Dr. Hasan Yardimci teşekkür ediyoruz ve Dr.Sevim Yardimci Francis Crick Enstitüsü tarz için Dr Yujie güneş Pekin Üniversitesi ve Dr Chunlai Chen, Dr. Daniel Duzdevich, Columbia Üniversitesi, Dr Eric C. Greene'in laboratuarından tek molekül denemelerinde yardımcı Tsinghua Üniversitesi yararlı tartışma için. Bu çalışmada, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin 31371264, 31401059, CAS disiplinler arası yenilik takım ve Newton gelişmiş Bursu (NA140085) Royal Society tarafından desteklenmiştir.

1. λ-ARS317 DNA substrat hazırlanması
<ol><li>DNA substrat İnşaat ve ambalaj<ol>
<li>Xhokullanarak yerel λ DNA sindirmek ben enzim; tomurcuklanma genomik DNA ARS317 Maya 20 içeren primerler kullanılarak 543 bir bp DNA parçası taşıyan yükseltmek bp homolog dizileri akış yukarı ve aşağı Xhoben lambda DNA enzim ücreti. 100 Ekle ng Xhoλ DNA ve 10 sindirilmiş ng DNA parçası Homolog rekombinasyon tepki sisteminin 10 µL ve tepki için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Rekombinasyon λ DNA paketlemek için 25 µL lambda ambalaj özler rekombinasyon ürün içine ekleyin ve tepki için 90 dk 30 ° C'de kuluçkaya. Sonra bir ek 25 µL lambda ambalaj özler tepki tüp içine ekleyin. 90 dk 30 ° C'de tepki kuluçkaya devam'i tıklatın.</li>
		<li>Steril seyreltme arabelleği (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) 500 µL reaksiyon sistemine ekleyin ve karışımı yavaşça baş aşağı birkaç kez tüp çevirerek. Kloroform 25 µL eklemek, karışımı yavaşça ve 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>Paketlenmiş fajının 100 µL ve bakteri LE392MP 100 µL ekleyin (0,8 - kültürlü LB orta 10 mM ile MgSO4ekleme kullanarak 1.0) yeni bir tüp içine. 37 ° C'de 15 dakika boyunca kuluçkaya.</li>
		<li>4 mL oftop agar (LB orta + %0,7 agar + 10 mM MgSO448 ° C-soğutmalı,) içine 200 µL faj-bakteri karışımı ekleyin. Hemen yanında dönme tüp baş aşağı birkaç kez karıştırın ve önceden ısıtılmış (37 ° C) LB tabağa dökün.</li>
		<li>37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya ve PCR kullanarak ve sıralama λ-ARS317 plak ekran.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA substrat arıtma sıvı lysates11,18<ol>
<li>Steril GKD2O 10 mm MgCl2 ve 10 nM CaCl2200 µL bir plak seç. 200 µL bakteri LE392MP (LB orta kültürlü geceleme) ile karıştırın ve 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>NZCYM 100 mL faj-bakteri karışımı ekleyin (10 g/M NZ-Amin, 5 g/L maya ekstresi, 5 g/M NaCl, 1 g/L Casamino hidrolizat ve 2 g/L MgSO4·7H2O) orta ve kültür 37 ° C'de 7 h için Kloroform kültür içine 250 µL ekleyin ve başka bir 10 dakikadır sallamak.</li>
		<li>Kültür bir 200 mL şişe aktarın. NaCl (1 M son konsantrasyonu) 5,8 g ekleyin, el ile çözülmeye karıştırın ve 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>12.000 x g 4 ° C'de hücre artıkları kaldırmak için 10 dk de santrifüj kapasitesi. 200 mL şişe süpernatant toplamak ve8000 (m/V) % 10 PEG ekleyin. Manyetik karıştırma aparatı tarafından dağıtılması ve 30 dakika veya daha uzun buza kuluçkaya karıştırın.</li>
		<li>12.000 x g 10 dk 4 ° C'de bakteriyofaj çökelti, santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Çökelti fajının seyreltme arabellek 2 mL resuspend. 15 mL tüp içine aktarmak ve 10 µL RNase (son 20 µg/mL bölgedir) ve (son 5 µg/mL bölgedir) DNaz 40 µL ekleyin. 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>0,3 2 mL ekleyin M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + %1.25 SDS, 15 µL İndinavir K (son konsantrasyonu ise 10 µg/mL). 10 dk 65 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Önceden soğutulmuş potasyum asetat (3 M, pH 4,8) 2 mL ekleyin ve buz için 10 dk metroyla kuluçkaya.</li>
