Este trabalho foi financiado pelo NIH HL108801 subsídios P01, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, a AMK Choi. S. Ryter recebeu apoio salário do Instituto de Pesquisa Respiratória Lovelace.

Nota: A Comissão Institucional Animal Care e Use a Brigham and Area Hospital / Harvard Medical School da Mulher aprovou os seguintes procedimentos. 1. Cecal ligadura e punção Use os ratos do mesmo fundo (C57Bl / 6), do sexo masculino, 8-10 semanas de idade. Camundongos fêmeas são mais resistentes do que os homens contra a letalidade induzida por sepse. Ratos com idade superior a 8 semanas produzir resultados menos variáveis ​​do que os ratos mais jovens, em termos de sobrevivência após CLP. Aproximadamente N = 10 ratos por grupo de comparação deve ser utilizado para a análise de sobrevivência. N = 3-5 ratinhos é adequado para ensaios autofagia. <ol><li> Use pequenos instrumentos cirúrgicos estéreis (ou seja, bisturi, tesouras e pinças anatômicas sem corte), que deve ser apropriado para a cirurgia de roedores. </li><li> Prepare a mistura de anestesia: A 7,95 ml de PBS, adicionar 150 mL de xilazina (AnaSed injecção de 100 mg / mL) e 700 mL de cetamina (Ketaset &#160; CIII, 100 mg / mL). </li><li> Para garantir condições de assepsia durante o procedimento, use luvas, máscara e bata cirúrgica. </li><li> Pesar animais. Anestesiar los através da injecção intraperitoneal (ip), a mistura mencionada no passo 3, em uma dosagem de ul (10x o peso corporal em g). Por exemplo, para um rato pesando 22 g, administrar 10x22 = 220 ul da mistura de anestésico. Assim, as doses finais de xilazina e cetamina são 17 e 80 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Certifique-se de que a anestesia é adequada, sem flexão da extremidade deve ser produzido após toe pitada Nota:. Use pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura sob anestesia. </li><li> Coloque os animais em uma superfície de trabalho limpa em suas costas. Tails e patas traseiras são orientadas para o investigador. Desinfetar a pele abdominal com álcool (solução de EtOH 70%) Nota:. Área cirúrgica deve ser completamente raspada, para evitar a contaminação da ferida através do contato compele. Além disso, de forma ideal, uma almofada de água quente circulante devem ser utilizados para manutenção da temperatura dos ratos anestesiados durante a cirurgia. </li><li> Usando um bisturi, fazer uma pequena incisão na pele longitudinal paralelo e aproximadamente 1 cm para a esquerda para a linha média. Não penetram ainda para dentro da cavidade peritoneal. Use pequenas tesouras para alargar a incisão inicial. </li><li> Identificar os músculos abdominais e dissecá-los para ganhar acesso para a cavidade peritoneal. </li><li> Usando uma pinça anatômica sem corte, identifique o ceco e movê-lo para fora da cavidade peritoneal. Tenha cuidado para não danificar os vasos sanguíneos mesentéricos (isso pode levar a hemorragia letal). </li><li> Ligadura de 60% do ceco para atingir um grau médio sépsis. Ligando igual ou superior a 75% do ceco geralmente resulta em septicemia alto grau, enquanto que ligando igual ou inferior a 25% dos resultados do ceco em sépsis de baixo grau. Tenha cuidado para não ligadura a válvula ileocecal (o que poderia bloquear a continuidade intestinal). </li><li> Ao utilizar um21 G agulha, perfurar o ceco por um através-e-através de punção (dois furos) perto da ligadura. A direcção da perfuração deve ser da mesentérica para o lado anti-mesentérica do ceco. Tenha cuidado para não furar os vasos sanguíneos mesentéricos. </li><li> Retirar a agulha. Suavemente espremer o ceco ligado para confirmar a permeabilidade através dos dois orifícios, apenas uma pequena quantidade de fezes devem ser extrudido através deles. </li><li> Mover o ceco ligado e perfurado no interior da cavidade peritoneal. Nota: Para os ratos sham, pule as etapas de 1,10-1,12. </li><li> Use seda suturas cirúrgicas 6-0 com agulha cortante para fechar musculatura abdominal. Use seda suturas cirúrgicas 6-0 com agulha cortante para fechar a pele abdominal. </li><li> Injectar 1 mL de pré-aquecido (37 ° C) ip soro fisiológico normal para substituir o calor e hidratação perdida durante o processo. Coloque os ratos sob uma lâmpada de calor até a sua reanimação Nota:. Idealmente, um dispositivo de aquecimento mais seguro (such como uma rampa de água quente circulando) pode ser usado em vez de uma lâmpada de calor. </li><li> No pós-operatório injetar buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal sc.) Para alcançar analgesia Nota:. Um animal não deve ser deixado sozinho até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Um animal que tenha sido submetido a tratamento cirúrgico não deve ser devolvido para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. </li><li> Coloque os animais de volta em suas gaiolas com acesso ilimitado a comida e água. Ratos serão sacrificados quando se tornam moribundo (indicado por sinais clínicos como a incapacidade de se mover quando tocado ou cianose). Verifique camundongos cada 4 horas para evitar que eles morram antes da eutanásia. </li></ol> 2. Tissue Colheita e Fixação <ol><li> Prepara-se uma solução de 4% de paraformaldeído (PFA): Para 889 ml de PBS, adicionar 111 ml de 37% de PFA. </li><li> Sacrifício camundongos usando CO narcose induzida de 2 ou cetamina / xilazina slução numa dosagem elevada. </li><li> Imobilizar os ratos sobre uma superfície de trabalho limpa. Pulverizar a pele abdominal e torácica com solução EtOH 70% desinfectá-lo. </li><li> Usar um bisturi e pequenas tesouras para remover a pele abdominal e torácica, bem como a pele que cobre a área da traqueia. </li><li> Revelar traquéia, removendo seus tecidos circundantes (músculos e tecido conjuntivo). </li><li> Coloque uma sutura (sem agulha cortante) em torno da traquéia. Não aperte ainda. </li><li> Use um cateter venoso periférico pequeno (20 g) a traquéia &#39;entubar&#39;. Tenha cuidado durante a inserção do cateter para evitar desgaste traqueal. Note-se que o maior diâmetro da traquéia está logo abaixo da cartilagem cricóide. </li><li> Apertar a sutura em torno da traqueia / cateter. Remover a agulha, deixando apenas a cânula de plástico do cateter na traqueia. Agulha serviu apenas como um guia-fios para a inserção da cânula de plástico. </li><li> Depois de ter assegurado a cânula de plástico na traquéia, corte ºe musculatura abdominal, abrir o abdômen e revelar o diafragma. </li><li> Usando uma agulha, perfure o diafragma para a produção de pneumotórax (isto é, inserção de ar na cavidade pleural). Pulmões deve então ser recolhido. </li><li> Com uma tesoura pequena, retire o diafragma, corte ao longo do esterno (esternotomia), remova a caixa torácica e revelar o coração e os pulmões. </li><li> Através da cânula de plástico inserido na traqueia, corrigir os pulmões com uma solução de formaldeído a menos de 30 cm de H 2 O de pressão. </li><li> Retirar os pulmões e colocá-los no PFA a 4% durante 24 horas e subsequentemente em 70% de solução de EtOH até à transformação. </li><li> Identificar e remover coração, fígado e rins. Da mesma maneira, a colocá-los em PFA a 4% durante 24 horas e subsequentemente em 70% de solução de EtOH até à transformação. </li></ol> 3. Ratos GFP e visualização de GFP Slides <ol><li> Realize CLP e cirurgia fictícia em camundongos GFP-LC3 como descrito no passo 1, e procedimento pós-operatórios como descrito no passo 2 do protocolo. </li><li> Incorporar os tecidos (nomeadamente os pulmões, coração, fígado e rins) em parafina e corte-os em série 5 mm de. </li><li> Quando pronta para a coloração de GFP, incuba-se a 60 ° C durante 30-60 minutos até se derrete parafina e tecido parece translúcida. </li><li> Retire a parafina com série graduada padrão de xileno ou xileno substitutos, 5 min xileno 1, 2, xileno e xileno 3 então 3 min incubações em série graduada de EtOH: 100%, 95%, 75%, e depois enxaguar em água destilada. Nota: Após desparafinização evitar a dessecação do tecido, o que aumenta o fundo da amostra. </li><li> Executar a recuperação de antigénio utilizando um tampão de ácido cítrico (ácido 10 mM de citrato de sódio, 0,05% de Tween 20, pH 6,0), por microondas durante 10-20 min. Tenha cuidado para substituir tampão periodicamente para evitar a dessecação dos tecidos. </li><li> Deixa-se arrefecer por 20 min no banco para completar recuperação antigênica. </li><li> Lavar 2-3x com PBS. Retire o excesso de tampão e transfer desliza da cremalheira para a posição horizontal em uma caixa de slide ou outra câmara úmida para evitar a dessecação. </li><li> Bloquear 45-60 min à temperatura ambiente com 10% de soro de