Dr. Hasan Yardimci teşekkür ediyoruz ve Dr.Sevim Yardimci Francis Crick Enstitüsü tarz için Dr Yujie güneş Pekin Üniversitesi ve Dr Chunlai Chen, Dr. Daniel Duzdevich, Columbia Üniversitesi, Dr Eric C. Greene'in laboratuarından tek molekül denemelerinde yardımcı Tsinghua Üniversitesi yararlı tartışma için. Bu çalışmada, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin 31371264, 31401059, CAS disiplinler arası yenilik takım ve Newton gelişmiş Bursu (NA140085) Royal Society tarafından desteklenmiştir.

1. λ-ARS317 DNA substrat hazırlanması
<ol><li>DNA substrat İnşaat ve ambalaj<ol>
<li>Xhokullanarak yerel λ DNA sindirmek ben enzim; tomurcuklanma genomik DNA ARS317 Maya 20 içeren primerler kullanılarak 543 bir bp DNA parçası taşıyan yükseltmek bp homolog dizileri akış yukarı ve aşağı Xhoben lambda DNA enzim ücreti. 100 Ekle ng Xhoλ DNA ve 10 sindirilmiş ng DNA parçası Homolog rekombinasyon tepki sisteminin 10 µL ve tepki için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Rekombinasyon λ DNA paketlemek için 25 µL lambda ambalaj özler rekombinasyon ürün içine ekleyin ve tepki için 90 dk 30 ° C'de kuluçkaya. Sonra bir ek 25 µL lambda ambalaj özler tepki tüp içine ekleyin. 90 dk 30 ° C'de tepki kuluçkaya devam'i tıklatın.</li>
		<li>Steril seyreltme arabelleği (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) 500 µL reaksiyon sistemine ekleyin ve karışımı yavaşça baş aşağı birkaç kez tüp çevirerek. Kloroform 25 µL eklemek, karışımı yavaşça ve 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>Paketlenmiş fajının 100 µL ve bakteri LE392MP 100 µL ekleyin (0,8 - kültürlü LB orta 10 mM ile MgSO4ekleme kullanarak 1.0) yeni bir tüp içine. 37 ° C'de 15 dakika boyunca kuluçkaya.</li>
		<li>4 mL oftop agar (LB orta + %0,7 agar + 10 mM MgSO448 ° C-soğutmalı,) içine 200 µL faj-bakteri karışımı ekleyin. Hemen yanında dönme tüp baş aşağı birkaç kez karıştırın ve önceden ısıtılmış (37 ° C) LB tabağa dökün.</li>
		<li>37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya ve PCR kullanarak ve sıralama λ-ARS317 plak ekran.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA substrat arıtma sıvı lysates11,18<ol>
<li>Steril GKD2O 10 mm MgCl2 ve 10 nM CaCl2200 µL bir plak seç. 200 µL bakteri LE392MP (LB orta kültürlü geceleme) ile karıştırın ve 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>NZCYM 100 mL faj-bakteri karışımı ekleyin (10 g/M NZ-Amin, 5 g/L maya ekstresi, 5 g/M NaCl, 1 g/L Casamino hidrolizat ve 2 g/L MgSO4·7H2O) orta ve kültür 37 ° C'de 7 h için Kloroform kültür içine 250 µL ekleyin ve başka bir 10 dakikadır sallamak.</li>
		<li>Kültür bir 200 mL şişe aktarın. NaCl (1 M son konsantrasyonu) 5,8 g ekleyin, el ile çözülmeye karıştırın ve 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>12.000 x g 4 ° C'de hücre artıkları kaldırmak için 10 dk de santrifüj kapasitesi. 200 mL şişe süpernatant toplamak ve8000 (m/V) % 10 PEG ekleyin. Manyetik karıştırma aparatı tarafından dağıtılması ve 30 dakika veya daha uzun buza kuluçkaya karıştırın.</li>
		<li>12.000 x g 10 dk 4 ° C'de bakteriyofaj çökelti, santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Çökelti fajının seyreltme arabellek 2 mL resuspend. 15 mL tüp içine aktarmak ve 10 µL RNase (son 20 µg/mL bölgedir) ve (son 5 µg/mL bölgedir) DNaz 40 µL ekleyin. 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>0,3 2 mL ekleyin M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + %1.25 SDS, 15 µL İndinavir K (son konsantrasyonu ise 10 µg/mL). 10 dk 65 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Önceden soğutulmuş potasyum asetat (3 M, pH 4,8) 2 mL ekleyin ve buz için 10 dk metroyla kuluçkaya.</li>
