, oda sıcaklığında 45-60 dakika bloke eder. </li><li> Nemlendirilmiş bir odada 4 ° C&#39;de gece boyunca PBS içerisinde 1:100 seyreltide GFP primer antikor içinde inkübe edin. Hafifçe doku ile temas homojen teşvik etmek ve buharlaşmayı önlemek için bir antikor ile doku üzerinde Parafilm küçük parçalar halinde uygulanır. Not: Geri kalan aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilir. </li><li> Primer antikor fazlasını uzaklaştırmak için PBS ile 5x yıkayın. Oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca PBS içinde sekonder antikor 1:500-1:1,000 kuluçkalayın. </li><li> Fazla ikinci antikorları ayıklamak için PBS ile 5x yıkayın. Eğer istenirse, bu aşamada slaytlar counterstain. </li><li> Floresan ikincil antikor kullanılarak ise% 70 EtOH f içinde% 0.1 Sudan Siyah inkübeya da 15-20 dk otoflüoresanı azaltmak için. Doku etrafında aşırı Sudan Siyah silin ve 20 dakika boyunca PBS ile 5x yıkayın. </li><li> Lamel ile örnek ve montaj çözüm seti kadar, yatay depolar. </li></ol> 4. Alternatif Protokol: GFP-LC3 doğrudan algılama <ol><li> 50/50 v / v Ekim PBS bir ~ 500 ml cannulate ve şişirmek akciğerler. </li><li> Bir cryomold dibinde Ekim küçük bir miktar koyarak Ekim gömün. </li><li> Dikkatlice kalıpta kesilmiş akciğer kompleksi yerleştirin. </li><li> Metilbutane kuru buz kullanılarak soğutulmuş yavaş yavaş dondurma. </li><li> Doku tamamen kapalı ve katı donmuş kadar daha Ekim ekleyin. -80 ° C&#39;de kuru buz ve mağaza devam </li><li> Bir cryomicrotome kullanarak, ışıktan bölümlerinin korunması 5-10 mikron kalınlığında kesitler kesti. Mağaza bölümleri ve -80 ° C&#39;de kalan doku </li><li> , Görüntüleme için slaytları dondurucu kısmını çıkarın ve hemen kurumasını önlemek için PBS bir damla uygulamak için. </li><li> % 4 PFA ile 30 dakika için düzelt. PBS ile yıkayın. </li><li> 10 dakika için DAPI / Hoescht uygulanır. 3 kez PBS ile yıkayın. </li><li> Lamel ile örnek ve montaj çözüm seti kadar, yatay depolar. </li><li> Epifloresans veya konfokal mikroskop kullanılarak görüntü. Kadar bir ay boyunca 4 ° C&#39;de saklayın örnekleri. </li></ol> 5. Elektron Mikroskopi Doku hazırlanması <ol><li> Sabitlemek için yaklaşık olarak 1 mm küpler halinde dokuları kesin. </li><li> 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH 7.4 içinde% 2 formaldehid,% 2.5 glutaraldehid içinde doku düzeltildi. </li><li> 1-2 saat süre ile 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ile yıkayın. Not: Sabit doku, 4 ° C&#39;de 0.1 M sodyum kakodilat içinde saklanabilir </li><li> 1 saat süre ile 0.2 M sodyum kakodilat tampon içinde% 1 ozmiyum tetroksit içinde düzeltmeyi Gönderin. </li><li> 10 dakika boyunca 3 x 0.2 M sodyum kakodilat tampon maddesi içinde durulayın. </li><li> % 70 EtOH, 20 dakika 2x kurutmak. % 90 EtOH, 10 dakika 2x kurutmak. % 100 EtOH içinde kurutmak,20 dakika 2x. </li><li> 10 dakika için 2X propilen oksit (epoksi propan) ile inkübe edin. </li><li> 1 saat süre ile propilen oksit / epoksi reçine karışımı (50:50) ile inkübe edin. Epoksi reçine karışımı: 24 g Agar 100 reçinesi, 13 g, dodesenilsüksinik anhidrit, 13 g metilnadik anhidrit ve 1 ml N-benzil dimetilamin. Ahşap bir spatula kullanılarak atılabilir bir beher içinde iyice karıştırın. </li><li> Kapağını açıp şişelere Epoksi reçine gece boyunca (bu, geri kalan herhangi bir propilen oksit buharlaşmasına izin verir) ile inkübe edin. </li><li> Taze hazırlanmış reçine ile etiketlenmiş kapsül gömme. 48 saat boyunca 60 ° C&#39;de polimerize olurlar. </li><li> Elektron mikroskobu film üzerine 80 ya da 60 kV, bir transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak Fotoğraf doku kesitleri. Fotoğrafik kağıda görüntüleri yazdırmak ya da dijital medya saklamak. </li><li> Çekirdeğini içeren sağlam hücrelerde autophagosome oluşumu analiz edin. Düşük enerji alanları (e. G. 2000-4000 X) çekirdekli hücreleri belirlemek için kullanılabilir. Tipik 6,800-10,000 X görüntüleri th için kullanılırautophagosome miktar olduğunu. Uygun istatistiksel temsil için 15-30 alanlarda birim alan başına autophagosomes saymak. Autophagosomes geç evre autophogosomes dolu vakuoller andıran çift zar yapısı var. </li></ol>

