Yöntemin amacı, bir antijen sunan hücre ve T-yardımcı lenfosit tarafından oluşturulan hücre-hücre çekimi bir örnek olan bir immünolojik sinaps oluşturmaktır. Amacımız immün sinaps oluşumunun ilk aşamalarını kaydetmek ve T-yardımcı lenfositte meydana gelen insan ticareti olaylarını kaydetmektir. Bu sonunda bağışıklık sinaps polarize salgı yol açacaktır.
Burada sunulan yaklaşım hücreden hücreye çekim, hızlandırılmış edinimi, geniş alan floresan mikroskopisi ve sonraki görüntü işlemeyi içerir. Bu, görüntülerin sinyal-gürültü oranını artırır, zamansal çözünürlüğü artırır ve ortaya çıkan sinaptik konjuge birkaç florokrom eşzamanlı edinimi sağlar ve floresan ağartma azaltır. Buna ek olarak, protokol immünfloresans boyama ve analiz sağlayacak son nokta hücre fiksasyon protokolleri ile uyumludur.
Bu protokol aynı zamanda lazer tarama floresan mikroskopi ve diğer son teknoloji mikroskopi teknikleri ile de uyumludur. Prosedürü gösteren Ana Bello, bir lisansüstü öğrenci, Alejandro Garrido, bir teknisyen ve Solange Moreno, bir lisansüstü öğrenci olacaktır. Bu prosedüre başlamak için, sekiz mikrokuyu bir oda slayt her kuyuya fibronektin 150 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derece 30 dakika için bir saat kuluçka.
Kuluçka döneminden sonra, fibronektin aspire ve hafif sallayarak iki dakika boyunca 200 mikrolitre PVS ile her iyi yıkayın. Bu yıkamayı bir kez daha tekrarlayın ve ikinci yıkamayı kuyuda bırakın. Raji hücrelerinin 10 mililitrelik bir önkültürünü 15 mililitrelik V-alt tüpüne aktarın.
Santrifüj 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika. Supernatant atın ve yavaşça mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonu sıcak, tam orta hücre pelet resuspend. Raji hücrelerini etiketlemek için, kültür ortamındaki gerekli hücre sayısını iki mililitrelik bir tüpe aktarın.
Sekiz mikrokuyu hazne slayt için, hücre süspansiyon toplam 1.6 mililitre gereklidir. 10 mikromolar son konsantrasyonuna hücre izci mavi sınekleyin. Hücre izci mavi lekeli hücreleri yeniden askıya ve hazırlanan fibronektin kaplı oda slaytlar her kuyuya hücre süspansiyon 200 mikrolitre aktarın.
37 santigrat derecede oda slayt ıskartaya ve %5 karbondioksitle 30 dakika ile bir saat arasında kuluçkaya yat. Bundan sonra, Raji hücrelerinin yapıştırılmasından emin olmak için mikroskop üzerindeki oda slaytlarını hafifçe sallayın. Aşırı hücre izci mavi ortadan kaldırmak için sıcak, tam hücre kültürü orta ile her iyi iyi yıkayın.
Raji hücrelerinin plakaların altına yapışmasını ve birbirleri arasında boşluklar sergilediklerinden ve uyum sağlamadığından emin olun. Hücre birleşmesi %50-60 uygundur. İlk olarak, her bir kuyuya mililitre başına bir mikrogram konsantrasyonda Stafilokokal Enterotoksin E ekleyin.
Raji hücrelerinin süperantijenle darbele darbeye çevrildiğinden emin olun aksi takdirde Jurkat hücrelerinden gelen T-hücre reseptörü SCE'yi tanımaz ve sinaps oluşmaz. Oda kaydıranın en az 30 dakika boyunca %5 karbondioksitle 37 santigrat derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, milimetre başına 1 ila 2 milyon hücre arasında bir konsantrasyonda Jurkat hücrelerinin daha önce büyüyen bir kültür elde.
Bir faz kontrast mikroskop altında hücreleri gözlemleyin ve daha sonra 15 mililitre V-alt tüp hücreleri aktarın. Santrifüj 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika. Supernatant atın ve yavaşça mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonu sıcak, tam kültür orta hücreleri yeniden askıya.
Sonra 37 santigrat derece yüzde beş karbondioksit ile kültür jurkat hücreleri korumak kullanıma hazır olana kadar. Hücre izci mavi etiketli Staphylococcus Enterotoxin E darbeli Raji hücrelerini içeren oda slaytlarını kuvözden alın. Kuyunun bir köşesine yerleştirilen bir pipet ile her kuyudan kültür ortamını tek tek dikkatlice aspire edin.
Hemen hücre kültürü orta resuspended Jurkat hücrelerinin 200 mikrolitre ile orta değiştirin. Bir zaman atlaması yapılıyorsa, hızla mikroskoba ilerleyin. Mikroskop evreleme garson üzerinde odacıklı slayt bulun ve bazı uygun alanlar seçin.
Görüntülemeden önce mikroskop ve kuluçka odasını hazırlayın. Jurkat hücreleri Raji hücrelerini içeren her kuyuya eklendikten sonra, önceden ısıtılmış mikroskop taki mikrowelllenmiş haznesini hızlı bir şekilde bulun ve bazı XY pozisyonlarını seçin. Eğer sadece bir uç nokta deneyi planlanırsa, oda kaydıraklarını 37 santigrat derecede yüzde beş karbondioksitle bir ila iki saat kuluçkaya yatırın.
Kültür döneminden sonra, eşlekap oluşumunu denetleyin ve daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi eşlekapları düzeltin. Hücreleri düzeltmek için, FCS olmadan sıcak RPMI ekleyin ve yavaşça sallayın. RMPI aspire ve her iyi pfa veya prechilled aseton 200 mikrolitre ekleyin.
Oda sıcaklığında veya buz üzerinde 20 dakika boyunca oda slayt kuluçka. Sonra her iki iyi iki kez PVS ile yıkayın ve söndürme çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin. Bu çalışmada Jurkat-Raji immün sinaps konjugatesi üretilmiş ve immünolojik sinaps oluşumunun erken evreleri doğru bir şekilde görüntülenmiştir.
Bu strateji aynı anda zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirirken immünolojik sinaps oluşumunu indükler. Bu teknikten elde edilen temsili sinaptik Jurkat-Raji konjugaları burada, iletim kanalının bir görüntüsü, hücre izci mavi kanal ve bu kanalların her ikisi de birleştirilmiş bir görüntü de dahil olmak üzere burada gösterilmiştir. Bazı sinaptik konjugatlar görülebilir, bu karmaşık konjugatlar sadece bir Jurkat hücre ve birkaç Raji hücreleri, oluşan dahil.
Azalan hücre konsantrasyonları karmaşık hücresel konjugatların oluşumunu atlatacak, ancak polarize trafiğin sonraki analizi için yeterli hücre konjugatları sağlamayabilir, bu da ortaya çıkan sinaptik konjugatları bulma ve görüntüleme şansını azaltacaktır. GFP-CD63 floresan kanal görüntülerinin dekonvolution geniş alan optik seçeneği ve uygun optik parametreleri kullanarak uygun bir dekonvolution yazılımı ile gerçekleştirilir. Bu deconvoluted kanal daha sonra hücre izci mavi geniş kanal birleştirildi.
Hem sinyal-gürültü oranı hem de netlik te bir iyileşme vardır. Sabit bir immünolojik sinaps eşlegate temsili Z yığını burada gösterilmiştir. İmmünofloresanf F-aktin görselleştirmek için phalloidin kullanılarak yapılır, Anti-CD63 MVB görselleştirmek için, ve anti-gama-tubulin MTOC görselleştirmek için ise hücre izci mavi Raji hücreleri etiketli.
Jurkat hücrelerinin isteğe bağlı transfixing canlı hücrelerde salgı granüllerinin trafik görselleştirme sağlayacaktır. Örneğin, GFP-CD63 ifade edildiğinde, GFP-CD63 dekore edilmiş veziküllerin hareketi kaydedilebilir. Protokol, immünoresans boyama protokolleri ve analizleri için daha fazla bağışıklık sistemi boyama protokolü sağlayacak son nokta fiksasyon protokolleri ile uyumludur.
Üretkenlik deneysel modelleri bağışıklık sinaps görüntüleme basitleştirmek olabilir ama bu modeller bağışıklık sinaps fizyolojik olmayan etkileşimler üretebilir antijen-sunucu hücreleri üzerinde karmaşık ve düzensiz yüzey taklit etmez. Burada açıklanan yaklaşım, bağışıklık sinapslarında meydana gelen bazı biyolojik karmaşıklıkları çoğaltmak ve doğrulamak için uygundur. Superantigen tehlikeli bir toksin bu yüzden eldiven giymek emin olun, ve tehlikeli kutu üzerinde kullanılan ucu bırakın.