		<li>8000 x g 4 ° C'de çözünmez malzemeleri kaldırmak için 10 dk de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>İsopropanol 0.7 x hacmi süpernatant ekleyin. Baş aşağı birkaç kez tüp çevirerek mix ve oda sıcaklığında (RT) 2 min için kuluçkaya.</li>
		<li>RT DNA çökelti, 10 min için 8000 x g, santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırın.</li>
		<li>% 70 ile etanol tarafından Santrifüjü 8.000 x g 10 dakika süreyle de kaldırdıktan sonra süpernatant DNA yıkayın.</li>
		<li>Yavaşça 500 µL TE tampon (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) kullanarak DNA elute ve DNA 1,5 mL tüp içine aktarın.</li>
		<li>İki kez fenol kullanarak DNA ayıklamak: kloroform Santrifüjü 10 min için 8000 g de tarafından.</li>
		<li>0.7 x birim isopropanol ile çökelti. Ters tüp yavaşça aşağı ve 8.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi dönüm tarafından karıştırın.</li>
		<li>Bir kez % 70 etanol ile yıkayın, TE 200 µL içinde resuspend. DNA toplama ölçmek ve 12.5 µg aliquots-20 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
<ol><li>Biotinylated oligonucleotides fazdan için (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotin-3') yerli sol sonuna tamamlayıcı λ DNA, eklemek 1 µL (100 µM) oligonucleotides, GKD2O, 1 µL 10 ligaz arabellek x 7,5 µL ve T4 PNK 0.5 µL. Tepki 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>1 µL T4 PNK ve GKD2O toplam hacmiyle 30 µL. λ-ARS317 fazdan, λ-ARS317 12.5 µg, 10 ligaz arabellek x 3 µL eklemek için 3 h için 37 ° C'de tepki kuluçkaya.</li>
	<li>λ-ARS317 ile oligonucleotides tavlamak için fosforile oligonucleotides 0.5 µL, GKD2O, 10 × ligaz arabelleği fosforile λ-ARS317 tüp içine 25 µL 195 µL ekleyin. Tüp ters çevirerek karışımı yavaşça ve 65 ° c 5 dk. dönüş blok ısıtıcı ve izin 33 ° C blok aşağıda örnek soğumaya kapalı için kuluçkaya.</li>
	<li>λ-ARS317 ile oligonucleotides ligate T4 DNA ligaz 1 µL ve 0,63 µL ATP (200 mM) ekleyin. Tüp ters çevirerek karışımı yavaşça ve 2 saat veya 4 ° C için oda sıcaklığında gecede kuluçkaya. 4 ° C'de 1 ay için saklayın. Not: DNA'bozulmaması için karıştırma merdivenlerden yavaşça tüp baş aşağı pipetler kullanarak karıştırma yerine çevirerek yapılmalıdır.</li>
</ol>3. Coverslip temizlik ve Functionalization
<ol><li>Temizlik Coverslip<ol>
<li>Yer 20 coverslips 4 boyama kavanoz (5 coverslips/kavanoz), içine 30 dakika içinde etanol için solüsyon içeren temizleyicide ve coverslips ultrasaf H2O 3 kez ile durulayın.</li>
		<li>30 dakika ve 1 M potasyum hidroksit (KOH) için solüsyon içeren temizleyicide ve coverslips ultrasaf H2O 3 kez ile durulayın. Etanol ve KOH sonication bir kez yineleyin.</li>
		<li>Aseton ile 30 dakika boyunca solüsyon içeren temizleyicide ve ultrasaf H2ile O iyice durulayın (en az 3 kez). Not: zaman (aseton gibi) organik çözücü yanlışlıkla piranha çözüm ile karışık bir patlama neden olabilir çünkü aseton iyice ultrasaf H2ile O, durulama tarafından kaldırılması gerekir14.</li>
		<li>Coverslips piranha çözüm yerleştirin (3:1 karışımı H2SO4 ve % 30 H2O2) ve 1 h için 95 ° C'de kuluçkaya. Not: Son derece enerjik ve aşındırıcı Piranha çözüm, çok dikkatli kullanın. Piranha çözüm hazırlanırken, 50 mL H2O2 önce 500 mL Cam kabı ekleyin ve H2150 mL kadar ekleyin4 kabı içine yavaş yavaş.</li>
		<li>Ultrasaf H2O ile coverslips 5 kere yıkayın. O zaman her coverslip ultrasaf H2O iyice ultrasaf H2ile O dolu 3 şişeler kullanarak ile yıkayıp kağıt coverslip kenarından kullanarak coverslip kurulayın. Coverslip iyice 110 ° C fırında 30 dakika boyunca kuru ve coverslip boyama kavanoza yerleştirin.<ol>