<ol>
	<li>Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+and+treatment+of+sepsis.">The pathology and treatment of sepsis.</a> N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).</li><li>Anaya, D. A., Nathens, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+severe+sepsis+in+secondary+peritonitis.">Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis.</a> Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).</li><li>Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis:+A+new+hypothesis+for+pathogenesis+of+the+disease+process.">Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process.</a> Chest. 112, 235-243 (1997).</li><li>Rivers, E., Med, s. h. o. c. k. .. N. .. E. n. g. l. .. J. .., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+goal-directed+therapy+in+the+treatment+of+severe+sepsis+and+septic+shock.">Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock.</a> N. Engl. J. Med.. 345, 1368-1377 (2001).</li><li>Deitch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+intra-abdominal+infection.">Rodent models of intra-abdominal infection.</a> Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).</li><li>Raven, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+sepsis+found+shockingly+lacking.">Rodent models of sepsis found shockingly lacking.</a> Nat. Med. 18, 998 (2012).</li><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease.">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li><li>Virgin, H. W., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+genes+in+immunity.">Autophagy genes in immunity.</a> Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).</li><li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+renovation+of+cells+and+tissues.">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li><li>Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+health+and+disease.">Autophagy in human health and disease.</a> N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7, 629-642 (2011).</li><li>Chen, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egr-1+regulates+autophagy+in+cigarette+smoke-induced+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease.</a> PLos One. 3, 3313 (2008).</li><li>Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+autophagy+in+clinical+tissues+of+lung+and+vascular+diseases.">Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases.</a> Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).</li><li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+functions+of+IL-17A+in+experimental+sepsis.">Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis.</a> FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).</li><li>Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodesign+of+experimental+sepsis+by+cecal+ligation+and+puncture.">Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.</a> Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li><li>Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+3+(MKK3)+for+activation+of+p38&#945;+and+p38&#948;+MAPK+isoforms+by+TGF-&#946;1+in+murine+mesangial+cells.">Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38&#945; and p38&#948; MAPK isoforms by TGF-&#946;1 in murine mesangial cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).</li><li>Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-{beta}1+protects+against+mesangial+cell+apoptosis+via+induction+of+autophagy.">TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy.</a> J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).</li><li>Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+factors+affecting+mortality+rate+after+sepsis+in+a+murine+cecal+ligation+and+puncture+model.">Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model.</a> Surgery. 94, 331-335 (1983).</li><li>Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+determines+susceptibility+during+murine+septic+peritonitis.">Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis.</a> J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).</li><li>Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+oxygenase-1-mediated+autophagy+protects+against+hepatocyte+cell+death+and+hepatic+injury+from+infection/sepsis+in+mice.">Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice.</a> Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).</li><li>Lo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lc3+over-expression+improves+survival+and+attenuates+lung+injury+through+increasing+autophagosomal+clearance+in+septic+mice.">Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice.</a> Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).</li></ol>