burro normal (também 5% de albumina de soro bovino, ou de preferência a partir de soro animal, em que o anticorpo secundário foi gerado) em PBS. </li><li> Incubar as amostras de anticorpo GFP primário em uma diluição de 1:100 em PBS durante a noite a 4 ° C em câmara húmida. Gentilmente aplicar pequenos pedaços de Parafilm sobre o tecido com o anticorpo para promover o contato homogêneo com o tecido e evitar a evaporação. Nota: Os restantes passos são realizados à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 5x com PBS para remover excesso de anticorpo primário. Incubar com anticorpo secundário 1:500-1:1,000 em PBS durante 1-2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 5x com PBS para remover excesso de anticorpo secundário. Se desejado, as lâminas contracoloração neste passo. </li><li> Se estiver usando anticorpo secundário fluorescente, incubar 0,1% Sudan Black em 70% EtOH fou 15-20 minutos para reduzir autofluorescência. Limpe o excesso de Sudan Black de todo o tecido e lave 5x com PBS mais de 20 min. </li><li> Monte amostra com lamela e armazenar na horizontal, até solução de montagem definiu. </li></ol> 4. Protocolo Alternativa: Detecção direta de GFP-LC3 <ol><li> Canular e inflar os pulmões com um ~ 500 ml de 50/50 v / v outubro PBS. </li><li> Encaixe em OCT, colocando uma pequena quantidade de OCT na parte inferior de um cryomold. </li><li> Com cuidado, coloque o complexo pulmonar dissecado no molde. </li><li> Lentamente congelar methylbutane refrigerados, utilizando gelo seco. </li><li> Adicionar mais outubro até que o tecido está completamente coberto e sólido congelado. Manter em gelo seco e armazenar a -80 ° C. </li><li> Usando um cryomicrotome, corte de 5-10 mm de espessura protegendo as seções da luz. Seções da loja e tecido remanescente a -80 ° C. </li><li> Para preparar os slides para imagens, remova a seção do freezer e aplique imediatamente uma gota de PBS para evitar a dessecação. </li><li> Correção para 30 min com PFA 4%. Lavar com PBS. </li><li> Aplicar DAPI / Hoescht para 10 min. Lavar 3x com PBS. </li><li> Monte amostra com lamela e armazenar na horizontal, até solução de montagem definiu. </li><li> Imagem utilizando epifluorescência ou microscópio confocal. Armazenar as amostras a 4 ° C durante até um mês. </li></ol> 5. Preparação de Tecidos para Microscopia Eletrônica <ol><li> Cortar tecidos em aproximadamente 1 mm cubos para a fixação. </li><li> Fixar o tecido em formaldeído a 2%, glutaraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,4. </li><li> Lave com tampão cacodilato de sódio 0,1 M, durante 1-2 horas. Nota: o tecido fixa pode ser armazenado em 0,1 M de cacodilato de sódio a 4 ° C. </li><li> Publique correcção em 1% de tetróxido de ósmio em tampão de cacodilato de sódio 0,2 M durante 1 hora. </li><li> Enxaguar em tampão de cacodilato de sódio 0,2 M durante 10 min 3x. </li><li> Desidratar em etanol 70%, 20 min 2x. Desidratar em EtOH a 90%, 2x 10 minutos. Desidratar em EtOH a 100%,20 min 2x. </li><li> Incubar com óxido de propileno (propano epóxi) durante 10 minutos em 2x. </li><li> Incubar com a mistura de resina de óxido de propileno / epóxi (50:50), durante 1 hora. A mistura de resina epoxi é: 24 g de Agar de resina de 100, 13 g de anidrido dodecenilsuccínico, 13 g de anidrido methylnadic e 1 ml de N-benzildimetilamina. Misture bem em uma taça descartável com uma espátula de madeira. </li><li> Incube com Epoxy overnight resina vials estreantes (deste permite algum óxido propileno restante evaporar). </li><li> Incorporar em cápsulas marcados com resina preparada na hora. Polimerizar a 60 ° C durante 48 hr. </li><li> Cortes de tecido fotografia usando um microscópio eletrônico de transmissão em 80 kV ou 60 no filme microscópio eletrônico. Imprimir as imagens em papel fotográfico ou armazenar mídia como digitais. </li><li> Analisar a formação autophagosome em células intactas contendo núcleo. Campos de baixa potência (e. G. 2,000-4,000 X) pode ser usada para identificar células nucleadas. Normalmente 6,800-10,000 imagens X são usados ​​para poé a quantificação autophagosome. Contagem autofagossomas por unidade de área 15-30 campos de representação estatística adequada. Autofagossomas tem estrutura de membrana dupla, onde autophogosomes fase tardia assemelhava vacúolos preenchidos. </li></ol>

<ol>
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Os autores não têm concorrentes interesses financeiros para declarar

A principal vantagem do CLP é que ele permite que os pesquisadores para investigar sepse de diferentes gravidades (ou seja, de baixo para médio e alto grau). A gravidade da sepsia induzida é afectada pelo comprimento do ceco ligado (que o determinante mais importante), o tamanho da agulha utilizado para punção e o número de orifícios 15 realizados. Além disso, a tensão do mouse e sexo podem ter impacto sobre a gravidade da sepse; várias cepas são mais suscetíveis do que outras e os homens...

Sepse, uma resposta inflamatória sistêmica à infecção, representa uma das principais causas de morte em pacientes criticamente doentes 1. Infecções intra-abdominais, muitas vezes levando à sepse polimicrobiana, são responsáveis ​​por 20% dos casos de sepse, que têm uma mortalidade significativa de até 60% 2. Mortalidade associada à sepse resulta principalmente de disfunção de múltiplos órgãos com falência de órgãos posterior 3,4. Investigações adicionais sobre o mecanismo patogênico da doença é urgentemente necessária para promover o desenvolvimento de novas terapias e mais eficazes. O método de ligadura e perfuração cecal (CLP) é um procedimento comumente utilizado para sepse modelagem in vivo. Como o ceco é cheia de bactérias, os seus resultados de punção em peritonite polimicrobianas, a translocação de bactérias no sangue (bacteremia), choque séptico, disfunção de múltiplos órgãos e, em última análise, a morte 5. É geralmente aceite que a CLP reflete clínicarealidade com mais precisão do que as técnicas anteriores, como a injeção de endotoxina ou bactérias ainda purificadas em roedores, Assim, CLP é considerada o padrão-ouro (embora não sem limitações) 6 para a indução experimental e, portanto, a investigação da patogênese da sepse. Nesta monografia, descrevemos os protocolos destinados a avaliar se os mecanismos patogênicos de sepse incluem autofagia. A autofagia, um processo celular evolutivamente conservada, facilita o volume de negócios de proteínas e organelas como as mitocôndrias danificadas e desempenha um papel importante na depuração de patógenos intracelulares incluindo bactérias 7,8. Durante a autofagia, proteínas ou organelas citosólicas são seqüestrados em vesículas ligadas à membrana dupla chamadas autofagossomas, que são posteriormente entregues aos lisossomos para degradação 9. Um número de proteínas foram identificadas como os seus homólogos de mamíferos de genes relacionados com a autofagia (ATG),originalmente identificado em leveduras, que regulam o processo de autofagia. A conversão de microtúbulos associados protein-1 cadeia leve 3B (LC3B) (homólogo de Atg8) a partir de-I LC3B (forma livre) para LC3B-II (forma fosfatidiletanolamina conjugado) representa um grande passo na formação autophagosome 9. Disfunção autofágica é associado com o envelhecimento e doenças humanas, incluindo câncer e doenças neurodegenerativas 10. Além disso, a autofagia afecta a imunidade inata e adaptativa, tais como apresentação de antigénio, o desenvolvimento de linfócitos e a secreção de citoquinas pelas células imunes 8. Assim, parece razoável que a autofagia pode também desempenhar um papel na resposta inflamatória sistémica à infecção (isto é, em sépsis). Até à data, vários métodos têm sido descritos para avaliar o papel da autofagia em lesão de tecidos in vivo. Estes incluem o uso de proteína de fluorescência verde (GFP)-LC3 expressando camundongos ea quantificação de autophagosomes em tecidos por microscopia electrónica (estes dois métodos são descritos na presente monografia). Métodos adicionais incluem a quantificação da expressão da proteína autophagic em homogenatos de tecidos, e a análise de fluxo autophagic (como descrito noutro local) 11-13. O objetivo desta revisão é fornecer protocolos atuais para avaliar a autofagia in vivo, no contexto da sepse experimental.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >GFP-LC3 Transgenic Mice</td>
			<td >Riken (Japan)</td>
			<td >RBRC00806</td>
			<td >GFP-LC3#53</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >568-0606</td>
			<td>Xylazine HCl Injection Vet</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >995-2949</td>
			<td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A405-20</td>
			<td>Histology Grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A407-1</td>
			<td>For Sterilizatiion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >silk surgical sutures 6-0</td>
			<td >Owens &#38; Minor</td>
			<td >2300-0078OG, 017624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >buprenorphine-HCl</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >614-5157</td>
			<td>Buprenex Ampules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde (37%) solution</td>
			<td >JT Baker</td>
			<td >S898-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >xylenes</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP monoclonal antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G10362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoescht</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>944403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OCT</td>
			<td >VWR scientific</td>
			<td >25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan Black</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-203760</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate</td>
			<td >Electron microscopy Sciences</td>
			<td>15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >propylene oxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>240397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar 100 resin</td>
			<td >Agar scientific</td>
			<td > R1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>46346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >methylnadic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-benzyldimethylamine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>185582</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice

Sepse experimental pode ser induzida em camundongos usando a ligadura e punção do ceco método (CLP), que causa a sepse polimicrobiana. Aqui, um protocolo é fornecido para induzir sepsia de gravidade variável em ratinhos utilizando a técnica de CLP. A autofagia é uma resposta do tecido fundamental para o estresse ea invasão do patógeno. Dois protocolos correntes para avaliar a autofagia in vivo no contexto de sepsia experimental também são aqui apresentados. (I) camundongos transgênicos expressando a proteína fluorescente verde proteína de fusão (GFP)-LC3 são submetidos a CLP. Realce localizada do sinal GFP (puncta), tal como ensaiado ou com imuno-histoquímica ou confocal, pode ser utilizado para detectar a formação de autophagosome aumentado e, assim, a activação da via alterada autofagia. (II) aprimorado vacúolo autofágico (autophagosome) formação por área de tecido da unidade (como um marcador de estimulação autofagia) pode ser quantificado usando microscopia eletrônica. O estudo das respostas autofágicos a sepse é uma amostra críticaonent de compreensão dos mecanismos pelos quais os tecidos respondem à infecção. Os resultados da pesquisa nesta área pode vir a contribuir para a compreensão da patogênese da sepse, o que representa um grande problema em medicina intensiva.

Bacteremia está presente em camundongos, já em 6 horas após a sepse induzida por CLP 14. Os sinais clínicos de sepse (incluindo calafrios, taquipnéia e atividade motora) aparecem cerca de 12 horas após o procedimento. Ratos submetidos a CLP começam a morrer em cerca de 18 horas após a indução da peritonite. O mais grave é a sepse é o mais aumentou a letalidade 15. Em detalhe, sepse alto grau provoca uma mortalidade de 100% dentro de 2-3 dias, enquanto que os resultados de sépsis, de gr...

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Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Sepse experimental pode ser induzida em camundongos usando a ligadura e punção do ceco método (CLP). Protocolos correntes para avaliar a autofagia in vivo no contexto de sepsia induzida por CLP são aqui apresentados: Um protocolo para medir autofagia utilizando ratinhos (GFP)-LC3, e um protocolo para medir a formação de autophagosome por microscopia electrónica.

Cecal ligadura e punção induzida Sepsis como um modelo para estudar a autofagia em Ratos

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

cecal-ligation-puncture-induced-sepsis-as-model-to-study-autophagy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.1K visualizações.  Brigham and Women's Hospital.  Sepse experimental pode ser induzida em camundongos usando a ligadura e punção do ceco método (CLP). Protocolos correntes para avaliar a autofagia in vivo no contexto de sepsia induzida por CLP são aqui apresentados: Um protocolo para medir autofagia utilizando ratinhos (GFP)-LC3, e um protocolo para medir a formação de autophagosome por microscopia electrónica. 