<li>Metanol ile coverslip durulama ve tekrar coverslip iyice kurumasını 110 ° C fırın boyama kavanoz yerleştirin. Not: bir kez o su19huzurunda APTES çok olası yüzey yapıların olduğundan iyice coverslip kurutma çok önemlidir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip functionalization<ol>
<li>70 mL silane çözeltisi ekleyin (%93 metanol, %5 asetik ve % 2 APTES) her kavanoza vida kapağı ve oda sıcaklığında kavanoz gece bırakın.</li>
		<li>Yıkama ve coverslips iyice fırına yerleştirerek yerine azot gazı kullanarak coverslips kuru dışında 3.1.5. adımda açıklandığı gibi kuru.</li>
		<li>150 mg mPEG (metoksi-Polietilen glikol) ve 6 mg biotin-PEG (biotin-Polietilen glikol) iyice 1 mL 0.1 M taze yapılmış NaHCO3 (pH 8.2) geçiyoruz. Sonra santrifüj 17, 000 x g çözünmez mandal kaldırmak 1 dk için. Not: Taze yapılmış NaHCO3 hazırdır; Onun pH ayarlamak için gerek yoktur.</li>
		<li>Silanized coverslips kutularına yerleştirmeniz ve iki küçük coverslips iki ucu silanized coverslips üst kısmında koymak. Silanized coverslip ortasına PEG çözeltinin 100 µL pipet ve başka bir silanized coverslip üstüne yerleştirin.</li>
		<li>Bazı ultrasaf H2O nemli tutmak için kutusuna ekleyin ve coverslips PEG çözüm için en az 3 saat içinde belgili tanımlık karanlık ile kuluçkaya. Bir gecede kuluçka de çalışabilirsiniz.</li>
		<li>Coverslip çiftleri ayırmak ve functionalized yüzey yüz tutmak, ultrasaf H2O yoğun olarak kullanarak coverslips durulayın ve azot gazı ile Kuru onları.</li>
		<li>Coverslips birinde bir marker kalem, functionalized yan yüzleri yukarıya, onları kutularına yerleştirmeniz ve kutuları vakum desiccator 1 ay için stok tutma kullanarak köşeleri functionalized tarafında işaretleyin.</li>
		<li>Coverslips daha uzun süre saklamak için bir coverslip onun kap üzerinde bir delik delinmiş bir 50 mL tüp içine koyun sonra tüp Plastik bir torbaya koyun ve bir vakum mühürleyen kullanarak torba mühür. Bu şekilde, coverslips-20 ° C'de yaklaşık 3 ay depolanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. akış hücre derleme
<ol><li>Çift taraflı bant (30 mm × 12 mm) bir zımba kullanarak bir parçası merkezinde 15 mm × 2 mm kanal kesti.</li>
	<li>Çift taraflı bant kağıt yan soyma ve iki deliği olan cam slaytta yapıştırın. Hava kabarcıkları kaldırmak için tuşuna basın. Bizim deneyime dayalı, Çift taraflı bant plastik yan daha kağıt tarafı kapalı soyulması tarafından hava kabarcıkları kaldırmak kolaydır.</li>
	<li>Functionalized coverslip (60 mm × 24 mm) dört kesilmiş elmas uçlu cam kullanarak parçaları (30 mm × 12 mm) scribe ve azot gazı kullanarak enkaz kaldırmak. Functionalized tutmayı unutmayın yan yüzleri yukarıya.</li>
	<li>Çift taraflı bant plastik yan soyma ve slayt üzerinde functionalized coverslip yapıştırın. Hava kabarcıkları coverslip ve bandı arasında kaldırmak için hafifçe bastırın. Hava kabarcıkları iyice kaldırma akışı hücre arabellekleri içine pompalanır iken sızıntı koruyabilirsiniz.</li>
	<li>Giriş ve çıkış boru sırasıyla küçük ve büyük deliklere yerleştirin. Epoksi kullanarak boru tamir.</li>
	<li>Streptavidin (0.2 mg/mL) 20 µL el ile kullanarak akış hücre pompa ve RT kuluçkaya 10 dakikadır. O zaman değiştirmek streptavidin için akış hücreye engelleme arabellek10 pompa ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
</ol>5. tek molekül görselleştirme
<ol><li>Kırmızı ve far-red ile A5 floresans mikroskobu testi slayt #1 üzerinde odak hizalamasını 532 nm lazer ve 640 nm lazer kullanarak eşzamanlı uyarma tarafından elde etmek. (Bkz: Malzemeler tablo) optik bölme ile çift dalga boyu görüntüleri üretmek.</li>
	<li>Akış mikroskobunun yerleştirin ve bir uzun boru ile bir otomatik infüzyon/para çekme programlanabilir pompa yüklü bir 10 mL bahar bağlantı onun çıkış boru bağlayın. Not: arabellekleri arabelleği akış hücre giriş boru döşeme için şırınga çekilmesi anlamına gelir aşağıda belirtilen akış hücre içine pompalıyor.</li>
	<li>Engelleme arabellek 500 µL/dak hızlı bir şekilde hava kaldırmak ve akış hücre arabellekte engellenmemiş olduğundan emin olun akış hücreye pompa. O zaman engelleme arabellek 200 µL/dak akış hücre pompa ve hava kabarcıkları giriş boru ve akış hücre iyice kaldırmak için çıkış boru ters çevirin. Not: tüm arabellekleri akışı hücre pompalanan bir vakum desiccator en az 15 dakika kullanmadan önce degassed.</li>
	<li>Biotinylated λ-ARS317 DNA'ın 0.5 µL engelleme arabellek 80 µL ekleyin ve 25 µL/min 2 min için akış hücre içine pompa. O zaman engelleme arabelleği 200 µL 50 µL/dk hızında çalıştırarak λ-ARS317 DNA sifonu çek.</li>
	<li>Engelleme arabelleği akış hücreye kaldırmak için 50 µL/dk hızında arabellek10 Binding 200 µL pompa.</li>
	<li>Streptavidin kaplı Qdot705 (1 µM) 0.2 µL ekleyin ve biotinylated ork 0.2 µL (1.2 µM) içine bir tüp ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya. O zaman tampon tüp içine bağlama 20 µL ekleyin ve buz üzerinde yerleştirin. Ork-Qdot705 son konsantrasyonu yaklaşık 10 olduğunu nM.</li>
	<li>Ork-Qdot705 2 µL ekleyin (10 nM), DTT (100 mM), ATP (200 mM) 1 µL bağlama arabellek 96 µL içine 1 µL. Ork-Qdot705 son konsantrasyonu 0,2 olduğunu nM.</li>
	<li>0.2 nM ORC-Qdot705 20 µL 10 µL/dk hızında akış hücre pompa. Bağlama arabellek 200 µL 100 µL/dk hızında çalıştırarak aşırı ORC-Qdot705 , dışarı floş. Sonra pompa bağlama arabellek ile 30 nM SYTOX portakal akış hücresine DNA yüzeylerde 100 µL/dk hızında leke.</li>
	<li>Ork-Qdot705 sinyal heyecanlandıracak ve SYTOX turuncu bir 405 nm lazer ve 532 nm lazer, sırasıyla kullanarak DNA sinyali lekeli. Sinyalleri aynı anda bir avlu-şerit bant filtre (FF01-446/510/581/703-25) kullanarak 100 µL/dak akışı ile işlevlerini izlemek ve kaydetmek çerçeve başına 100 ms tarafından EM-CCD görüntülerle. 20 görüntü yığınları farklı alanlardan toplamak.</li>
</ol>6. veri analizi
<ol><li>Dr. Ron veren laboratuar Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco tarafından geliştirilen resim tapa (OI_cut_RGBmerge) kendimizi tarafından değiştirilir yeni bir eklenti ile Fiji yazılım kullanarak görüntüleri dayalı ürün.<ol>
<li>Bir yığın görüntüleri (512 × 512 piksel) görüntüleri (256 × 256 piksel) iki yığınları kırpma. Biri bir 532 nm lazer heyecan verici sonuç, ve diğeri de bir 405 nm lazer heyecan verici sonuç.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiji-görüntü-yığınlar-Z project (ortalama yoğunluğu) kullanarak 61 sıralı görüntüleri işlemek.</li>
	<li>Ölçü DNA (LDNA) ve DNA'ın ORC-Qdot705 (LORC) bağlama DNA üzerinde sitesinden Uzaklik uzunluğu son el ile gergin.</li>
	<li>LORC/LDNA sonucunu hesaplamak kullanarak excel, r, önyükleme yöntemini kullanarak verileri analiz sonra çubuk grafik oluşturmak ve Gauss dağıtımları uygun.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase.">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+transcriptional+bursting+in+bacteria.">Mechanism of transcriptional bursting in bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li><li>Wegner, K. D., Hildebrandt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots:+bright+and+versatile+in+vitro+and+in+vivo+fluorescence+imaging+biosensors.">Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+molecular+and+cellular+imaging+with+quantum+dots.">In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots.</a> Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62 (2014).</li><li>Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+FtsK+translocation+reveals+mechanistic+features+of+protein-protein+collisions+on+DNA.">Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA.</a> Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).</li><li>Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+atomic+force+microscopy+of+a+DNA+repair+protein+conjugated+to+a+quantum+dot.">Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot.</a> Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).</li><li>Redding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+and+processing+of+foreign+DNA+by+the+Escherichia+coli+CRISPR-Cas+system.">Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (4), 854-865 (2015).</li><li>Xue, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Biotinylated+Proteins+Expressed+in+Yeast+to+Visualize+DNA-Protein+Interactions+at+the+Single-Molecule+Level.">Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level.</a> Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).</li><li>Duzdevich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+eukaryotic+replication+initiation:+origin+specificity,+licensing,+and+firing+at+the+single-molecule+level.">The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level.</a> Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).</li><li>Hughes, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+imaging+reveals+a+direct+interaction+between+UvrC+and+UvrB+on+DNA+tightropes.">Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes.</a> Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).</li><li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins.">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Passivation+for+Single-molecule+Protein+Studies.">Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li><li>Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single-molecule+approach+to+visualize+the+nucleosome+assembly+in+yeast+nucleoplasmic+extracts.">Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts.</a> Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).</li><li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts.">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57 (2), 179-186 (2012).</li><li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy.">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).</li><li>Lockett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+&#955;+DNA+purification+procedure+suitable+for+the+analysis+of+DNA+from+either+large+or+multiple+small+lysates.">A bacteriophage &#955; DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates.</a> Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).</li><li>Smith, E. A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prevent+the+loss+of+surface+functionality+derived+from+aminosilanes.">How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes.</a> Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).</li><li>Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+modification+of+&#955;-DNA+substrates+for+single-molecule+studies.">Efficient modification of &#955;-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, Qdot etiketli protein ve TIRFM akışı hücrede kullanarak site-specifically değiştirilmiş λ DNA arasındaki etkileşim gözlemlemek için bir protokol mevcut. Gerekli adımlar DNA substrat, DNA biotinylation, coverslip temizlik ve functionalization, hücre içi akış hazırlama ve tek molekül görüntüleme siteye özgü bir değişiklik içerir. Unutulmamalıdır iki anahtar nokta vardır. Yukarı ve aşağı üst üste pipetting karıştırma kaçınarak ilk olarak, tüm λ DNA ile ilgili adımlar yava?...

Protein ve DNA arasındaki etkileşimler DNA ikileşmesi, DNA tamiri ve transkripsiyon gibi birçok karmaşık biyolojik süreçler için gereklidir. Her ne kadar geleneksel yaklaşımlar özellikleri bu süreçlerin ışık, birçok anahtar mekanizmaları hala pek açık değildir. Son zamanlarda, hızla gelişen tek molekül teknikleri ile bazı mekanizmalar ele1,2,3olmuştur.
Protein-DNA etkileşimleri gerçek zamanlı olarak esas olarak görüntülenmesi üzerinde tek molekül floresans mikroskobu uygulanması floresans algılama ve floresan problar gelişimi üzerinde bağlıdır. Bir tek molekül çalışma için beri floresans algılama sistemleri çoğunlukla ticari olarak mevcuttur faiz protein ile uygun bir floresan probe etiketlemek önemlidir.
Floresan Proteinlerin moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılır. Ancak, düşük floresan parlaklık ve istikrar photobleaching karşı birçok tek molekül deneyleri kendi uygulamasında kısıtlayın. Kuantum nokta (Qdots) olan küçük ışık yayan nano tanecikleri4. Nedeniyle benzersiz optik özellikleri, Qdots 10 - 20 kat daha parlak ve5birkaç bin kere daha istikrarlı daha yaygın olarak kullanılan organik boya. Ayrıca, Qdots bir büyük Stokes kayması (uyarma ve emisyon doruklarına konumunu arasındaki fark)5var. Niceliksel deneyleri kullanılan olamaz böylece, Qdots uzun süre gözlem (dakika saat) ve yüksek sinyal gürültü oranı, görüntülerle edinimi için kullanılabilir.
Bugüne kadar Qdots bir hedef proteini site-specifically etiketlemek için iki yaklaşım vardır: birincil veya ikincil antikorlar Qdot Birleşik6,7,8; yardımı ile etiketleme ya da güçlü etkileşim arasında biotin streptavidin9,10,11,12,ve13temel hedef protein Qdots ile doğrudan, etiketleme. Streptavidin kaplı Qdots ticari olarak kullanılabilir. Bizim son çalışmada, site-specifically co-overexpression BirA ve AVI öğesini proteinler tarafından biotinylated proteinleri mayası yüksek verimlilik ile saf vivo içinde10. Aşağıda ve tek molekül deneyleri14,15,16,17en iyi duruma getirme, biz tek molekül düzey kullanarak Qdot etiketli proteinler ve DNA arasındaki etkileşimler gözlenen TIRFM10.
Burada, tomurcuklanma seçtiğiniz ilgi bizim protein özellikle tanımak ve bağlama özerk Çoğaltma sırası (ARS), kökeni tanıma karmaşık (ork), Maya. Aşağıdaki iletişim kuralı TIRFM kullanarak Qdot etiketli ORC ARS ile etkileşim görselleştirmenin adım adım bir yordam sunar. Site-specifically değiştirilmiş DNA substrat, DNA biotinylation, coverslip temizlik ve functionalization, akış hücreli montaj ve tek molekül görüntüleme hazırlanması açıklanmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3011</td>
			<td>Store 25 &#956;L aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-fusion cloning kit</td>
			<td>Biotool</td>
			<td>B22611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPlax Lambda 
			Packaging Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5110</td>
			<td>Bacterial strain LE392MP 
			is included in this package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10013092</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Beijing Chemical works</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10012818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Beijing Chemical works</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ-amine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J853-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22090-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring apparatus</td>
			<td>IKA</td>
			<td>KMO2 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122151</td>
			<td>15 mL, sterile, bulk, 500pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R4875-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5319-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0706-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated primers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22266882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10009259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>306568-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>80120891</td>
			<td>sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10011218</td>
			<td>30% Hydrogen peroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG 
			(methoxy-polyethylene glycol)</td>
			<td>Lysan</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-PEG 
			(biotin-polyethylene glycol)</td>
			<td>Lysan</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>IPC250-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum sealer</td>
			<td>MAGIC SEAL</td>
			<td>WP300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped glass scribe</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>70036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet tubing</td>
			<td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing</td>
			<td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td>
			<td>BB31695-PE/4</td>
			<td>inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL620001-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>LEAFTOP</td>
			<td>9005</td>
			<td>five minutes epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion/withdrawal 
			programmable pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Sapphire-532-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>640 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS-640-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Imaging 
			splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu photonics K.K.</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF illumination system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX2-RFAEVA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60&#215;TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>APON60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-edge laser dichroic 
			beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di01-R405/488/ 
			532/635-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-446/510/ 
			581/703-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF649-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET585/65m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET665lp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F36909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot705 Streptavidin Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q10163MP</td>
			<td>Store at 4 &#186;C, do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0220-25G</td>
			<td>Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 &#956;L aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M109-5G</td>
			<td>Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 &#956;l aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified &#955; dna at the single molecule level

Floresans mikroskobu karmaşık biyolojik süreçlerin tek molekül düzeyinde mekanizmaları dissekan harika katkılar yaptı. DNA-protein etkileşimleri çalışmak için tek molekül deneyleri içinde değerlendirilmesi için iki önemli etken vardır: DNA substrat kolay gözlem ve bir protein ile uygun bir floresan probe etiketleme için yeterli uzunlukta. 48,5 kb λ DNA DNA substrat için iyi bir adaydır. Kuantum nokta (Qdots), uzun süre gözlem (dakika saat) ve yüksek kaliteli resim alma floresan problar, bir sınıf olarak izin verir. Bu yazıda, biz DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA hazırlama ve streptavidin kaplı Qdots bir hedef proteini etiketleme içerir tek molekül düzeyinde eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Kavram kanıtı için ORC (kökenli tanıma karmaşık) içinde mayası faiz bir protein seçin ve TIRFM kullanarak bir ARS (özerk Çoğaltma sırası) ile etkileşimi görselleştirin. Diğer Floresan problar ile karşılaştırıldığında, Qdots ise tek molekül çalışmaları nedeniyle yüksek istikrarı photobleaching karşı bariz avantajı var, ama bu özellik nicel deneyleri kendi uygulamasında sınırlar unutulmamalıdır.

Qdot etiketli ORC ve ARS arasındaki etkileşimi görselleştirmek için ilk λ-ARS317 DNA substrat inşa. ARS317 içeren bir DNA parçası entegre edildi Xhoı (33,5 kb) yerel λ DNA'sı Homolog rekombinasyon (Şekil 1A) tarafından site. Rekombinasyon ürün özleri kullanılarak paketlenmiştir ve paketlenmiş fajının parçacıklar (Şekil 1B) LB tabaklarda kültürlü. Pozitif fajının plak PCR tarafından ekranl?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified ÃŽÂ» DNA at the Single Molecule Level at JoVE.com

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

JoVE Journal

Biology

7.5K Görüntüleme.  Chinese Academy of Sciences. Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified λ DNA at the Single Molecule Level

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biyoloji

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Tek Çekirdek Düzeyde HAT-1 Retrotransposition Analizi

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...