Yazarlar bildirmek için hiçbir rakip mali çıkarlarını var

CLP büyük avantajı araştırmacıların (düşük-orta ve yüksek sınıftan itibaren yani) farklı ağırlıktaki sepsis araştırmak için izin vermesidir. Neden olduğu sepsis şiddeti bağlanmış çekum uzunluğu (en önemli belirleyicisi) etkilenir, delme için kullanılan iğne boyutu ve deliklerin sayısı 15, gerçekleştirilir. Buna ek olarak, fare suşu ve cinsiyet sepsis şiddetine etkileyebilir; çeşitli suşlarının diğerlerine göre daha hassastır ve genellikle erkek kadınlarda 19,20 daha duyarlıdır. Birlikte alındıklarında, yukarıda faktör CLP kaynaklı ölüm oranım belirlemek. Bizim deneyime dayalı, elde CLP-kaynaklı mortalite açısından araştırmacılar arasında bir fark yoktur. . Örneğin, Rittirsch ark% 60 mortalite 15 elde etmek için &#39;yoluyla-ve-through&#39; delinme (iki delik) 50% ligasyonu, 21 G, 1 kullanılır; bizim araştırma grubu muhtaç bir araştırmacıed aynı mortalite elde etmek için biraz daha ağır bir model (60% ligasyon, 21 G, 1 &#39;aracılığıyla-ve-through&#39; delinme) kullanmak için ise, araştırma grubundaki başka bir araştırmacı% 100 ligasyonu yakın (daha ağır bir modeli kullanılan , 19 G, 1 &#39;aracılığıyla-ve-through&#39; delinme) çok daha düşük mortalite (sadece% 25) elde etmek. Akılda yukarıdaki hususlar ile, bir CLP (yani düşük, orta veya yüksek dereceli sepsis) şiddeti karakterizasyonu oldukça ileriye dönük (uygulayarak, yani daha (sonuçta ölüm bakarak yani) geriye dönük olarak yapılması gerektiğini iddia olabilir belirli koşullar, örneğin,% 50 ligasyon). Bir operatör% 60 civarında ölüm oranı elde edildiğinde, o zaman, bu ne olursa olsun (örneğin çekum bağlandı ve yapılan deliklerin sayısı uzunluğu gibi) koşullar uygulanır, hangi orta dereceli sepsis olduğunu. Böylece, operatör farelerin% 60 ölmektedir altında olanlar tespit etmek farklı koşullara deneyin makul görünüyor. Daha sonra, operatörHer iki grup karşılaştırıldığında ediliyor tam olarak aynı koşulları uygulamak zorundadır. Tam olarak aynı koşullar uygulayarak (örneğin lige çekum uzunluğu, delme için kullanılan iğne boyutu, gerçekleştirilen delik sayısı, fare suşu ve cinsiyet), tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar 15, üretilecek olduğu tahmin edilmektedir. Ancak, hatta (hesaba yukarıdaki belirleyicilerini alarak) standart bir şekilde CLP performansından sonra, değişkenlik oluşabilir. 6 &#39;- - hatta aynı soydan bir değişken ayrı etkisi görülebilir özdeş hakaretler aynı hayvanların grupları yaş verilir bile&#39; bu uzmanlar tarafından kabul edilmiştir. Bu nedenle, değişkenliği azaltmak amacıyla, operatör aynı günde her iki grupta da karşılaştırıldığında, CLP yerine dair makul görünmektedir. Otofaji analizi, dinamik bir hücresel süreci oldukça karmaşıktır. Bu monogramları belirtilen protokollerph autophagosome oluşumunun biyokimyasal ya da morfolojik analizine dayanan, in vivo otofaji aktivasyon tahmin etmek için temel sağlar. Prensip olarak, bu bölümde verilen protokoller sepsis CLP veya alternatif modeller maruz farelerde herhangi bir organı dokuda Otofaji analizlerine uygulanabilir. Karaciğer genellikle CLP birincil hedefi temsil kabul edilirken, bu prosedür aynı zamanda akciğer ya da daha fazla çalışmanın layık böbrek dokusu, yaralanmasına neden olabilir. Hepatositlerin otofaji üzerinde CLP etkisi nispeten iyi böbrek veya akciğer Otofaji üzerindeki etkilerine göre incelenmektedir olmuştur ve bazı ilgili kanıtlar son zamanlarda 21,22 yayımlanmıştır. Bu artan autophagosome numaraları da lızozomal fonksiyonu ve son evre işleme blokajı yoluyla autophagy bozukluğu yansıtabilir olarak, bu, otofaji statik ölçer olduğu not edilmelidir. Bu bağlamda, bu deneyler, Biochem ile tamamlanmalıdırotofajik substrat ciro (örn. için ical deneyleri &#160; Yakın zamanda tarif edilen ve in vivo için uyarlanmış olarak akış) 11, analiz eder. Son zamanlarda tarif edildiği gibi 12,13 Bu deneyler, aynı zamanda dokuda önemli autophagy proteinlerin ifadesi için standart Batı bağışıklık-beneklenme analizi ile tamamlanabilir. Bu nedenle, bu testler bir arada yaralı dokunun 16 içinde Otofaji durumunun doğru bir tahminini elde etmek için uygulanması önerilir.

Sepsis, enfeksiyona sistemik inflamatuvar yanıt, eleştirmenlerce hastalarda 1 ölüm önde gelen nedeni temsil eder. Genellikle polimikrobiyaldir sepsise yol açan karın içi enfeksiyonlar,% 60 kadar 2 önemli mortaliteye sahip olan, sepsis vakalarının% 20 için hesap. Sepsis-ilişkili mortalite öncelikle sonraki organ yetmezliği 3,4 ile çoklu organ disfonksiyonu kaynaklanır. Bu hastalığın patojenik mekanizması içine ek araştırma acil, yeni ve daha etkili tedavilerin gelişmesini teşvik etmek gereklidir. Çekal ligasyon ve delme (CLP) yöntemi in vivo modelleme sepsis için yaygın olarak kullanılan bir işlemdir. Sonuçta çekum bakteri dolu olarak, polimikrobial peritonit onun ponksiyon sonuçları, kan (bakteriyemi) içine bakteri translokasyonu, septik şok, çoklu organ yetmezliği ve ölüm 5. Genellikle CLP klinik yansıttığı kabul edilmektedirdaha doğru gibi kemirgenler içine endotoksin ya da saflaştırılmış bakterilerin enjeksiyonu gibi daha önceki tekniklere göre daha gerçeklik Böylece, CLP sepsis patogenezinde soruşturma dolayısıyla, deneysel indüksiyon için 6 (değil sınırlamalar olmadan da olsa) altın standart kabul edilir ve. Bu monografi, biz sepsis patojenik mekanizmaları Otofaji dahil olup olmadığını değerlendirmek için tasarlanmış protokolleri açıklar. Autophagy, evrimsel olarak muhafaza edilmiş hücre işlem olup, hasar görmüş proteinlerin ve mitokondri gibi organel ciro kolaylaştırır ve bakteriler de dahil olmak üzere hücre içi 7,8 patojenlerin temizlenmesinde önemli bir rol oynar. Otofaji sırasında sitosolik proteinler organeller ya da sonradan bozulması 9 lizozomlara teslim edilir autophagosomes olarak adlandırılan iki membran-sınırlayıcı kabarcıklar içine tecrit edilir. Bir dizi protein autophagy-ilişkili genlerin memeli homologları (ATG) olarak tespit edilmiştir,ilk Otofaji süreci düzenleyen maya içinde tespit edilmiştir. LC3B-I (serbest form) için mikrotübül-ilişkili protein 1 hafif zincir 3B (LC3B) (Atg8 of homologu) dönüşümü (fosfatidiletanolamin-konjuge form)-II LC3B için autophagosome oluşumu 9 önemli bir adımı temsil eder. Otofajik fonksiyon bozukluğu, yaşlanma ve kanser ve nörodejeneratif bozukluklar 10 de dahil olmak üzere, insan hastalıkları ile ilişkilidir. Ayrıca, otofaji bağışıklık hücreleri 8 antijen sunumu, lenfosit geliştirme ve sitokin sekresyonu gibi doğal ve adaptif bağışıklık etkiler. Böylece, otofaji da enfeksiyona sistemik inflamatuvar yanıt (yani sepsis) bir rol oynayabileceğini söyledi makul görünüyor. Bugüne kadar çeşitli yöntemler in vivo doku hasarında Otofaji rolünü değerlendirmek için tarif edilmiştir. Bu yeşil floresan protein (GFP)-ifade LC3 farelerin kullanımı ve oto miktarının dahilelektron mikroskobu ile dokuda phagosomes (bu iki yöntem bu monografi açıklanmıştır). Ilave yöntemler doku homojenatlarında otofajik protein ifadesinin miktarının, ve (başka bir yerde tarif edildiği gibi) otofajik akı analizi 11-13 içerir. Bu incelemenin amacı, deneysel sepsis bağlamında in vivo değerlendirilmesi için mevcut Otofaji protokolleri sağlamaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >GFP-LC3 Transgenic Mice</td>
			<td >Riken (Japan)</td>
			<td >RBRC00806</td>
			<td >GFP-LC3#53</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >568-0606</td>
			<td>Xylazine HCl Injection Vet</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >995-2949</td>
			<td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A405-20</td>
			<td>Histology Grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A407-1</td>
			<td>For Sterilizatiion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >silk surgical sutures 6-0</td>
			<td >Owens &#38; Minor</td>
			<td >2300-0078OG, 017624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >buprenorphine-HCl</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >614-5157</td>
			<td>Buprenex Ampules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde (37%) solution</td>
			<td >JT Baker</td>
			<td >S898-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >xylenes</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP monoclonal antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G10362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoescht</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>944403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OCT</td>
			<td >VWR scientific</td>
			<td >25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan Black</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-203760</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate</td>
			<td >Electron microscopy Sciences</td>
			<td>15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >propylene oxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>240397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar 100 resin</td>
			<td >Agar scientific</td>
			<td > R1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>46346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >methylnadic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-benzyldimethylamine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>185582</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice

Deneysel sepsis çekal ligasyon ve delme polimikrobiyaldir sepsis neden olur (CLP) yöntemini kullanarak farelerde neden olabilir. Burada, bir protokol CLP tekniği kullanılarak farelerde değişen şiddetinin sepsis uyarılması için sağlanmaktadır. Autophagy stres ve patojen istilası için temel bir doku tepkisi olduğu. Deneysel sepsis bağlamında in vivo değerlendirmek için iki Otofaji mevcut protokoller de burada sunulmaktadır. (I), yeşil flüoresan protein (GFP)-LC3 füzyon proteini ifade eden transjenik farenin CLP tabi tutulur. GFP sinyali (puncta) lokalize geliştirme, imünohistokimyasal veya konfokal tahlilleri yoluyla analiz edilmiş olarak, gelişmiş autophagosome oluşumunu algılamak ve, otofaji yolu bu nedenle, değiştirilmiş aktivasyon için kullanılabilir. (Autophagy stimülasyon bir göstergesi olarak) birim doku alanı başına (II) Geliştirilmiş otofajik küçük boşluk (autophagosome) formasyonu elektron mikroskobu kullanılarak belirlenebilir. Sepsise otofajik yanıtların çalışma kritik bir compdokular enfeksiyona yanıt hangi mekanizmaları anlamada onent. Bu alandaki araştırma bulguları sonuçta kritik bakım tıpta önemli bir problem teşkil etmektedir sepsis patogenezi, anlamaya yönelik katkıda bulunabilir.

Bakteremi erken CLP kaynaklı sepsis 14 6 saat sonra farelerdeki bulunur. (Titreme, takipne ve bozulmuş motor aktivite de dahil olmak üzere) sepsis klinik bulguları işlemden sonra yaklaşık 12 saat görünür. Fareler peritonit indüksiyon sonrası yaklaşık 18 saat sonra ölmeye başlar CLP tabi. Daha ciddi fazla artan sepsis öldürücü 15 olmasıdır. CLP 7 gün sonra% 60 civarında ölüm orta dereceli sepsis sonuçları (bu sürenin ötesinde, hiçbir ölüm bekleniyor) ise detaylı, yüksek dereceli sepsis (Şekil 1), 2-3 gün içinde% 100 ölüme neden olur. Buna karşılık, sahte farelerin ölüm sıfır olmalıdır <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51066/51066fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51066/51066fig1.jpg" /> Farelerde farklı şiddetinin CLP sonra Şekil 1. Hayatta kalma eğrileri.<html> C57BL / 6 fareleri, bir 21 G iğne ile (örneğin, &#39;ile-ve-through&#39; 1 lastik (iki delik) çekuma deliklerin sayısını sabit tutmak ligasyonu ayarlayarak cerrahi ya da farklı şiddetinin CLP kaynaklı sepsis Sham tabi tutulmuştur .) CLP 7 gün sonra yaklaşık% 60 mortaliteye neden olan orta dereceli sepsis içinde çekum sonuçların% 60 ligasyonu. ≥ 75 yüksek dereceli sepsiste çekum sonuçların ve% arasında ligasyon sonra, CLP sonra 2-3 gün içinde% 100 ölüm, süre, çekum ≤% 25 ligasyonu, böylece, düşük dereceli sepsis yol açar ve neredeyse sıfır mortalite. Tipik sağkalım sonuçları gösterilmiştir. Autophagy çalışmaların amaçları için, orta dereceli sepsis CLP modeli uygulamak için seçti. Düşük dereceli sepsis yüksek dereceli sepsis (otofaji indüksiyon öncesi) farelerin erken öldürücülük sebep olurken, Otofaji uyarmak için yetersiz olabilir. ve_content &quot;&gt; Otofaji analiz edilmesi için, daha önce zikredilen sepsis protokoller tabi GFP-LC3 füzyon proteinini eksprese eden transgenik fareler kullanılmıştır. autophagy yolunun uyarılmasına neden tedavi yöntemleri için, (GFP sinyali geliştirilmesini orada lokalize olacağı tahmin edilmektedir puncta), geliştirilmiş autophagosome oluşumu 16 bir göstergesidir immünohistokimyasal veya konfokal deneyleri yoluyla analiz edilmiş olarak. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51066/51066fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51066/51066fig2.jpg" /> In vivo ve in vitro olarak Şekil 2,. GFP görüntüleme. (A, B) GFP-LC3B farelerden elde edilen fare organlarda GFP görüntüleme (örneğin böbrek) Örnek örnek. Resim tedavi edilmemiş farelerden elde edilen böbrek dokusunun glomerüllerde GFP-LC3 puncta göstermektedir. Ölçek çubukları 10 mm =. (<html> C, D) ilave veriler, in vitro GFP-LC3 görüntüleme açıklamak için temin edilmiştir. Birincil mesanjiyal hücreleri, daha önce tarif edildiği gibi genetik olarak modifiye edilmiş farelerden alınan hücre izolasyonu için bir protokol kullanılarak GFP-LC3 transgenik farelerden izole edilmiştir. 17 hücreleri yokluğunda (C) veya TGF-β1 varlığı (D) (2 ng inkübe edilmiştir / mi) 24 saat süre ile, daha önce tarif edilen 18. TGF-β1 ile tedavi autophagosomes (yeşil puncta) bolluğu arttı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51066/51066fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> Protokolde tarif edildiği gibi bu, ayrıca, elektron mikroskobu kullanılarak klasik mikroskobik analizi ile test edilebilir. Bu septik fareler ya da diğer doku hasarı modellerinde elde edilen doku kesitleri birim doku alanı başına gelişmiş otofajik vakuol (autophagosome) oluşumunu göstermek olacağını tahmin edilmektedir. &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; e_content hep &quot;&gt; <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51066/51066fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51066/51066fig3.jpg" /> Şekil 3,. Elektron autophagosome oluşumu mikroskopisi. Temsili bir erken mikrografı ve orta dereceli CLP (% 60 bağlanması, 21 G, 2 delik) tabi C57BL / 6 farelerinden alınan akciğer dokusunda geç evre autophagosome oluşumu. Geç evre autophagosomes dolu bir çarpıtma (ok başı) benzer iken Εarly sahne autophagosomes, bir çift zar yapısını (ok) var. M mitokondri gösterir. Ölçek çubuğu = 1 mikron. A temsili kontrol görüntü Sham tabi C57BI / 6 farelerin akciğer dokusunun gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51066/51066fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice at JoVE.com

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Deneysel sepsis çekal ligasyon ve delme (CLP) yöntemini kullanarak farelerde neden olabilir. CLP kaynaklı sepsis bağlamında in vivo Otofaji değerlendirmek için mevcut protokoller burada sunulmuştur: (GFP)-LC3 fareler kullanılarak Otofaji ölçülmesi için bir protokol ve elektron mikroskobu ile autophagosome oluşumunu ölçmek için bir protokolü.

Çekal ligasyon ve Farelerde Autophagy incelemek için bir model olarak Sepsis Patamaya kaynaklı

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

cecal-ligation-puncture-induced-sepsis-as-model-to-study-autophagy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.2K Görüntüleme.  Brigham and Women's Hospital.  Deneysel sepsis çekal ligasyon ve delme (CLP) yöntemini kullanarak farelerde neden olabilir. CLP kaynaklı sepsis bağlamında in vivo Otofaji değerlendirmek için mevcut protokoller burada sunulmuştur: (GFP)-LC3 fareler kullanılarak Otofaji ölçülmesi için bir protokol ve elektron mikroskobu ile autophagosome oluşumunu ölçmek için bir protokolü. 

Video: Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for establishing new therapeutic approaches in this field. Therefore, animal models are required that are able to closely mimic the human disease and also sufficiently deal with scientific questions. The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. In this model, a small stent is surgically inserted into the ascending colon of mice or rats leading to a continuous leakage of intestinal bacteria into the peritoneal cavity. The procedure results in peritonitis, systemic bacteraemia, organ infection by gut bacteria, and systemic but also local release of several pro- and anti-inflammatory cytokines. The lethality of CASP can be controlled by the diameter of the inserted stent. A variant of this model, the so-called CASP with intervention (CASPI), raises opportunity to remove the septic focus by a second operation according to common procedures in clinical practice. CASP is an easily learnable and highly reproducible model that closely mimics the clinical course of abdominal sepsis. It leads way to study on questions in several scientific fields e.g. immunology, infectiology, or surgery.

Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. This article describes the surgical procedure of CASP. The CASP model and its variants allow the systematic investigation of various problems concerning the subject of sepsis.

Kolon Peritonit Stent Ascendens (CASP) - polimikrobik Abdominal Sepsis için bir Standart Model

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Kullanımı<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bir Model Organizma olarak Eğitim için<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Enfeksiyon

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

Yenidoğan Polymicrobial Sepsis için kontrollü fare modeli

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Sepsis kaynaklı bağışıklık bastırma, çekal ligasyon ve delinme ve Intranasal enfeksiyon çift model tasarımı

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Mycobacterium tüberküloz kompleksinin incelenmesi Için bir enfeksiyon modeli olarak ınvertebrate Galleria mellonella kullanımı

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Çekal ligasyon ve Farelerde Autophagy incelemek için bir model olarak Sepsis Patamaya kaynaklı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler