Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones HL108801 P01, R01-HL60234, HL55330-R01, R01-HL079904, a AMK Choi. S. Ryter recibió apoyo salarial del Lovelace Respiratory Research Institute.

Nota: El Comité Institucional Cuidado de Animales y el uso en el Brigham and Area Escuela de Medicina Hospital / Harvard de la Mujer aprobó los siguientes procedimientos. 1. La ligadura y punción cecal Utilice ratones del mismo fondo (C57BL / 6), macho, de 8-10 semanas de edad. Los ratones hembra que son más resistentes que los hombres contra la letalidad inducida por la sepsis. Los ratones de más edad de 8 semanas producen menos resultados variables que los ratones más jóvenes en términos de supervivencia después de CLP. Aproximadamente N = 10 ratones por grupo en comparación deben ser utilizados para el análisis de supervivencia. N = 3-5 ratones es adecuada para los ensayos de la autofagia. <ol><li> Use pequeños instrumentos quirúrgicos estériles (es decir, de bisturí, tijeras y pinzas anatómicas contundentes), que deben ser apropiados para la cirugía de roedores. </li><li> Preparar la mezcla de anestesia: Para 7,95 ml de PBS añadir 150 l de xilazina (anased inyección de 100 mg / ml) y 700 l de Ketamina (Ketaset &#160; CIII, 100 mg / ml). </li><li> Para garantizar condiciones asépticas durante el procedimiento, usar guantes, mascarilla y bata quirúrgica. </li><li> Pesar animales. Anestesie ellos mediante la inyección intraperitoneal (IP) de la mezcla mencionada en el paso 3 en una dosis de l (10 veces el peso corporal en g). Por ejemplo, para un ratón de pesaje 22 g, administrar 10x22 = 220 l de la mezcla anestésica. Por lo tanto, las dosis finales de xilazina y ketamina son 17 y 80 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Asegúrese de que la anestesia es adecuada; sin flexión de las extremidades se debe producir después pizca dedo del pie Nota:. Use pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. </li><li> Coloca los animales sobre una superficie de trabajo limpia en sus espaldas. Las colas y las patas traseras se orientan hacia el investigador. Desinfectar la piel del abdomen usando alcohol (solución EtOH 70%) Nota:. Área quirúrgica debe estar completamente afeitado, para evitar la contaminación de la herida a través del contacto conpiel. También, de manera óptima, un cojín de agua caliente circulante se debe utilizar para mantener la normotermia de los ratones anestesiados durante la cirugía. </li><li> Mediante el uso de un bisturí, hacer una pequeña incisión en la piel longitudinales paralelos y aproximadamente 1 cm de izquierda a la línea media. No penetrar todavía en la cavidad peritoneal. Utilice pequeñas tijeras para prolongar la incisión inicial. </li><li> Identificar los músculos abdominales y diseccionar para obtener acceso a la cavidad peritoneal. </li><li> Mediante el uso de fórceps anatómicas romos, identificar el ciego y moverlo fuera de la cavidad peritoneal. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos mesentéricos (esto podría dar lugar a una hemorragia letal). </li><li> Ligar 60% del ciego para lograr una sepsis de grado medio. La ligadura igual o más de 75% del ciego generalmente resulta en la sepsis de alto grado, mientras que la ligadura de igual o menos de 25% de los resultados de ciego en la sepsis de bajo grado. Tenga cuidado de no ligar la válvula ileocecal (esto podría bloquear la continuidad intestinal). </li><li> Mediante el uso de un21 G aguja, perfore el intestino ciego por una punción a través de-y-medio (dos agujeros), cerca de la ligadura. La dirección de la perforación debe ser de la mesentérica hacia el lado anti-mesentérica del ciego. Tenga cuidado de no perforar los vasos sanguíneos mesentéricos. </li><li> Retire la aguja. Exprimir suavemente el ciego se ligó para confirmar la permeabilidad a través de los dos agujeros; sólo una pequeña cantidad de heces debe ser extruida a través de ellos. </li><li> Mueva el ciego ligado y perforado en la cavidad peritoneal. Nota: Para los ratones sham, omita los pasos 01.10 a 01.12. </li><li> Utilice suturas quirúrgicas de seda 6-0 con el corte de la aguja para cerrar la musculatura abdominal. Utilice suturas quirúrgicas de seda 6-0 con el corte de la aguja para cerrar la piel abdominal. </li><li> Inyectar 1 ml precalentado (37 ° C) IP salina normal para reemplazar el calor y la hidratación perdida durante el procedimiento. Coloque los ratones bajo una lámpara de calor hasta que su reanimación Nota:. De manera óptima, un dispositivo de calentamiento más seguro (SUCH como una almohadilla de agua caliente circulante) se puede utilizar en lugar de una lámpara de calor. </li><li> Después de la operación inyectar buprenorfina (0,05 mg / kg sc peso corporal.) Para lograr una analgesia Nota:. Un animal no debe ser dejado sin atención hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Un animal que ha sido sometido a un tratamiento quirúrgico no debe ser devuelto a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado. </li><li> Coloque de nuevo los animales en sus jaulas con acceso ilimitado a comida y agua. Los ratones se sacrificaron cuando se convierten moribunda (indicado por los signos clínicos tales como la insuficiencia de moverse cuando se les toca o cianosis). Compruebe ratones cada 4 horas para evitar tener que mueran antes de la eutanasia. </li></ol> 2. Tissue Harvest y Fijación <ol><li> Preparar una solución al 4% de paraformaldehído (PFA): Para 889 ml de PBS añadir 111 ml de 37% PFA. </li><li> Sacrificio ratones utilizando CO narcosis 2 inducida-o ketamina / xilazina slución en una dosis alta. </li><li> Inmovilizar el ratón sobre una superficie de trabajo limpia. Rociar la piel abdominal y torácica con una solución de EtOH 70% para desinfectarla. </li><li> Utilice un escalpelo y tijeras pequeñas para eliminar la piel abdominal y torácica, así como la piel que cubre la zona traqueal. </li><li> Revelar la tráquea mediante la eliminación de sus tejidos circundantes (músculos y tejido conectivo). </li><li> Coloque una sutura (sin cortar la aguja) alrededor de la tráquea. No apriete todavía. </li><li> Use un pequeño catéter venoso periférico (20 G) a la tráquea &#39;intubate&#39;. Tenga cuidado durante la inserción del catéter para evitar la rotura traqueal. Tenga en cuenta que el mayor diámetro de la tráquea es justo por debajo del cartílago cricoides. </li><li> Apriete la sutura alrededor de la tráquea / catéter. Retire la aguja dejando sólo la cánula de plástico del catéter en la tráquea. Aguja sirvió sólo como una guía-hilos para la inserción de la cánula de plástico. </li><li> Después de haber obtenido la cánula de plástico dentro de la tráquea, corte the musculatura abdominal, abrir el abdomen y revelar el diafragma. </li><li> Usando una aguja, perforar el diafragma para producir neumotórax (es decir, inserción de aire en la cavidad pleural). Los pulmones deben entonces se derrumbaron. </li><li> Utilizando unas tijeras pequeñas, retire el diafragma, corte a lo largo del esternón (esternotomía), retire la caja torácica y revelar el corazón y los pulmones. </li><li> A través de la cánula de plástico insertado en la tráquea, fijar los pulmones con la solución de formaldehído en 30 cm H 2 O de presión. </li><li> Retire los pulmones y colocarlos en el 4% PFA durante 24 horas y, posteriormente, en el 70% de solución de EtOH hasta su procesamiento. </li><li> Identificar y eliminar el corazón, el hígado y los riñones. De la misma manera, los situará en el 4% de PFA durante 24 horas y, posteriormente, en 70% de solución de EtOH hasta su procesamiento. </li></ol> 3. Los ratones GFP y la visualización de las buenas prácticas agrarias Diapositivas <ol><li> Realice CLP y cirugía simulada en ratones GFP-LC3 como se describe en el paso 1, y el procedimiento postoperatorios como se describe en el paso 2 del protocolo. </li><li> Incrustar los tejidos (es decir, los pulmones, el corazón, el hígado y los riñones) en parafina y cortadas en serie 5 micras secciones. </li><li> Cuando esté listo para la tinción de GFP, se incuba a 60 ° C durante 30-60 minutos hasta que se derrita de parafina y el tejido fino aparece translúcida. </li><li> Desparafinar con la serie estándar graduada de xileno o xileno sustitutos, 5 min xileno 1, 2, xileno y xileno 3 entonces 3 incubaciones min en serie graduada de EtOH: 100%, 95%, 75%, y luego enjuague con agua destilada. Nota: Después de deparaffinization evitar la deshidratación del tejido, lo que aumenta el fondo de la muestra. </li><li> Realizar la recuperación de antígenos usando tampón de ácido cítrico (10 mM de ácido citrato de sodio, 0,05% de Tween 20, pH 6,0), en el microondas durante 10-20 min. Tenga cuidado para reemplazar periódicamente tampón para evitar la desecación de los tejidos. </li><li> Dejar enfriar durante 20 minutos en el banquillo para completar la recuperación de antígenos. </li><li> Lave 2-3x con PBS. Retire el exceso de buffer y transfer desliza de bastidor a la posición horizontal en una caja de diapositivas u otra cámara húmeda para evitar la desecación. </li><li> Bloquear 45-60 min a temperatura ambiente con 10% de suero normal de burro (también 5% de albúmina de suero bovino, o preferiblemente suero del animal en el que se generó el anticuerpo secundario) en PBS. </li><li> Incubar las muestras en anticuerpo GFP primario a una dilución 1:100 en PBS durante la noche en 4 º C en cámara húmeda. Aplique suavemente pequeñas piezas de Parafilm sobre el tejido con un anticuerpo para promover el contacto homogéneo con el tejido y evitar la evaporación. Nota: los pasos restantes se realizaron a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 5 veces con PBS para eliminar el exceso de anticuerpo primario. Incubar con anticuerpo secundario 1:500-1:1,000 en PBS durante 1-2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 5 veces con PBS para eliminar el exceso de anticuerpo secundario. Si se desea, contrateñir las diapositivas en este paso. </li><li> Si se utiliza un anticuerpo secundario fluorescente, incubar 0,1% Sudán Negro en el 70% de EtOH fo 15-20 minutos para reducir la autofluorescencia. Limpie el exceso de Sudán Negro de todo el tejido y lavar 5 veces con PBS durante 20 min. </li><li> Montar muestra con cubreobjetos y almacenar en posición horizontal, hasta que la solución de montaje se ha puesto. </li></ol> 4. Protocolo Alternativo: Detección directa de GFP-LC3 <ol><li> Cannulate y inflar los pulmones con un ~ 500 ml de 50/50 v / v octubre PBS. </li><li> Incrustar en octubre, poniendo una pequeña cantidad de octubre en el fondo de un criomolde. </li><li> Coloque con cuidado el complejo de pulmón diseccionado en el molde. </li><li> Lentamente congelarse metilbutano refrigerados utilizando hielo seco. </li><li> Añadir más octubre hasta que el tejido está completamente cubierta y sólido congelado. Mantener en hielo seco y se almacenan a -80 ° C. </li><li> El uso de un criomicrotomo, corte 5-10 micras de espesor secciones que protegen las secciones de la luz. Secciones de las tiendas y el tejido restante a -80 ° C. </li><li> Para preparar diapositivas para imágenes, quitar la sección del congelador y aplicar inmediatamente una gota de PBS para evitar la desecación. </li><li> Fijar durante 30 minutos con 4% PFA. Lavar con PBS. </li><li> Aplicar DAPI / Hoescht durante 10 min. Lavar 3 veces con PBS. </li><li> Montar muestra con cubreobjetos y almacenar en posición horizontal, hasta que la solución de montaje se ha puesto. </li><li> Imagen usando epifluorescencia o un microscopio confocal. Muestras a 4 ° C hasta por un mes. </li></ol> 5. Preparación de tejidos para Microscopía Electrónica <ol><li> Cortar los tejidos en aproximadamente 1 mm para la fijación de los cubos. </li><li> Fijar el tejido en 2% de formaldehído, 2,5% de glutaraldehído en 0,1 M de tampón de cacodilato de sodio, pH 7,4. </li><li> Lavar con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M durante 1-2 horas. Nota: tejido fijado se puede almacenar en cacodilato sódico 0,1 M a 4 ° C. </li><li> Publicación de solución en 1% de tetróxido de osmio en 0,2 M tampón de cacodilato de sodio durante 1 hora. </li><li> Enjuagar en tampón de cacodilato de sodio 0,2 M durante 10 minutos 3 veces. </li><li> Deshidratar en EtOH al 70%, 20 min 2x. Deshidratar en 90% de EtOH, 10 min 2x. Deshidratar en EtOH al 100%,20 min 2x. </li><li> Incubar con óxido de propileno (propano epoxi) durante 10 min 2x. </li><li> Incubar con la mezcla de resina de óxido de propileno / epoxi (50:50) durante 1 hora. La mezcla de resina epoxi es: 24 g Agar 100 de resina, 13 g de anhídrido dodecenilsuccınico, 13 g de anhídrido metilnádico y 1 ml de N-bencildimetilamina. Mezclar bien en un vaso de precipitados desechable usando una espátula de madera. </li><li> Incubar durante la noche con resina epoxi en viales destapados (esto permite que cualquier óxido de propileno restante se evapore). </li><li> Incrustar en cápsulas marcados con resina recién preparada. Polimerizar a 60 º C durante 48 h. </li><li> Secciones de tejido fotografía utilizando un microscopio electrónico de transmisión a 80 o 60 kV en una placa de microscopio de electrones. Imprima las imágenes en papel fotográfico o almacenar los medios de comunicación como digitales. </li><li> Analizar formación autofagosoma en células intactas que contienen núcleo. Campos de baja potencia (e. G. 2.000-4.000 X) se pueden utilizar para identificar las células nucleadas. Típicamente 6,800-10,000 X imágenes se utilizan para thes la cuantificación autofagosoma. Cuente autofagosomas por unidad de superficie 15-30 campos para representación estadística apropiada. Autofagosomas tienen estructura de doble membrana, donde autophogosomes etapa tardía se parecían vacuolas rellenas. </li></ol>

<ol>
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Los autores no tienen intereses financieros en competencia para declarar

La principal ventaja de CLP es que permite a los investigadores estudiar la sepsis de diferentes niveles de gravedad (es decir, de bajo a medio y de alto grado). Gravedad de la sepsis inducida se ve afectada por la longitud del intestino ciego ligado (que el determinante más importante), el tamaño de la aguja utilizada para la punción y el número de agujeros realizados 15. Además, la cepa de ratón y el género pueden influir en la gravedad de la sepsis; varias cepas son más susceptibles que ot...

La sepsis, una respuesta inflamatoria sistémica a la infección, representa la principal causa de muerte en los pacientes críticamente enfermos 1. Las infecciones intra-abdominales, a menudo conduce a la sepsis polimicrobiana, representan el 20% de los casos de sepsis, que tienen una mortalidad considerable de hasta un 60% 2. La mortalidad asociada a la sepsis se debe principalmente a la disfunción multiorgánica con insuficiencia orgánica posterior 3,4. Investigación adicional en el mecanismo patogénico de esta enfermedad es una necesidad urgente de promover el desarrollo de terapias novedosas y más eficaces. El método de ligadura cecal y punción (CLP) es un procedimiento comúnmente utilizado para el modelado de la sepsis en vivo. Como el ciego está llena de bacterias, sus resultados de punción en la peritonitis polimicrobianas, la translocación de bacterias en la sangre (bacteriemia), shock séptico, disfunción de múltiples órganos y, en última instancia, la muerte 5. Se acepta en general que refleja CLP clínicarealidad con mayor precisión que las técnicas anteriores, tales como la inyección de endotoxina o bacterias incluso purificados en roedores, Por lo tanto, CLP se considera el estándar de oro (aunque no sin limitaciones) 6 para la inducción experimental y, por lo tanto, la investigación de la patogénesis de la sepsis. En esta monografía, se describen los protocolos diseñados para evaluar si los mecanismos patogénicos de la sepsis incluyen la autofagia. La autofagia, un proceso celular conservado evolutivamente, facilita la facturación de proteínas y orgánulos tales como mitocondrias dañadas y juega un papel importante en el aclaramiento de los patógenos intracelulares, incluyendo bacterias 7,8. Durante la autofagia, proteínas u orgánulos citosólicas son secuestradas en vesículas unidas a la membrana dobles llamados autofagosomas, que posteriormente se entregan a los lisosomas para degradación 9. Un número de proteínas se han identificado como los homólogos de mamíferos de genes relacionados con la autofagia (ATG),originalmente identificado en la levadura, que regulan el proceso de autofagia. La conversión de la proteína asociada a microtúbulos-1 de la cadena ligera 3B (LC3B) (homólogo de Atg8) de-I LC3B (forma libre) a LC3B-II (forma-fosfatidiletanolamina conjugado) representa un paso importante en la formación autofagosoma 9. Disfunción autofagia se asocia con el envejecimiento y enfermedades humanas incluyendo cáncer y trastornos neurodegenerativos 10. Por otra parte, la autofagia afecta la inmunidad innata y adaptativa, tales como la presentación de antígenos, el desarrollo de linfocitos y la secreción de citoquinas por las células inmunes 8. Por lo tanto, parece razonable que la autofagia también podría desempeñar un papel en la respuesta inflamatoria sistémica a la infección (es decir, en la sepsis). Hasta la fecha se han descrito varios métodos para evaluar el papel de la autofagia en la lesión tisular in vivo. Estos incluyen el uso de ratones que expresan la proteína de fluorescencia verde (GFP)-LC3 y la cuantificación de Autofagosomas en el tejido por microscopía electrónica (estos dos métodos se describen en esta monografía). Métodos adicionales incluyen la cuantificación de la expresión de la proteína de la autofagia en homogeneizados de tejido, y el análisis de flujo de autofagia (como se describe en otra parte) 11-13. El objetivo de esta revisión es proporcionar los protocolos actuales para la evaluación de la autofagia en vivo en el contexto de la sepsis experimental.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >GFP-LC3 Transgenic Mice</td>
			<td >Riken (Japan)</td>
			<td >RBRC00806</td>
			<td >GFP-LC3#53</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >568-0606</td>
			<td>Xylazine HCl Injection Vet</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >995-2949</td>
			<td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A405-20</td>
			<td>Histology Grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A407-1</td>
			<td>For Sterilizatiion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >silk surgical sutures 6-0</td>
			<td >Owens &#38; Minor</td>
			<td >2300-0078OG, 017624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >buprenorphine-HCl</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >614-5157</td>
			<td>Buprenex Ampules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde (37%) solution</td>
			<td >JT Baker</td>
			<td >S898-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >xylenes</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP monoclonal antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G10362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoescht</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>944403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OCT</td>
			<td >VWR scientific</td>
			<td >25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan Black</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-203760</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate</td>
			<td >Electron microscopy Sciences</td>
			<td>15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >propylene oxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>240397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar 100 resin</td>
			<td >Agar scientific</td>
			<td > R1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>46346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >methylnadic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-benzyldimethylamine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>185582</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice

La sepsis experimental puede ser inducida en ratones usando el método (CLP), que causa la sepsis polimicrobiana ligadura y punción cecal. Aquí, se proporciona un protocolo para inducir la sepsis de diversa gravedad en ratones utilizando la técnica de CLP. La autofagia es una respuesta de los tejidos fundamentales para el estrés y la invasión de patógenos. Dos protocolos actuales para evaluar la autofagia in vivo en el contexto de la sepsis experimental también se presentan aquí. (I) Los ratones transgénicos que expresan la proteína de fluorescencia verde proteína de fusión (GFP)-LC3 son sometidos a CLP. Mejora localizada de la señal de GFP (puntos lagrimales), tal como se ensayaron, ya sea por ensayos inmunohistoquímicos o confocal, se puede utilizar para detectar la formación de autofagosoma mejorada y, por lo tanto, la activación alterada de la vía de la autofagia. (II) mejorada vacuola de autofagia (autofagosoma) formación por unidad de área de tejido (como un marcador de la estimulación de la autofagia) puede cuantificarse utilizando microscopía electrónica. El estudio de las respuestas autofágicas a sepsis es un borrador críticoonent de la comprensión de los mecanismos por los que los tejidos respondan a la infección. Resultados de la investigación en esta área pueden contribuir en última instancia, hacia la comprensión de la patogénesis de la sepsis, lo que representa un problema importante en la medicina de cuidados críticos.

La bacteriemia está presente en los ratones a las 6 horas después de la sepsis inducida por el CLP 14. Los signos clínicos de sepsis (incluyendo escalofríos, taquipnea y la actividad motora) aparecen aproximadamente 12 horas después del procedimiento. Los ratones sometidos a CLP comienzan a morir en alrededor de 18 horas después de la inducción de peritonitis. Cuanto más grave es la sepsis tanto más aumenta la letalidad es 15. En detalle, la sepsis de alto grado provoca una mortalidad del ...

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Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

La sepsis experimental puede ser inducida en ratones usando el método (CLP) ligadura y punción cecal. Los protocolos actuales para evaluar la autofagia in vivo en el contexto de la sepsis inducida por CLP se presentan aquí: Un protocolo para la medición de la autofagia utilizando ratones (GFP)-LC3, y de un protocolo para la medición de la formación de autofagosoma por microscopía electrónica.

La ligadura y punción cecal inducida por sepsis como un modelo para estudiar la autofagia en ratones

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

cecal-ligation-puncture-induced-sepsis-as-model-to-study-autophagy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.2K vistas.  Brigham and Women's Hospital.  La sepsis experimental puede ser inducida en ratones usando el método (CLP) ligadura y punción cecal. Los protocolos actuales para evaluar la autofagia in vivo en el contexto de la sepsis inducida por CLP se presentan aquí: Un protocolo para la medición de la autofagia utilizando ratones (GFP)-LC3, y de un protocolo para la medición de la formación de autofagosoma por microscopía electrónica. 

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Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for establishing new therapeutic approaches in this field. Therefore, animal models are required that are able to closely mimic the human disease and also sufficiently deal with scientific questions. The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. In this model, a small stent is surgically inserted into the ascending colon of mice or rats leading to a continuous leakage of intestinal bacteria into the peritoneal cavity. The procedure results in peritonitis, systemic bacteraemia, organ infection by gut bacteria, and systemic but also local release of several pro- and anti-inflammatory cytokines. The lethality of CASP can be controlled by the diameter of the inserted stent. A variant of this model, the so-called CASP with intervention (CASPI), raises opportunity to remove the septic focus by a second operation according to common procedures in clinical practice. CASP is an easily learnable and highly reproducible model that closely mimics the clinical course of abdominal sepsis. It leads way to study on questions in several scientific fields e.g. immunology, infectiology, or surgery.

Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. This article describes the surgical procedure of CASP. The CASP model and its variants allow the systematic investigation of various problems concerning the subject of sepsis.

Colón ascendens stent Peritonitis (CASP) - un modelo normalizado para la sepsis abdominal polimicrobiana

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

Investigación

Inmunología e Infección

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Disección de Host-virus Interacción en la replicación lítica de un Herpesvirus Modelo

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

El uso de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como organismo modelo para estudiar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infección

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

El uso de<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

Un modelo de ratón controlado para la Sepsis Neonatal polimicrobiana

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Diseño de Ligadura Cecal y Punción e Infección Intranasal Modelo Dual de Inmunosupresión Inducida por Sepsis

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Uso de la Invertebrada Galleria mellonella como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo Mycobacterium tuberculosis

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

La ligadura y punción cecal inducida por sepsis como un modelo para estudiar la autofagia en ratones

Resumen

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