		<li>8000 x g 4 ° C'de çözünmez malzemeleri kaldırmak için 10 dk de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>İsopropanol 0.7 x hacmi süpernatant ekleyin. Baş aşağı birkaç kez tüp çevirerek mix ve oda sıcaklığında (RT) 2 min için kuluçkaya.</li>
		<li>RT DNA çökelti, 10 min için 8000 x g, santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırın.</li>
		<li>% 70 ile etanol tarafından Santrifüjü 8.000 x g 10 dakika süreyle de kaldırdıktan sonra süpernatant DNA yıkayın.</li>
		<li>Yavaşça 500 µL TE tampon (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) kullanarak DNA elute ve DNA 1,5 mL tüp içine aktarın.</li>
		<li>İki kez fenol kullanarak DNA ayıklamak: kloroform Santrifüjü 10 min için 8000 g de tarafından.</li>
		<li>0.7 x birim isopropanol ile çökelti. Ters tüp yavaşça aşağı ve 8.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi dönüm tarafından karıştırın.</li>
		<li>Bir kez % 70 etanol ile yıkayın, TE 200 µL içinde resuspend. DNA toplama ölçmek ve 12.5 µg aliquots-20 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
<ol><li>Biotinylated oligonucleotides fazdan için (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotin-3') yerli sol sonuna tamamlayıcı λ DNA, eklemek 1 µL (100 µM) oligonucleotides, GKD2O, 1 µL 10 ligaz arabellek x 7,5 µL ve T4 PNK 0.5 µL. Tepki 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>1 µL T4 PNK ve GKD2O toplam hacmiyle 30 µL. λ-ARS317 fazdan, λ-ARS317 12.5 µg, 10 ligaz arabellek x 3 µL eklemek için 3 h için 37 ° C'de tepki kuluçkaya.</li>
	<li>λ-ARS317 ile oligonucleotides tavlamak için fosforile oligonucleotides 0.5 µL, GKD2O, 10 × ligaz arabelleği fosforile λ-ARS317 tüp içine 25 µL 195 µL ekleyin. Tüp ters çevirerek karışımı yavaşça ve 65 ° c 5 dk. dönüş blok ısıtıcı ve izin 33 ° C blok aşağıda örnek soğumaya kapalı için kuluçkaya.</li>
	<li>λ-ARS317 ile oligonucleotides ligate T4 DNA ligaz 1 µL ve 0,63 µL ATP (200 mM) ekleyin. Tüp ters çevirerek karışımı yavaşça ve 2 saat veya 4 ° C için oda sıcaklığında gecede kuluçkaya. 4 ° C'de 1 ay için saklayın. Not: DNA'bozulmaması için karıştırma merdivenlerden yavaşça tüp baş aşağı pipetler kullanarak karıştırma yerine çevirerek yapılmalıdır.</li>
</ol>3. Coverslip temizlik ve Functionalization
<ol><li>Temizlik Coverslip<ol>
<li>Yer 20 coverslips 4 boyama kavanoz (5 coverslips/kavanoz), içine 30 dakika içinde etanol için solüsyon içeren temizleyicide ve coverslips ultrasaf H2O 3 kez ile durulayın.</li>
		<li>30 dakika ve 1 M potasyum hidroksit (KOH) için solüsyon içeren temizleyicide ve coverslips ultrasaf H2O 3 kez ile durulayın. Etanol ve KOH sonication bir kez yineleyin.</li>
		<li>Aseton ile 30 dakika boyunca solüsyon içeren temizleyicide ve ultrasaf H2ile O iyice durulayın (en az 3 kez). Not: zaman (aseton gibi) organik çözücü yanlışlıkla piranha çözüm ile karışık bir patlama neden olabilir çünkü aseton iyice ultrasaf H2ile O, durulama tarafından kaldırılması gerekir14.</li>
		<li>Coverslips piranha çözüm yerleştirin (3:1 karışımı H2SO4 ve % 30 H2O2) ve 1 h için 95 ° C'de kuluçkaya. Not: Son derece enerjik ve aşındırıcı Piranha çözüm, çok dikkatli kullanın. Piranha çözüm hazırlanırken, 50 mL H2O2 önce 500 mL Cam kabı ekleyin ve H2150 mL kadar ekleyin4 kabı içine yavaş yavaş.</li>
		<li>Ultrasaf H2O ile coverslips 5 kere yıkayın. O zaman her coverslip ultrasaf H2O iyice ultrasaf H2ile O dolu 3 şişeler kullanarak ile yıkayıp kağıt coverslip kenarından kullanarak coverslip kurulayın. Coverslip iyice 110 ° C fırında 30 dakika boyunca kuru ve coverslip boyama kavanoza yerleştirin.<ol>
<li>Metanol ile coverslip durulama ve tekrar coverslip iyice kurumasını 110 ° C fırın boyama kavanoz yerleştirin. Not: bir kez o su19huzurunda APTES çok olası yüzey yapıların olduğundan iyice coverslip kurutma çok önemlidir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip functionalization<ol>
<li>70 mL silane çözeltisi ekleyin (%93 metanol, %5 asetik ve % 2 APTES) her kavanoza vida kapağı ve oda sıcaklığında kavanoz gece bırakın.</li>
		<li>Yıkama ve coverslips iyice fırına yerleştirerek yerine azot gazı kullanarak coverslips kuru dışında 3.1.5. adımda açıklandığı gibi kuru.</li>
		<li>150 mg mPEG (metoksi-Polietilen glikol) ve 6 mg biotin-PEG (biotin-Polietilen glikol) iyice 1 mL 0.1 M taze yapılmış NaHCO3 (pH 8.2) geçiyoruz. Sonra santrifüj 17, 000 x g çözünmez mandal kaldırmak 1 dk için. Not: Taze yapılmış NaHCO3 hazırdır; Onun pH ayarlamak için gerek yoktur.</li>
		<li>Silanized coverslips kutularına yerleştirmeniz ve iki küçük coverslips iki ucu silanized coverslips üst kısmında koymak. Silanized coverslip ortasına PEG çözeltinin 100 µL pipet ve başka bir silanized coverslip üstüne yerleştirin.</li>
		<li>Bazı ultrasaf H2O nemli tutmak için kutusuna ekleyin ve coverslips PEG çözüm için en az 3 saat içinde belgili tanımlık karanlık ile kuluçkaya. Bir gecede kuluçka de çalışabilirsiniz.</li>
		<li>Coverslip çiftleri ayırmak ve functionalized yüzey yüz tutmak, ultrasaf H2O yoğun olarak kullanarak coverslips durulayın ve azot gazı ile Kuru onları.</li>
		<li>Coverslips birinde bir marker kalem, functionalized yan yüzleri yukarıya, onları kutularına yerleştirmeniz ve kutuları vakum desiccator 1 ay için stok tutma kullanarak köşeleri functionalized tarafında işaretleyin.</li>
		<li>Coverslips daha uzun süre saklamak için bir coverslip onun kap üzerinde bir delik delinmiş bir 50 mL tüp içine koyun sonra tüp Plastik bir torbaya koyun ve bir vakum mühürleyen kullanarak torba mühür. Bu şekilde, coverslips-20 ° C'de yaklaşık 3 ay depolanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. akış hücre derleme
<ol><li>Çift taraflı bant (30 mm × 12 mm) bir zımba kullanarak bir parçası merkezinde 15 mm × 2 mm kanal kesti.</li>
	<li>Çift taraflı bant kağıt yan soyma ve iki deliği olan cam slaytta yapıştırın. Hava kabarcıkları kaldırmak için tuşuna basın. Bizim deneyime dayalı, Çift taraflı bant plastik yan daha kağıt tarafı kapalı soyulması tarafından hava kabarcıkları kaldırmak kolaydır.</li>
	<li>Functionalized coverslip (60 mm × 24 mm) dört kesilmiş elmas uçlu cam kullanarak parçaları (30 mm × 12 mm) scribe ve azot gazı kullanarak enkaz kaldırmak. Functionalized tutmayı unutmayın yan yüzleri yukarıya.</li>
	<li>Çift taraflı bant plastik yan soyma ve slayt üzerinde functionalized coverslip yapıştırın. Hava kabarcıkları coverslip ve bandı arasında kaldırmak için hafifçe bastırın. Hava kabarcıkları iyice kaldırma akışı hücre arabellekleri içine pompalanır iken sızıntı koruyabilirsiniz.</li>
	<li>Giriş ve çıkış boru sırasıyla küçük ve büyük deliklere yerleştirin. Epoksi kullanarak boru tamir.</li>
	<li>Streptavidin (0.2 mg/mL) 20 µL el ile kullanarak akış hücre pompa ve RT kuluçkaya 10 dakikadır. O zaman değiştirmek streptavidin için akış hücreye engelleme arabellek10 pompa ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
</ol>5. tek molekül görselleştirme
<ol><li>Kırmızı ve far-red ile A5 floresans mikroskobu testi slayt #1 üzerinde odak hizalamasını 532 nm lazer ve 640 nm lazer kullanarak eşzamanlı uyarma tarafından elde etmek. (Bkz: Malzemeler tablo) optik bölme ile çift dalga boyu görüntüleri üretmek.</li>
	<li>Akış mikroskobunun yerleştirin ve bir uzun boru ile bir otomatik infüzyon/para çekme programlanabilir pompa yüklü bir 10 mL bahar bağlantı onun çıkış boru bağlayın. Not: arabellekleri arabelleği akış hücre giriş boru döşeme için şırınga çekilmesi anlamına gelir aşağıda belirtilen akış hücre içine pompalıyor.</li>
	<li>Engelleme arabellek 500 µL/dak hızlı bir şekilde hava kaldırmak ve akış hücre arabellekte engellenmemiş olduğundan emin olun akış hücreye pompa. O zaman engelleme arabellek 200 µL/dak akış hücre pompa ve hava kabarcıkları giriş boru ve akış hücre iyice kaldırmak için çıkış boru ters çevirin. Not: tüm arabellekleri akışı hücre pompalanan bir vakum desiccator en az 15 dakika kullanmadan önce degassed.</li>
	<li>Biotinylated λ-ARS317 DNA'ın 0.5 µL engelleme arabellek 80 µL ekleyin ve 25 µL/min 2 min için akış hücre içine pompa. O zaman engelleme arabelleği 200 µL 50 µL/dk hızında çalıştırarak λ-ARS317 DNA sifonu çek.</li>
	<li>Engelleme arabelleği akış hücreye kaldırmak için 50 µL/dk hızında arabellek10 Binding 200 µL pompa.</li>
	<li>Streptavidin kaplı Qdot705 (1 µM) 0.2 µL ekleyin ve biotinylated ork 0.2 µL (1.2 µM) içine bir tüp ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya. O zaman tampon tüp içine bağlama 20 µL ekleyin ve buz üzerinde yerleştirin. Ork-Qdot705 son konsantrasyonu yaklaşık 10 olduğunu nM.</li>
	<li>Ork-Qdot705 2 µL ekleyin (10 nM), DTT (100 mM), ATP (200 mM) 1 µL bağlama arabellek 96 µL içine 1 µL. Ork-Qdot705 son konsantrasyonu 0,2 olduğunu nM.</li>
	<li>0.2 nM ORC-Qdot705 20 µL 10 µL/dk hızında akış hücre pompa. Bağlama arabellek 200 µL 100 µL/dk hızında çalıştırarak aşırı ORC-Qdot705 , dışarı floş. Sonra pompa bağlama arabellek ile 30 nM SYTOX portakal akış hücresine DNA yüzeylerde 100 µL/dk hızında leke.</li>
	<li>Ork-Qdot705 sinyal heyecanlandıracak ve SYTOX turuncu bir 405 nm lazer ve 532 nm lazer, sırasıyla kullanarak DNA sinyali lekeli. Sinyalleri aynı anda bir avlu-şerit bant filtre (FF01-446/510/581/703-25) kullanarak 100 µL/dak akışı ile işlevlerini izlemek ve kaydetmek çerçeve başına 100 ms tarafından EM-CCD görüntülerle. 20 görüntü yığınları farklı alanlardan toplamak.</li>
</ol>6. veri analizi
<ol><li>Dr. Ron veren laboratuar Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco tarafından geliştirilen resim tapa (OI_cut_RGBmerge) kendimizi tarafından değiştirilir yeni bir eklenti ile Fiji yazılım kullanarak görüntüleri dayalı ürün.<ol>
<li>Bir yığın görüntüleri (512 × 512 piksel) görüntüleri (256 × 256 piksel) iki yığınları kırpma. Biri bir 532 nm lazer heyecan verici sonuç, ve diğeri de bir 405 nm lazer heyecan verici sonuç.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiji-görüntü-yığınlar-Z project (ortalama yoğunluğu) kullanarak 61 sıralı görüntüleri işlemek.</li>
	<li>Ölçü DNA (LDNA) ve DNA'ın ORC-Qdot705 (LORC) bağlama DNA üzerinde sitesinden Uzaklik uzunluğu son el ile gergin.</li>
	<li>LORC/LDNA sonucunu hesaplamak kullanarak excel, r, önyükleme yöntemini kullanarak verileri analiz sonra çubuk grafik oluşturmak ve Gauss dağıtımları uygun.</li>
</ol>

<ol><li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transcriptional+bursting+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transcriptional bursting in bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Wegner, K. D., Hildebrandt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots%3A+bright+and+versatile+in+vitro+and+in+vivo+fluorescence+imaging+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+molecular+and+cellular+imaging+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots.</a> Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62(2014).</li>
<li>Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+FtsK+translocation+reveals+mechanistic+features+of+protein-protein+collisions+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA.</a> Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).</li>
<li>Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+atomic+force+microscopy+of+a+DNA+repair+protein+conjugated+to+a+quantum+dot%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot.</a> Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).</li>
<li>Redding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+and+processing+of+foreign+DNA+by+the+Escherichia+coli+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (4), 854-865 (2015).</li>
<li>Xue, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Biotinylated+Proteins+Expressed+in+Yeast+to+Visualize+DNA-Protein+Interactions+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level.</a> Frontiers in microbiology. 8, 2062(2017).</li>
<li>Duzdevich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+eukaryotic+replication+initiation%3A+origin+specificity%2C+licensing%2C+and+firing+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level.</a> Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).</li>
<li>Hughes, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+imaging+reveals+a+direct+interaction+between+UvrC+and+UvrB+on+DNA+tightropes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes.</a> Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).</li>
<li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Passivation+for+Single-molecule+Protein+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li>
<li>Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095927317301020">Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts.</a> Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).</li>
<li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57 (2), 179-186 (2012).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).</li>
<li>Lockett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacteriophage+%CE%BB+DNA+purification+procedure+suitable+for+the+analysis+of+DNA+from+either+large+or+multiple+small+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates.</a> Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).</li>
<li>Smith, E. A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prevent+the+loss+of+surface+functionality+derived+from+aminosilanes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes.</a> Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+modification+of+%CE%BB-DNA+substrates+for+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, Qdot etiketli protein ve TIRFM akışı hücrede kullanarak site-specifically değiştirilmiş λ DNA arasındaki etkileşim gözlemlemek için bir protokol mevcut. Gerekli adımlar DNA substrat, DNA biotinylation, coverslip temizlik ve functionalization, hücre içi akış hazırlama ve tek molekül görüntüleme siteye özgü bir değişiklik içerir. Unutulmamalıdır iki anahtar nokta vardır. Yukarı ve aşağı üst üste pipetting karıştırma kaçınarak ilk olarak, tüm λ DNA ile ilgili adımlar yava?...

Protein ve DNA arasındaki etkileşimler DNA ikileşmesi, DNA tamiri ve transkripsiyon gibi birçok karmaşık biyolojik süreçler için gereklidir. Her ne kadar geleneksel yaklaşımlar özellikleri bu süreçlerin ışık, birçok anahtar mekanizmaları hala pek açık değildir. Son zamanlarda, hızla gelişen tek molekül teknikleri ile bazı mekanizmalar ele1,2,3olmuştur.
Protein-DNA etkileşimleri gerçek zamanlı olarak esas olarak görüntülenmesi üzerinde tek molekül floresans mikroskobu uygulanması floresans algılama ve floresan problar gelişimi üzerinde bağlıdır. Bir tek molekül çalışma için beri floresans algılama sistemleri çoğunlukla ticari olarak mevcuttur faiz protein ile uygun bir floresan probe etiketlemek önemlidir.
Floresan Proteinlerin moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılır. Ancak, düşük floresan parlaklık ve istikrar photobleaching karşı birçok tek molekül deneyleri kendi uygulamasında kısıtlayın. Kuantum nokta (Qdots) olan küçük ışık yayan nano tanecikleri4. Nedeniyle benzersiz optik özellikleri, Qdots 10 - 20 kat daha parlak ve5birkaç bin kere daha istikrarlı daha yaygın olarak kullanılan organik boya. Ayrıca, Qdots bir büyük Stokes kayması (uyarma ve emisyon doruklarına konumunu arasındaki fark)5var. Niceliksel deneyleri kullanılan olamaz böylece, Qdots uzun süre gözlem (dakika saat) ve yüksek sinyal gürültü oranı, görüntülerle edinimi için kullanılabilir.
Bugüne kadar Qdots bir hedef proteini site-specifically etiketlemek için iki yaklaşım vardır: birincil veya ikincil antikorlar Qdot Birleşik6,7,8; yardımı ile etiketleme ya da güçlü etkileşim arasında biotin streptavidin9,10,11,12,ve13temel hedef protein Qdots ile doğrudan, etiketleme. Streptavidin kaplı Qdots ticari olarak kullanılabilir. Bizim son çalışmada, site-specifically co-overexpression BirA ve AVI öğesini proteinler tarafından biotinylated proteinleri mayası yüksek verimlilik ile saf vivo içinde10. Aşağıda ve tek molekül deneyleri14,15,16,17en iyi duruma getirme, biz tek molekül düzey kullanarak Qdot etiketli proteinler ve DNA arasındaki etkileşimler gözlenen TIRFM10.
Burada, tomurcuklanma seçtiğiniz ilgi bizim protein özellikle tanımak ve bağlama özerk Çoğaltma sırası (ARS), kökeni tanıma karmaşık (ork), Maya. Aşağıdaki iletişim kuralı TIRFM kullanarak Qdot etiketli ORC ARS ile etkileşim görselleştirmenin adım adım bir yordam sunar. Site-specifically değiştirilmiş DNA substrat, DNA biotinylation, coverslip temizlik ve functionalization, akış hücreli montaj ve tek molekül görüntüleme hazırlanması açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011</td><td>Store 25 &amp;mu;L aliquots at -20 &amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;XhoI&lt;/em&gt; enzyme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0694</td><td></td></tr><tr><td>Quick-fusion cloning kit</td><td>Biotool</td><td>B22611</td><td></td></tr><tr><td>MaxPlax Lambda&lt;br/&gt; Packaging Extracts</td><td>Epicentre</td><td>MP5110</td><td>Bacterial strain LE392MP&lt;br/&gt; is included in this package.</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10013092</td><td>Any brand is acceptable.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Any brand is acceptable.</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Any brand is acceptable.</td></tr><tr><td>NZ-amine</td><td>Amresco</td><td>J853-250G</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Beyotime</td><td>ST483</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirring apparatus</td><td>IKA</td><td>KMO2 basic</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Eppendorf tube</td><td>Eppendorf</td><td>30122151</td><td>15 mL, sterile, bulk, 500pcs</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>SIGMA</td><td>D5319-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>0706-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22266882</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10009259</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306568-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>80120891</td><td>sulfuric acid</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10011218</td><td>30% Hydrogen peroxide</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-2L</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900798</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>mPEG&lt;br/&gt; (methoxy-polyethylene glycol)</td><td>Lysan</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>biotin-PEG&lt;br/&gt; (biotin-polyethylene glycol)</td><td>Lysan</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td><td>IPC250-1</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum sealer</td><td>MAGIC SEAL</td><td>WP300</td><td></td></tr><tr><td>Diamond-tipped glass scribe</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>70036</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Sail Brand</td><td>7101</td><td></td></tr><tr><td>Inlet tubing</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/2</td><td>inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.</td></tr><tr><td>Outlet tubing</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/4</td><td>inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.</td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL620001-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>LEAFTOP</td><td>9005</td><td>five minutes epoxy</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Infusion/withdrawal&lt;br/&gt; programmable pump</td><td>Harvard apparatus</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Coherent</td><td>Sapphire-532-50</td><td></td></tr><tr><td>640 nm laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS-640-100</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-BV</td><td></td></tr><tr><td>W-View Gemini Imaging&lt;br/&gt; splitting optics</td><td>Hamamatsu photonics K.K.</td><td>A12801-01</td><td></td></tr><tr><td>TIRF illumination system</td><td>Olympus</td><td>IX2-RFAEVA2</td><td></td></tr><tr><td>60&amp;times;TIRF objective</td><td>Olympus</td><td>APON60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Quad-edge laser dichroic&lt;br/&gt; beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>Di01-R405/488/&lt;br/&gt; 532/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Quad-band bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/&lt;br/&gt; 581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF649-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET585/65m</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET665lp</td><td></td></tr><tr><td>FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F36909</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Qdot&lt;sub&gt;705 &lt;/sub&gt;Streptavidin Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10163MP</td><td>Store at 4 &amp;ordm;C, do not freeze.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Amresco</td><td>0220-25G</td><td>Prepare 200 mM ATP solution, using ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, adjust pH to 7.0, and store 10 &amp;mu;L aliquots at -20 &amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Amresco</td><td>M109-5G</td><td>Prepare 1 M solution using ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, and store 10 &amp;mu;l aliquots at -20 &amp;ordm;C.</td></tr></tbody></table>

visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified &#955; dna at the single molecule level

Floresans mikroskobu karmaşık biyolojik süreçlerin tek molekül düzeyinde mekanizmaları dissekan harika katkılar yaptı. DNA-protein etkileşimleri çalışmak için tek molekül deneyleri içinde değerlendirilmesi için iki önemli etken vardır: DNA substrat kolay gözlem ve bir protein ile uygun bir floresan probe etiketleme için yeterli uzunlukta. 48,5 kb λ DNA DNA substrat için iyi bir adaydır. Kuantum nokta (Qdots), uzun süre gözlem (dakika saat) ve yüksek kaliteli resim alma floresan problar, bir sınıf olarak izin verir. Bu yazıda, biz DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA hazırlama ve streptavidin kaplı Qdots bir hedef proteini etiketleme içerir tek molekül düzeyinde eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Kavram kanıtı için ORC (kökenli tanıma karmaşık) içinde mayası faiz bir protein seçin ve TIRFM kullanarak bir ARS (özerk Çoğaltma sırası) ile etkileşimi görselleştirin. Diğer Floresan problar ile karşılaştırıldığında, Qdots ise tek molekül çalışmaları nedeniyle yüksek istikrarı photobleaching karşı bariz avantajı var, ama bu özellik nicel deneyleri kendi uygulamasında sınırlar unutulmamalıdır.

Qdot etiketli ORC ve ARS arasındaki etkileşimi görselleştirmek için ilk λ-ARS317 DNA substrat inşa. ARS317 içeren bir DNA parçası entegre edildi Xhoı (33,5 kb) yerel λ DNA'sı Homolog rekombinasyon (Şekil 1A) tarafından site. Rekombinasyon ürün özleri kullanılarak paketlenmiştir ve paketlenmiş fajının parçacıklar (Şekil 1B) LB tabaklarda kültürlü. Pozitif fajının plak PCR tarafından ekranl?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified Î» DNA at the Single Molecule Level at JoVE.com

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

JoVE Journal

Biology

7.5K Görüntüleme.  Chinese Academy of Sciences. Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified λ DNA at the Single Molecule Level

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Biyokimya

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Biyoloji

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Protein Etkileşimlerinin Canlı Hücre Tek Moleküllü Görüntüleme Tabanlı Miktar Tayini

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Yazar Spotlight: Canlı İnsan Hücrelerinde Protein-Kondensat Dinamiklerinin Değerlendirilmesi

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü