Yazarlar, bu makaleyi eleştirel incelemeleri ve düzenlemeleri için Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi ve Jeff Durban'a teşekkür ediyorlar. Yazarlar ayrıca Allison Schwartz'a teknik destek için teşekkür ediyor.

1. Protein Numune Hazırlığı
(Hücre kültüründen protein çıkarmak için tipik bir prosedür açıklanmıştır)
<ol><li>HeLa hücre kültürü çanağını buza yerleştirin ve hücreleri buz gibi Tris tamponlu Salin (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl) ile yıkayın.</li>
	<li>TBS'yi aspire edin, daha sonra fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 100 mm bulaşık buz gibi RIPA tamponu (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, % 1 NP-40, % 0.5 sodyum deoksikollat, % 0.1 SDS) ekleyin.</li>
	<li>Soğuk bir plastik hücre kazıyıcı kullanarak yapışan hücreleri tabaktan kazıyın; hücre süspansiyonu önceden soğmuş bir mikrosantrifüj tüpüne hafifçe aktarın.</li>
	<li>Bir rotatörde 4 °C'de 30 dakika boyunca sabit ajitasyon sağlayın.</li>
	<li>4 °C önceden ısıtılmış santrifüjde 20 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürün.</li>
	<li>Tüpü santrifüjden yavaşça çıkarın ve buza yerleştirin. Süpernatant'ı buzda tutulan taze bir tüpe aktarın ve peletiği atın.</li>
	<li>Bir protein tahlili yapmak için küçük bir hacim (10-20 μl) lysate çıkarın. RC DC test kitini kullanarak her numune için protein konsantrasyonu belirleyin.</li>
	<li>Gerekirse, -20 °C'de uzun süreli depolama için protein örneklerini aliquot. Tekrar dondurma ve çözülme döngüleri protein bozulmasına neden olur ve kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Her numuneden yaklaşık 20 μg alın, eşit hacimde 2x Laemmli Örnek Tamponu ekleyin (%4 SDS, %10 2-mercaptoethanol, %20 gliserol, %0,004 bromofenol mavisi, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8).</li>
	<li>Her hücre lisat'ı 5 dakika boyunca 95 °C'de numune tamponunda ısıtın.</li>
	<li>1 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde 16.000 x g'da santrifüj.</li>
</ol>2. Lekesiz Jeller ile Jel Elektroforezi (~ 30 dk)
<ol><li>Bir Kriter TGX Herhangi bir KD lekesiz prekast jel (bir midi format jel) alın, tarağı ve bandı kasetin altından çıkarın.</li>
	<li>Kaseti Kriter hücresine yerleştirin ve entegre üst tampon odasını 60 ml çalışan tamponla doldurun (25 mM Tris, 190 mM glisine, %0,1 SDS, pH 8,3). Kuyuları çalışan tamponla durulayın.</li>
	<li>Alt tampon tankının her yarısını işaretli doldurma çizgisine 400 ml çalışan tamponla doldurun.</li>
	<li>Protein örneklerini ve uygun protein belirteçlerini yükleyin.</li>
	<li>Kapağı tankın üzerine yerleştirin, renk kodlu muz fişlerini kapaktaki ilgili krikolarla hizalayın.</li>
	<li>Jeli 200 V'ta ~30 dakika veya 300 V'ta 20 dakika çalıştırın.</li>
</ol>3. Protein Ayırma Kalitesini Kontrol Etmek için Chemidoc MP Sistemini Kullanarak Lekesiz Jel Görüntüleme (~5 dk)
<ol><li>Jel kaseti hücreden çıkarın. Kaseti açmak ve jeli serbest bırakmak için Kriter Hücresi kapağındaki jel kaset açma aracını kullanın.</li>
	<li>ChemiDoc MP görüntüleyicinin UV numune tepsisinin ortasına birkaç mililitre su uygulayın. Jeli kasetten dikkatlice kaldırın ve tepsiye yerleştirin.</li>
	<li>Image Lab yazılımını başlatın ve lekesiz jel görüntüsünü (Şekil 1A) aşağıdaki ayarlarla yakalayın: Uygulama: lekesiz jel Jel aktivasyon süresi: 1 dk Görüntüleme alanı: kriter jel Görüntü pozlama süresi: en yoğun bantlar için otomatik olarak optimize edilmiştir</li>
	<li>Jeli numune tepsisinden çıkarın ve adımı aktarmak için hemen devam edin.</li>
</ol>4. Trans-Blot Turbo Sistemi ile Protein Transferi (~10 dk)
<ol><li>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Paketi açın; alt yığını (zarı içerir) transfer kasetinin tabanına yerleştirin.</li>
	<li>Jeli zarın üzerine yerleştirin, üst yığını jelin üzerine yerleştirin ve kabarcıkları yuvarlayın.</li>
	<li>Kapağı kaset tabanına yerleştirin ve kilitlemek için kadranı çevirin.</li>
	<li>Kaseti leke bölmesine yerleştirin.</li>
	<li>Önceden ayarlanmış bir Turbo programı seçip Ölçüt jel boyutunu (midi) seçerek aktarımı başlatın ve run tuşuna basın. Tipik bir çalışma sadece 7 dakika sürer.</li>
	<li>Aktarım bittiğinde, şişkin sandviçi sökün ve hem lekeyi hem de jeli deiyonize su içeren bir kaba yerleştirin.</li>
</ol>5. Protein Transfer Verimliliğini ve Kalitesini Kontrol Etmek için Chemidoc MP Sistemini Kullanarak Lekesiz Jel ve Blot Görüntüleme (~5 dk)
<ol><li>Transfer sonrası jeli ChemiDoc MP görüntüleyiç numune tepsisine yerleştirin.</li>
	<li>Image Lab yazılımını başlatın ve transfer sonrası jelin lekesiz görüntüsünü (Şekil 1B) aşağıdaki ayarlarla yakalayın: Uygulama: lekesiz jel Jel etkinleştirme süresi: yok Görüntüleme alanı: kriter jel Görüntü pozlama süresi: ön nakil jeli görüntüsü için pozlama süresiyle aynı</li>
	<li>Jeli örnek tepsiden çıkarın ve sonra lekeyi (Şekil 1C) aşağıdaki ayarlarla görüntüleyin. Görüntüleme yaparken lekeyi birkaç damla su veya TBST ile ıslak tutun. Uygulama: lekesiz leke Görüntüleme alanı: kriter jel Görüntü pozlama süresi: en yoğun bantlar için otomatik olarak optimize edilmiştir</li>
	<li>Şişkin zarı numune tepsisinden çıkarın ve TBST'li bir kaba yerleştirin (TBS'de% 0,1 Ara 20).</li>
</ol>6. Antikor İnkübasyonu
<ol><li>Blot'u 1 saat boyunca oda sıcaklığında TBST'de% 3 sığır serum albümini (BSA) çözeltisine yerleştirerek engelleyin.</li>
	<li>Blot'u 4 °C'de bir gecede, ilk hedef proteine karşı yetiştirilen fare birincil antikoru ve ikinci hedef proteine karşı yetiştirilen tavşan primer antikorunu içeren çözeltide kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Birincil antikoru içeren çözeltiyi dökün. Daha sonra, 5 dakika boyunca 20 ml TBST'de ajite ederek lekeyi yıkayın. Toplam 5 yıkama için 4x tekrarlayın.</li>
	<li>Dylight 650 konjuge Keçi-anti-fare antikor ve Dylight 549 konjuge Keçi-anti-tavşan antikor içeren ikincil antikor çözeltisinde oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Birincil antikoru içeren çözeltiyi dökün. Daha sonra, 5 dakika boyunca 20 ml TBST'de ajite ederek lekeyi yıkayın. Toplam 5 yıkama için 4x tekrarlayın.</li>
</ol>7. Image Lab Yazılımı ile Görüntüleme ve Veri Analizi- Toplam Protein Normalleştirme (~5 dk)
<ol><li>Yeni bir çok kanallı protokol açarak blot ' un çoklayıcı floresan görüntüsünü alın (Şekil 1E), üç floresan kanal yapılandırın ve protokolü çalıştırın. Kanal 1: Uygulama: blot Dylight 650 Görüntüleme alanı: kriter jel Görüntü pozlama süresi: en yoğun bantlar için otomatik olarak optimize edilmiştir Kanal 2: Uygulama: blot Dylight 549 Görüntüleme alanı: kriter jel Görüntü pozlama süresi: en yoğun bantlar için otomatik olarak optimize edilmiştir Kanal 3: Uygulama: lekesiz leke Görüntüleme alanı: kriter jeli Görüntü pozlama süresi: en yoğun bantlar için otomatik olarak optimize edilmiştir</li>
	<li>Çözümleme Aracı Kutusu'ndan Normalleştirme simgesini tıklatın ve şeritleri ve bantları algılamak için Evet'i tıklatın.</li>
	<li>Gerekirse şeritlerde ve bantlarda ayarlamalar yapmak için "Şeritler ve Bantlar araçlarını" seçin ve kullanın.</li>
	<li>Normalleştirme kanalı olarak lekesiz görüntüyü seçin.</li>
	<li>MW Analiz Araçları'nı seçin ve aşağıdaki kutuları işaretleyerek MW standart şeritlerini atayın.</li>
	<li>Normalleştirilmiş birimleri görüntülemek için araç çubuğundaki Çözümleme Tablosu'nu tıklatın. Tüm hesaplamalar, Normalleştirme Faktörü ve Normalleştirilmiş Birimler de dahil olmak üzere yazılım tarafından otomatik olarak gerçekleştirilecektir. Hedef protein bandı yoğunluk değerleri artık protein yükündeki değişim için ayarlanır. Bu, numuneler arasında hedef proteinlerin doğru karşılaştırılmasını sağlayacaktır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls:+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting.">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li><li>Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+four+housekeeping+proteins+in+elderly+patients+with+schizophrenia.">Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia.</a> J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).</li><li>Casta&#241;o, Z., Kypta, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+Proteins:+Limitations+as+References+During+Neuronal+Differentiation.">Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation.</a> Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).</li><li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+plasma+membrane+Ca-ATPase+and+stromal+interacting+molecule+1+expression+levels+for+Ca2++signaling+in+dystrophic+mdx+mouse+muscle.">Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).</li><li>Dittmer, A., Dittmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-actin+is+not+a+reliable+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis.</a> Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).</li><li>Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+carnosine+on+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+human+skeletal+muscle+fibers.">Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers.</a> J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).</li><li>Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+and+function+of+erythropoietin+receptors+in+the+kidney.">Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).</li><li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+proteins:+a+preliminary+study+illustrating+some+limitations+as+useful+references+in+protein+expression+studies.">Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies.</a> Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+genes;+expression+levels+may+change+with+density+of+cultured+cells.">Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).</li><li>G&#252;rtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stain-Free+Technology+as+Normalization+Tool+in+Western+Blot+Analysis.">Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis.</a> Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).</li><li>Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+SYPRO+Ruby-+and+Flamingo-stained+polyacrylamide+gels+to+Western+blot+analysis.">Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis.</a> Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).</li><li>Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kowalczykowski+SC+BRCA2+is+epistatic+to+the+RAD51+paralogs+in+response+to+DNA+damage.">Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage.</a> DNA Repair. , (2013).</li><li>Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+proteins+in+human+placenta:+general+protein+stains+are+the+benchmark.">Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark.</a> Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).</li><li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+temperature,+oxidative+stress,+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers.">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li><li>Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Oligomerization+Disrupting+Mutation+in+CRY&#913;A+Associated+with+Congenital+Cataract+in+a+South+Australian.">Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRY&#913;A Associated with Congenital Cataract in a South Australian.</a> , (2012).</li><li>Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+rice+reference+proteins+for+western+blotting.">Identification and validation of rice reference proteins for western blotting.</a> J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+varies+with+age+in+glycolytic+muscles+of+rats.">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).</li><li>Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+of+troponin+I+(fast)+increases+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+in+fast-twitch+muscle+fibres+of+rats+and+humans.">S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans.</a> J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).</li><li>Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).</li><li>Neill, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+Data+are+not+created+Equal.">All Data are not created Equal.</a> J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).</li><li>P&#233;rez-P&#233;rez, R., L&#243;pez, J. A., Garc&#237;a-Santos, E., Camafeita, E., G&#243;mez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fern&#225;ndez-Real, J. M., Peral, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+suitable+reference+proteins+for+expression+studies+in+human+adipose+tissue+with+relevance+to+obesity.">Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Pitfalls+of+Internal+Controls:+Validation+of+Reference+Genes+for+Analysis+by+qRT-PCR+and+Western+Blot+throughout+Rat+Retinal+Development.">Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Romero-Calvo, I., Oc&#243;n, B., Mart&#237;nez-Moya, P., Su&#225;rez, M. D., Zarzuelo, A., Mart&#237;nez-Augustin, O., de Medina, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Ponceau+staining+as+a+loading+control+alternative+to+actin+in+Western+blots.">Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots.</a> Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).</li><li>Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+GAPDH+regulation+in+tumor-cells+of+different+origin+under+hypoxic+conditions+in-vitro.">Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro.</a> BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).</li><li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+western+blots.">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots.</a> Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).</li><li>Welinder, C., Ekblad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+staining+as+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Coomassie staining as loading control in Western blot analysis.</a> J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).</li><li>You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+soybean+trypsin+inhibitor+as+an+external+loading+control+for+Western+blot+analysis+of+tear+proteins:+application+to+corneal+disease.">Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease.</a> Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).</li></ol>

Yazarlar, Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond ve Ning Liu Bio-Rad Laboratories, Inc.

Yukarıda açıklanan V3 lekesiz protokol, floresan batı şişkinliğinin çoklayıcı olması içindir. Ayrıca, chemiluminescent algılama kullanılarak batı şişkinliğinde de uygulanabilir. Çok katlı floresan batı blot protokolünde, lekesiz leke görüntüleri iki zaman noktasında elde edilir: 1) protein transferden hemen sonra; 2) antikor inkübasyonundan sonra multipleks floresan görüntüleme adımında. İlk lekesiz görüntü aktarım verimliliğini hesaplamak için, ikinci lekesiz görüntü ise yükleme kontrolü olarak kullanılır. Chemiluminescent yöntemi uygulandığında lekesiz ve hedef protein sinyalleri için multipleks görüntü almak mümkün değildir, çünkü chemiluminescent sinyali lekesiz kanalda da görünecektir. Bu durumda protein transfer adımından hemen sonra çekilen lekesiz görüntüyü yükleme kontrolü ve normalleşme analizi için kullanmanızı öneririz.
V3 batı iş akışı, yükleme kontrolleri olarak temizlik proteinlerini kullanan geleneksel batı blot iş akışına kıyasla aşağıdaki benzersiz avantajları sağlar:
İlk olarak, V3 iş akışı, ilgi çekici protein seviyesindeki değişiklikleri doğrulamak için pratik, kullanışlı ve daha güvenilir bir yükleme kontrolü sağlar. V3 protokolü, her örnekte ölçülen ilgi proteininin seviyesini normalleştirmek için toplam protein yükleme kontrolünü kullanır. Temizlik proteinlerini yükleme kontrolleri olarak kullanmanın iki tuzaklarından kaçınır: doymuş immünodeteksiyon ve belirli deneysel koşullar altında numuneler arasında tutarsız temizlik proteini ifade seviyeleri. Temizlik hizmetine karşı yönlendirilen antikorlarla sıyırma ve yeniden işleme adımları artık gerekli değil. Lekesiz teknolojiyi kullanarak, toplam protein ölçümü için Coomassie veya Sypro Ruby gibi lekelerle leke bırakmaya ve lekeden arındırmaya gerek yoktur. Bir blot görüntüsü elde etmek sadece birkaç saniye ve Image Lab yazılımını kullanarak toplam protein normalleştirmesini yapmak yaklaşık 5 dakika sürer.
İkinci olarak, V3 iş akışı, bilim adamlarının batı prosedürünü daha iyi kontrol etmelerini sağlar, çünkü prosedürü daha şeffaf hale getirir ve kalite kontrolü için birkaç kontrol noktası sunar. Lekesiz teknoloji yardımıyla araştırmacılar protein örneklerini hem jel hem de leke üzerinde görselleştirebilirler. Bilim adamları protein numune bütünlüğünü (bozulmuş veya bozulmamış), ayırma kalitesini (çökelenmiş veya çökememiş), transfer verimliliğini ve transfer kalitesini (hatta transfer veya değil) değerlendirebilirler. Bu kontrol noktaları, araştırmaların süreçte büyük kusurlar gördüğünde deneyi sonlandırmasına ve zayıf örnekler ve lekeler üzerinde zaman kaybetmekten kaçınmasına yardımcı oluyor. Bu teknoloji aynı zamanda bilim adamlarının membran sıyırma sonrası önemli miktarda protein kaybı olup olmadığını ve lekenin farklı bir hedefi yeniden işlemeye uygun olup olmadığını değerlendirmelerine yardımcı olur 4.
V3 western iş akışını kullanarak iyi deneyim ve kaliteli veri sağlamak için birkaç ipucu.
<ol><li>Jel çalışmasından hemen sonra jeli görüntüleyin. Leke bileşiği yıkayabileceğinden, jelin işlemdeki ilk görüntülemeden önce herhangi bir tampona batırılmaması.</li>
	<li>Protokoldeki tüm görüntüleri elde etmek için aynı görüntüleme alanını kullanın. Bu, yazılımın toplam protein normalleştirmesi gibi veri analizi için görüntüleri kaplamasına izin verecektir.</li>
	<li>Ön nakil ve transfer sonrası jelleri görüntülemede pozlama süresini tutarlı tutun. Bu, yazılımın aktarım verimliliğini nicel olarak ölçmesine izin verecektir.</li>
	<li>Leke görüntüsünü alırken zarı birkaç damla su veya TBST ile ıslak tutun. Bu, hedef protein tespiti için olası kirli arka plan sorunlarını önleyecektir.</li>
	<li>Çoklayıcı floresan batı şişkinliği için düşük floresan PVDF membran kullanın.</li>
</ol>UV aktivasyonundan sonra lekesiz molekülün triptofan kalıntılarına geri döndürülemez bir şekilde bağlı olduğunu belirtmek önemlidir. Bu geri dönüşü olmayan modifikasyon, epitop triptofan içeriyorsa monoklonal antikorlar kullanırken antijen tanımayı potansiyel olarak etkileyebilir. Poliklonal antikorların etkilenme olasılığı düşüktür, çünkü antijendeki birden fazla epitopları tanırlar. İlişkisiz lekesiz moleküller jelden ve zardan kolayca yıkanır ve bu nedenle antikor-antijen etkileşimlerine müdahale etmez.
Sonuç olarak, V3 batı iş akışı batı blot sürecini daha hızlı, daha şeffaf, nicel ve daha güvenilir hale getirir. Araştırmacılar artık verilerini daha güvenilir hale getirmek için batıdaki bir blot deneyinde toplam protein yükleme kontrolünü kolayca uygulayabilirler. V3 lekesiz iş akışı bir dizi laboratuvar tarafından benimsenmiştir ve yayınları, dergilerin lekesiz verileri batı blot22,17,7,8,5,23,18,15'de yükleme kontrolü olarak kabul ettiğini göstermiştir.

Batı blot çok yararlı bir tekniktir9, ancak, batı şişkinliği ile ilgili iki büyük zorluk vardır: uzun ve emek yoğun süreç ve veri kalitesi. Geleneksel bir protokol yaklaşık 2 gün gerektirir. Numune hazırlama, jel dökümü, protein elektroforezi ve transferi, membran bloke etme ve ardından antikor inkübasyonu, görüntüleme ve oldukça sık sıyırma, yeniden işleme ve son olarak veri analizi gibi birçok adımı içerir. Bu süreç boyunca, proses kontrolü için güvenilir ve esnek araçlar yoktur. Bu nedenle, her adımda hatalar ortaya çıkabilir ve bu hatalar veri yapıtları oluşturma potansiyeline sahiptir; bu nedenle, batı blotting'de yükleme kontrolleri hataları tanımlamak ve düzeltmek için gereklidir. Yükleme kontrolü genellikle her numunedeki bir referans proteinin protein seviyesini kontrol ederek eşit olarak sunulup sunulmamasını kontrol ederek yapılır. İnsanlar genellikle yükleme kontrolü olarak β-actin, β-tubulin, GAPDH gibi temizlik proteinlerini kullanırlar.
Batı blot verilerinin kalitesi güvenilir yükleme kontrolüne bağlıdır. Ancak, kontrolleri yüklemek için temizlik proteinlerini kullanırken iki meşru endişe vardır: 1) temizlik protein bantlarının antikor bazlı immünodeteksiyonları genellikle doymuş ve bu nedenle numuneler arasındaki yükleme farklılıklarını ayırt edemez30; 2) temizlik proteini ifade düzeyi belirli deneysel koşullar altında örneklerde değişebilir, örneğin, siRNA tedavisi, hücre ölümü, hücre farklılaşması, vb. Bu kaygılar nedeniyle, bilimsel dergiler artık "nicel karşılaştırmalar için, doğrusal sinyal aralıklarına sahip uygun reaktifler, kontroller ve görüntüleme yöntemlerinin kullanılmasını" gerektirmektedir (Doğa kılavuzu). Benzer şekilde, Klinik Araştırma Dergisi editörleri daha güvenilir yükleme kontrolleri istiyor24. Bu nedenlerden dolayı, yükleme kontrolü olarak kullanılabilmesi için bir temizlik proteini doğrulanması gerekir. İlk olarak, immünodeteksiyon yönteminin doğrusal dinamik aralığında ölçüldüğünden emin olmak gerekir14,29. İkincisi, tüm örneklerde tutarlı bir şekilde ifade edildiğinden emin olmak gerekir26,31,25,19,20.
Güvenilir bir yükleme kontrolüne alternatif bir çözüm, blottan toplam protein ölçümü kullanmaktır. Bazı araştırmacılar, her şeritteki toplam protein sinyalini yükleme kontrolü olarak ölçmek için Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S ve lekesiz teknoloji gibi toplam protein lekeleri ile lekeleri16,20,13,27,1,4,12. Toplam protein yükleme kontrolü, temizlik proteinleri ile ilişkili tuzakları önler. İlk olarak, her örnek için yüklenen protein miktarının gerçek bir yansımasıdır. İkincisi, toplam protein lekesi batı blot analizi için ortak yükleme aralığında mükemmel doğrusal dinamik aralık sergiler (karmaşık bir hücre lisatının 10-50 μg proteini) ve numuneler arasındaki yükleme farkını doğru bir şekilde ayırt eder12.
Lekesiz teknoloji, benzersiz bir bileşiğin akrilamid jel çözeltisinde karıştırıldığı ve atılan jelde eşit olarak dağıtıldığı yeni bir toplam protein boyama yöntemidir. Elektroforezi tamamlandıktan sonra jel en az 1 dakika UV ışığına maruz kalır, böylece leke bileşiği proteindeki triptofan kalıntıları ile reaksiyona sokulur. Proteinler, ChemiDoc MP sistemi gibi lekesiz etkin bir görüntüleyicide görselleştirilebilen ve ölçülebilen güçlü bir floresan sinyali vermek için UV ışığı altında heyecan verici hale gelir. Lekesiz bileşiğin kendisi, UV ışığını emmez, bu da jel görüntünün düşük arka planına neden olur. Triptofan kalıntılarının modifikasyonu geri döndürülemez ve proteinler sadece jelde değil, aynı zamanda protein transferden sonra herhangi bir zamanda leke üzerinde de görselleştirilebilir.
Lekesiz teknoloji, geleneksel iş akışıyla ilgili önemli şikayetleri, özellikle temizlik proteinlerini yükleme kontrolleri olarak kullanma endişelerini gidermek için V3 Western workflow'da(Şekil 1)uygulanmaktadır. Bu iş akışını kullanarak, biri olabilir: 1) yaklaşık 20-30 dakika içinde bir jel çalıştırmak, 2) jel çalışmasından sonra 5 dakika içinde numune bütünlüğünü ve protein ayırma kalitesini kontrol edin; 3) proteinleri 3-10 dakika içinde aktarın; 4) transfer verimliliğini nicel olarak kontrol edin; ve 5) en önemlisi, toplam protein yükleme kontrolünü kullanarak ilgi proteini seviyesindeki değişiklikleri doğrulayın.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>567-8093 </td>
 <td>Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4157 </td>
 <td>Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-5061</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Criterion Cell </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>165-6100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4155</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChemiDoc MP System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-8280</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

v3 stain-free workflow for a practical, convenient, and reliable total protein loading control in western blotting

Batı lekesi çok kullanışlı ve yaygın olarak benimsenen bir laboratuvar tekniğidir, ancak yürütülmesi zordur. Bir deneyci birkaç adımın sonuncusuna kadar başarıyla gerçekleştirilip gerçekleştirilmediğini bilmediğinden, iş akışı genellikle "kara kutu" olarak karakterize edilir. Ayrıca, batı blot verilerinin kalitesi, batı blotting süreci boyunca etkili kalite kontrol araçlarının eksikliği nedeniyle bazen zorlanmaktadır. Burada, geleneksel batı blot protokolüyle ilgili önemli endişeleri gidermek için lekesiz teknoloji uygulayan V3 batı iş akışını açıklıyoruz. Bu iş akışı araştırmacılara izin verir: 1) bir jeli yaklaşık 20-30 dakika içinde çalıştırmak; 2) jel çalışmasından sonra 5 dakika içinde numune ayırma kalitesini görselleştirmek; 3) proteinleri 3-10 dakika içinde aktarmak; 4) aktarım verimliliğini nicel olarak doğrulamak; ve en önemlisi 5) toplam protein yükleme kontrolünü kullanarak ilgi proteini seviyesindeki değişiklikleri doğrulamak. Bu yeni yaklaşım, β-actin, β-tübulin, GAPDH gibi temizlik proteinleri için lekenin soyulması ve yeniden işlenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır.

1. Lekesiz jel görüntüleri ile numune bütünlüğünün, protein ayırma kalitesinin ve transfer verimliliğinin değerlendirilmesi.
HeLa hücrelerinden protein özü 300 V'ta 18 kuyulu Kriter AnyKD TGX lekesiz jel üzerinde 20 dakika boyunca ayrıldı. Protein örnekleri dört farklı miktarda 3x yüklendi (Şeritler 1-3, 40 μg; Şeritler 4-6, 30 μg; Şeritler 7-9, 20 μg; Şeritler 10-12, 10 μg). Jel UV ışığı altında 1 dakika aktive edildi. Şekil 2A protein ayrımından hemen sonra elde edilen jel görüntüsünü göstermektedir. Protein numune bütünlüğü(örneğin bozulma) ve ayırma kalitesi(örneğin protein çökeltme) bu jel görüntüsü ile görsel olarak değerlendirilebilir. Proteinler daha sonra Trans-Blot Turbo kullanılarak nitroselüloz membrana 7 dakika aktarıldı. Şekil 2B, transfer sonrası jelin lekesiz görüntüsünü göstermektedir. Her iki görüntü de aynı pozlama süresiyle (6,8 sn) elde edildi. Transfer verimliliğini ölçmek için 3. Image Lab yazılımındaki ses seviyesi aracı kullanılarak, her iki jel görüntüde de 3. Bu kutulardan elde edilen hacim değerlerine dayalı hesaplama, her iki şeridin aktarım verimliliğinin% 80 olduğunu gösterdi (Şekil 2C). Bu deneyde, AnyKD TGX jeli küçük ve orta ölçekli hedef proteinleri incelemek için seçildi ve büyük proteinlerin transferi için optimize edildi. Transfer verimliliğinin optimize edilmesi, daha düşük yüzdeli jel kullanımını gerektirir(örneğin% 4-20) ve/veya büyük proteinlerin transferini kolaylaştırmak için transfer süresinin ayarlanmasından. 2. Lekesiz toplam protein yükleme kontrolü, ilgi proteini seviyesindeki küçük bir değişikliği ölçmek için batı şişkinliğinde temizlik yükleme kontrolüne güvenilir bir alternatiftir.
MCM-7, ışınlama tedavisinden sonra Lenfoblastoid hücre hatlarında (LCL) seviyesi %20-50 oranında azalan bir DNA lisanslama replikasyon faktörüdür. Bu deneyde, dört kontrol ve ışınlama ile tedavi edilen Lenfoblastoid hücre hattı (LCL) kültürlerinin lysates (her biri 30 μg) 12 kuyulu Kriter AnyKD TGX lekesiz jel üzerinde ayrılmıştır. Jel UV ışığı altında 1 dakika aktive edildi ve Trans-Blot Turbo tarafından immünblotting için bir PVDF membranına aktarıldı. Temizlik proteini GAPDH (yeşil), bir tavşan antikoru (Cell Signaling Technology, ABD, 1:2,500) ve bir Dylight 549 konjuge Goat-anti-rabbit antikoru (Rockland, ABD, 1:20,000) ile araştırıldı. İlgi çekici MCM-7 (kırmızı) proteini bir fare antikor (Abcam, ABD, 1:1.000) ve bir Dylight 649 konjuge Keçi-anti-fare antikor (Rockland, 1:10.000) kullanılarak araştırıldı.
Şekil 3A, dört kontrol ve ışınlama tedavisi gören LCL örneklerinde tespit edilen toplam proteinlerin (mavi), MCM-7 (kırmızı) ve GAPDH'nin (yeşil) çok katlı floresan görüntüsünü göstermektedir. Şekil 3B, her numunedeki toplam protein desenlerini (30 μg) gösteren aynı lekenin lekesiz bir görüntüsüdür. Görüntü laboratuvarı yazılımı, her şeritte MCM-7, GAPDH ve toplam protein hacmini ölçmek için örnek şeritleri (mavi kutular) seçti. MCM-7 seviyeleri lekesiz toplam protein ölçümüne veya GAPDH'ye karşı normalleştirildi. Normalleştirilmiş MCM-7 protein düzeyleri istatistiksel olarak analiz edilmiş ve ortalama MCM-7 protein bandı hacmi ve standart sapma (n=4) grafikte sunulmuştur (Şekil 3C). Her iki normalleşme yöntemi de küçük bir düşüş olduğunu ortaya koydu (%25 civarında) ışınlama tedavisinden sonra MCM-7 protein seviyelerinde. Toplam protein normalleştirmesi ile veriler, yükleme kontrolü olarak GAPDH'den daha küçük bir standart sapma sergiledi.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> Şekil 1. V3 Batı İş Akışı. V3 iş akışı sol sütunda 4 adımda gösterilmiştir. İş akışında kullanılan başlıca araçlar ve reaktifler her adımda gösterilir. Her adım için tahmini süre de dahildir. Sağ sütun, V3 iş akışında en az 4 görüntü oluşturulabileceğini gösterir. Her veri parçasının kullanımı açıklanmıştır. Pretransfer jel, transfer sonrası jel ve lekenin lekesiz görüntüleri (A, B, C) geleneksel batı şişkinlik teknikleri ile kolayca oluşturulamaz; Bu görüntüler ve veriler, bilim adamının batı blot iş akışının kontrolünü ve tekrarlanabilirliğini iyileştirmek için prosedür boyunca önemli bilgiler ve kontrol noktaları sağlar. Hedef protein sinyalleri, tespitte HRP konjuge edilmiş ikincil antikor uygulanmışsa bir chemiluminescent blot görüntüsünde(D)veya aynı blot üzerinde aynı anda birden fazla hedef proteini tespit etmek için birden fazla floresan batı şişkinliği yapıldıysa floresan bir blot görüntüsünde(E)yakalanabilir. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> Şekil 2. Numune bütünlüğünü, ayırma kalitesini ve aktarım verimliliğini değerlendirmek için V3 batı iş akışındaki ön nakil ve transfer sonrası jellerin lekesiz görüntüleri. (A) Öntransfer jel lekesiz görüntü. (B) Transfer sonrası jel lekesiz görüntü. (C) Protein transferi verimlilik ölçümü.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> Şekil 3. Lekesiz toplam protein ölçümünün GAPDH immünodeteksiyonu ile karşılaştırılması, ilgi çekici protein seviyesini normalleştirmek için yükleme kontrolleri olarak. (A) Floresan batı leke görüntüsü. (B) Lekesiz lekeli görüntü. (C) Normalleştirilmiş MCM-7 protein seviyeleri. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting at JoVE.com

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

V3 iş akışı lekesiz jeller kullanan batı lekeli bir prosedürdür. Lekesiz teknoloji, araştırmacıların protein ayırma kalitesini görselleştirmelerine, transfer verimliliğini doğrulamalarına ve en önemlisi güvenilir bir yükleme kontrolü olarak toplam protein nicelemesini kullanarak ilgi proteinindeki değişimi doğrulamalarına olanak tanır.

Batı Blotting'de Pratik, Kullanışlı ve Güvenilir Toplam Protein Yükleme Kontrolü için V3 Lekesiz İş Akışı

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

JoVE Journal

Biology

22.5K Görüntüleme.  Bio-Rad Laboratories. V3 iş akışı lekesiz jeller kullanan batı lekeli bir prosedürdür. Lekesiz teknoloji, araştırmacıların protein ayırma kalitesini görselleştirmelerine, transfer verimliliğini doğrulamalarına ve en önemlisi güvenilir bir yükleme kontrolü olarak toplam protein nicelemesini kullanarak ilgi proteinindeki değişimi doğrulamalarına olanak tanır.

Video: V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Biyoloji

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to elaborate distinct aspects of motor function and to determine even subtle loss of movement capacity. To enhance efficacy and resolution of testing, tests should permit qualitative and quantitative measures of motor function and be sensitive to changes in performance during recovery periods. The present study describes a new task to assess skilled walking in the rat to measure both forelimb and hindlimb function at the same time. Animals are required to walk along a horizontal ladder on which the spacing of the rungs is variable and is periodically changed. Changes in rung spacing prevent animals from learning the absolute and relative location of the rungs and so minimize the ability of the animals to compensate for impairments through learning. In addition, changing the spacing between the rungs allows the test to be used repeatedly in long-term studies. Methods are described for both quantitative and qualitative description of both fore- and hindlimb performance, including limb placing, stepping, co-ordination. Furthermore, use of compensatory strategies is indicated by missteps or compensatory steps in response to another limb&#x2019;s misplacement. 

The ladder rung walking task is a new test to assess skilled walking and measure both forelimb and hindlimb placing, stepping, and inter-limb co-ordination.

Görev Yürüyüş Merdiven Basamak: Puanlama Sistemi ve Pratik Uygulama.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

Bir Zebra balığı Düzenli Bakım ve Onarım (<em&gt; Br.rerio</em&gt;) Laboratuvar: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Plazma Protein Koruma Kan Alma Kitleri Genomik DNA Ayıklama Pratik ve Yeni Bir Yöntem

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Nonexperts için Phylogenetics İçin Pratik Kılavuz

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...