Bu proje hibe 1R03MH08127-01 ve NIH S. Li 7R03MH08127-02 tarafından desteklenen ve UAB Tıp Bölümü&#39;nden IMPACT fonları tarafından S. Li edildi. Molette Fonu ve Auburn Üniversitesi desteği takdir edilmektedir. Biz de işin sırasında Bayan Pulin Che ve Sayın Volodymyr Musiienko gelen teknik yardımların teşekkür ederim.

1.. Hücreler, virüs ve antiviral bileşikleri <ol><li> BSR hücreleri,% 5 fetal buzağı serumu (FCS) ihtiva eden bebek hamster böbrek bir türevi, Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (BHK) hücreleri, 10, (DMEM) korumak, 100U/ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin. </li><li> Üç analizi için,% 1 FCS, 100U/ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile DMEM içerisinde plaka hücreleri, 5, daha önce optimize edilmiş olarak. Bu ortam, her üç deneyleri için deney ortamı olarak adlandırılır. </li><li> % 5 CO2 ve% 80-95 nem ve 37 ° C&#39;de inkübatör içinde tüm hücreleri inkübe edin. </li><li> Plak-saflaştırılması ve daha önce tarif edildiği gibi, 8 tipi 10 BTV (BTV-10) yayılır. Her belirlenen deneyleri için deney ortamında BTV-10 seyreltin. </li><li> 10 mM&#39;lik bir konsantrasyon ile bir stok oluşturmak için DMSO içinde tüm test bileşikleri çözülür. -20 ° C&#39;de stokları Mağaza </li><li> Adayı için deney ortamı kullanılarak arzu edilen konsantrasyonlara bileşikler seyreltind deneyleri 2. </li></ol> 2. CTG Kiti kullanılması CPE temelli Assay <ol><li> MicroFlo seçme dağıtıcı aracılığıyla, bir 384 çukurlu mikrolevhanm (16 x 24 kadar bir biçimde siyah) içine tohum BSR hücreleri. Tohum yoğunluğu da 5000 hücre / ve tohumlama hacim antiviral etkinliği analizi için 20 ul. </li><li> Hücreler iyice plakasına yapışık gidene kadar 2-3 saat boyunca inkübe hücreleri. </li><li> Her bir oyuğa 10 uM bir nihai konsantrasyonuna sahip bir antiviral bileşiği ilave edin. Tamamen karıştırın. </li><li> İstenen bir tirenin BTV&#39;ye seyreltilir ve her bir oyuğa gösterilen MOI ile 5 ul BTV&#39;ye ekleyin. Kontrolü için iyi, tahlil medya 5 ul ekleyin. % 5 CO2 ve% 80-95 nem ve 37 ° C&#39;de 72 saat için enfekte olmuş hücreleri inkübe edin. </li><li> 72 HPI, çözülme ve kullanılmadan önce oda sıcaklığına CTG tampon ve liyofilize CTG tabakayı dengeye At. Th göre olan liyofilize enzim / alt-tabaka ve tampon reaktif karıştırılarak homojen CTG madde çözeltisini sulandırınE üreticinin talimatları. </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar deney plakaları dengelenmesi. </li><li> Bir dağıtıcı ile her bir kuyucuğa CTG reaktiflerin eşit bir hacmi (25 ul) ilave edin. Karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kuluçkaya bırakıldıktan sonra 0.1 saniye bir entegrasyon süresi ile, bir multi-mod okuyucusu kullanılarak ışık yayılması sinyalleri ölçer. </li></ol> 3. Doz-yanıt Deneyi <ol><li> Sırasıyla / oyuk anti-viral etkinliği tahlili için 20 ul ve sitotoksisite analizi için 25 ul bir hacim içinde ekim 5000 hücre bir çekirdek yoğunluğu olan bir dağıtıcı ile, (16 x 24 ile biçim siyah), bir 384-çukurlu Tohum BSR hücreleri . </li><li> % 5 CO2 ve% 80-95 kadar hücreleri nem, 37 ° C&#39;de 2-3 saat boyunca hücrelerin inkübe iyi levhaya eklenir. </li><li> Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, (bir 96-çukurlu plaka eşdeğeri), her bir bileşik için 384 oyuklu plakanın çeyrek bölgesinde işlem deneyi. Her bir konsantrasyon için sekiz çoğaltır tahsisTek bir deneyde gösterilebilir. Sadece bileşikler olmadan virüs ekleyerek negatif kontrol olarak bileşik ve virüs eklemeden Pozitif kontrol olarak, ilk sütun ve son kolon (12 th) düzenleme. </li><li> Deney ortamı içinde 50 uM bileşikleri seyreltilmiş ve 20 ul / oyuk anti-viral etkinlik tahlili için de, 2. sütuna ekleyin. 25 uM bir konsantrasyona kadar 8 kanallı yarı otomatik pipet kullanılarak bileşik beş kez karıştırın. </li><li> 8 kanallı yarı otomatik pipet kullanılarak, 12.5 uM bir konsantrasyon elde etmek için iyice karıştırın, bir sonraki sütuna (3.) 2 nci sütunda 20 | il karışımı aktarın. 6.25 uM&#39;lik bir konsantrasyon ile bir iki-kat seyreltme oluşturulması için bir sonraki sütuna (4.) 3 rd sütundan 20 ul karışım aktarılması ile bu işlemi tekrar edin. 11. sütun kadar bu iki kat seri seyreltme tekrarlayın. Aspire ve comp ekleme ve karıştırma sonrası 11. sütundaki karışımı 20 ul atmakound. </li><li> 5 ul / göz hacminde ile sütun 11 den sütun 2 her bir göze, BTV&#39;ye-10, 0.01, MOI göre ekleyin. Virüsü ilave edildikten sonra, her sütun içinde son bileşik konsantrasyonu olması gerekir: 2. sütunda 20 uM, sütun 3&#39;te 10 uM ve 0.04 uM&#39;lik nihai bir konsantrasyon ile sütun 11 aşağı iki kat seyreltme ile devam etti. </li><li> Sütun 1, orta ve 5 ul hücre yalnızca (pozitif) kontrol ve BTV enfeksiyon olarak kolon 12 BTV 5 ul / göz tek kontrol (negatif) elde edildi. </li><li> Sitotoksisite deneyi için 200 uM &#39;lik bir başlangıç ​​konsantrasyonuna bileşikleri seyreltin. Benzer şekilde, 100 uM bir konsantrasyona 8 kanallı yarı otomatik pipet ile sütun 2 ve karışık 5x 25 ul / kuyucuk bileşik ekleyin. BTV katmayın. </li><li> Komşu sütuna 3 sütun 2 25 ul aspire tarafından iki kat serisi seyreltme yürütmek ve son sütununda (12.) kadar devam etti. Kolon 12 de karıştırıldıktan sonra, aspirat ve m, 25 ul atmakkanşımı,. Sütun 2 de nihai konsantrasyon 100 uM olmalı ve 12. sütun 0.2 uM olmalıdır. Sütun 1, hücre tek kontrolüdür. </li><li> Her ikisi de anti-viral etkinliği ve sitotoksisite analizi için,% 5 CO2 ve 72 saat sonra muamele için% 80-95 nem ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. (Protokol 2,5-2,7 adım) yukarıda tarif edildiği gibi CTG kiti kullanılarak hücre canlılığı ölçülür. </li></ol> 4. Time-of-ilavesi (TOA) Deneyi <ol><li> 5000 hücre / oyuk bir dağıtıcı ve tohum hacmi ile 15 ul / oyuk olan, bir 384-çukurlu bir mikrolevhadaki sütun 1-24 (x 24, 16 ile biçim siyah) elde edilen tohumlar BSR hücreleri. </li><li> Her bir bileşik için, 384 oyuklu plakanın (Tablo 2) bir yarısında, her zaman noktası için sekiz kopyaları tüm yirmi dört sütun kullanır. 10 ul / oyuk deney ortamı ilave ederek hücreler sadece kontrol olarak sütun 1 atama. Mark sütun 24 5 ul / oyuk deney ortamı, bir ekleyerek BTV enfeksiyonu tek kontrol (negatif kontrol) ve25 ul / oyuk bir son hacme 0.01 MOl&#39;de d 5 ul / kuyu virüs. </li><li> Sütunda 2-22 farklı saat sonrası enfeksiyon (HPI) itibariyle antiviral etkinlik değerlendirme kolon, çift sayılı sütunları seçin. Bu sütunlar, 0.01 MOl&#39;de 5 ul / oyuk ile BTV hücreleri enfekte etmektedir. HPI farklı olarak, ayrıca 25 ul / lik nihai bir hacim oluşturmak üzere her bir oyuğa 5 ul / göz miktarında seyreltilmiş bileşik ekleyin. Için belirtilen -2 ve -1 HPI önce BTV olduğu enfeksiyona BSR hücreleri bileşik ekleyin. 0 HPI için, aynı anda kültüre bileşik ve BTV&#39;ye ekleyin. </li><li> Bileşiği, sadece kontrol olarak Buna paralel olarak, (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16 belirlenmiş bu bileşik, farklı zaman noktalarında ilave edildi, sütun 3-23 arasındaki tek sayılı sütun tayin 24, 48 HPI). Bu sütunlar, 5 ul / oyuk deney ortamı ilave edin ve 5 ul / göz de 25 ul / lik nihai bir hacim oluşturmak için bileşik seyreltilmiştir. </li><li> Tedaviden sonra, 37 ° C,% 5 CO2 ile% 80-95 nemde hücreleri inkübe. </li><li> Daha önce (protokol 2,5-2,7 adımları) tarif edildiği gibi CellTiter-Glo kiti kullanılarak 72 HPI hücre canlılığı belirler. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Çok modlu okuyucu yoluyla elde ışıldayan sinyallerine dayanan uygun içi yazılımı kullanarak önce tüm verileri işlemek. % 10 daha fazla bir değer gerektirir ortalama değeri (ortalama), her bir muamele için standart sapma (STDEV&#39;leri) yanı sıra katsayı varyasyonu (CV), belirler. </li><li> Bir biostatik ve grafik yazılım aracı için yukarıdaki yazılım işlenen verileri aktarın. EC 50 ve CC 50 değerlerini belirlemek için non-lineer regresyon analizi yürütmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph.">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus.">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341 (2012).</li><li>Meiswinkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2006+outbreak+of+bluetongue+in+northern+Europe--the+entomological+perspective.">The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective.</a> Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).</li><li>Szmaragd, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+and+case+fatality+during+the+recurrence+of+BTV-8+in+northern+Europe+in+2007.">Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007.</a> Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).</li><li>Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+and+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Bluetongue+virus.">Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus.</a> Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).</li><li>Noah, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+luminescence+assay+is+effective+for+high-throughput+screening+of+potential+influenza+antivirals.">A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals.</a> Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).</li><li>Che, P., Wang, L., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+optimization+and+validation+of+an+assay+for+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Dengue+virus.">The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).</li><li>Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+albopictus+inhibitor+of+apoptosis+1+gene+protects+vertebrate+cells+from+bluetongue+virus-induced+apoptosis.">The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis.</a> Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).</li><li>Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+MTT+and+ATP-based+assays+for+the+measurement+of+viable+cell+number.">Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number.</a> J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li><li>Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+human+rhinovirus+infectivity+cell-based+assay+for+identifying+antiviral+compounds.">Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds.</a> J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).</li><li>Harvey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+packaging+cell+line+for+production+of+flavivirus+replicon+particles.">Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles.</a> J. Virol. 78, 531-538 (2004).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triaryl+pyrazoline+compound+inhibits+flavivirus+RNA+replication.">Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+protection+against+the+highly+pathogenic+H5N1+influenza+virus+by+an+antisense+phosphorothioate+oligonucleotide.">In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide.</a> Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).</li><li>Ray, D., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+flavivirus+antiviral+drug+discovery+and+vaccine+development.">Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development.</a> Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+100,000-compound+library+for+inhibitors+of+influenza+A+virus+(H3N2).">High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2).</a> J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+high-throughput+screen+for+inhibitors+of+SARS+CoV+and+its+application+in+screening+of+a+100,000-compound+library.">Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library.</a> J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).</li><li>Bolken, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses.">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li><li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors.">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Antiviral hit ilk tanımlanması için, antiviral ilaç keşfi ve geliştirilmesi için önemli adımlardan biri, ölçülebilir bir işaretleyici seçerek basit bir protokol geliştirme, yeterli sinyalleri ve daha az 10% CV elde içeren, sağlam deneyleri geliştirmektir. En çok biyokimyasal veya hücre bazlı ekranlar nedeniyle tarama işleminde gerekli tekrarlanabilirlik ve taranması için moleküllerinin potansiyel olarak çok sayıda, en sağlam, basit ve ucuz bir deneyde, dayanan kimyasal bir başlangıç ​​...

BTV Orbivirüs soyu, Reoviridae ailesi içinde bir prototip çift sarmallı bir RNA virüsüdür. BTV çapında 1,2 3000000000 $ / yıl kaybı, koyun, keçi, sığır ve diğer evcil hayvanlar da dahil olmak üzere evcil hayvanların en önemli hastalıklar, biridir. Egzotik BTV serotipi listelenen önemli bir hayvan patojen olan &quot;USDA Ciddiyeti Yüksek Hayvancılık Patojenlerinin.&quot; Son zamanlarda, yeniden ortaya çıkan BTV Kuzey Avrupa&#39;da 3,4 genelinde birçok ülkede önemli bir sığırlarda hastalık salgını ve koyunları neden oldu. , Ekonomik önem taşıyan bir sonucu olarak ve bir model sistem olarak, BTV geniş, moleküler genetik ve yapısal çalışmaların konusu olmuştur ve çeşitli aşılar geliştirilmiştir. Ancak, antiviral ilaç keşfi için tahlillerin uygun olmaması nedeniyle, BTV karşı hiçbir antiviral vardır. Model sistem olarak BTV&#39;ye kullanarak yeni yüksek verimli tarama (HTS) kampanyası, biz d, eveloped optimize edilmiş ve Arbovirüsler 5 karşı potansiyel geniş spektrumlu antiviral belirlemek için bir CPE-bazlı analiz valide. CPE-tabanlı tahlil, hızlı ve gözlemlenebilir CPE / apoptoz 5-7 virüslerin neden olduğu bir dizi karşı antiviral ilaç keşfi kullanılmıştır iyi bilinen bir deneyidir. Bizim sistemde, post BTV enfeksiyon, CPE HeLa, DUY ve HEK 293T 8 dahil omurgalı hücrelerinde açıktır. BTV kaynaklı CPE CellTiter Glo hücre canlılığı reaktif kiti (CTG kit) 9 dahil olmak üzere çeşitli hücre canlılığı algılama yöntemleri kullanılarak izlenebilir ve nicelendirilebilir. Bu kit, metabolik olarak aktif canlı hücrelerin varlığını işaret eder hücresel ATP miktarının göre kültür içinde canlı hücre sayısını sunulmuştur belirler. Optimum şartlarda, burada sunulan CPE-bazlı analiz &quot;mix ve ölçmek&quot; bir adım protokol ve istikrarlı Işıklı sinyalleri ile esneklik ile fizibilite gösterdi. Bu arada, toksik bileşikler gdrmhücre canlılığı cing bu CPE bazlı deneyde dışı bırakılacaktır. CPE-bazlı analiz ile sağlamlık ve BTV karşı antiviral ilaç keşfi için güvenilirlik göstermiştir, ve potansiyel antiviral talebi bileşik (ler altı yeni kümesinin tanımlanması için yol NIH Molecular Kütüphane Küçük Molekül Depo (MLSMR) taranması için kullanılmıştır ) 5. Potansiyel antiviral bileşiği, CPE-bazlı analiz ile tespit edilmiştir, bu antiviral etkinliği ve sitotoksisite 2 aralığını belirlemek için on-konsantrasyon doz-yanıt deneyine tabi olması gerekir. Antiviral etkinlik,% 50 inhibe edici konsantrasyon (IC50) ya da% 50 etkili konsantrasyon (EC 50) olarak temsil edilen, esas-çizgi ve maksimum arasındaki virüs kaynaklı CPE yarım önleyen bir ilacın konsantrasyonudur. Antiviral sitotoksisitesi,% 50 sitotoksisite konsantrasyonu (CC 50), yani konsantrasyonudurtaban çizgisi ile en arasında sitotoksisitedeki% 50 uyaran bir ilacın. % 50 SI (SI 50) olarak ifade seçici endeksi (SI), virüs kaynaklı CPE karşı antiviral özgünlüğünü belirleyen CC 50 / IC50 hesaplanmaktadır. IC 50 (ya da EC 50), 50 CC ve SI değerleri, 50 bir antiviral bileşiği, kuvvetli ve daha fazla ilaç geliştirme için seçici olup olmadığını belirlemek için kritik ölçülerdir. Bir in vitro antiviral herhangi bir aşikar toksisite göstermiştir, ancak önlenebilir virüs CPE ve üretken viral yaşam döngüsü neden olduğunda, onun Moa 2 karakterize etmek için önemlidir. Biz antiviral etkilenen viral yaşam-döngüsü olası adım (lar) belirlemek ÖY tahlilini yaparak böyle karakterizasyonu başlattı. Genel olarak, antiviral bileşiği, farklı zamanlarda öncesi ya da sonrası virüs enfeksiyonu hücrelere ilave edildi. Antiviral enfekte hücrelere ilave edildi durumunda hedef s göndermekönceki aşamada ilave edildi birine göre tep enfeksiyonun seyri sırasında, daha düşük aktiviteye sebep olur. Bu nedenle, TOD çalışma ya da viral yaşam döngüsü ya da viral yaşam çevriminde yer alan ana makine üzerinde, bir bileşiğin anti-viral etkinlik ve potansiyel hedef belirlemek için çok önemlidir. Üç tahlilleri için, hücre canlılığı, üretici talimatlarına 5 ardından CTG kiti kullanılarak belirlenmiştir. Bu algılama sistemi çeşitli in-house yazılımı kullanılarak analiz edilebilir yeterli lüminesans sinyalleri verir. Her bir deney en az sekiz kopyaları ile üç nüsha olarak doğrulanmış ve uygulandı. Elde edilen tüm veriler için, ortalama değer (AVE), standart sapma (STDEV&#39;leri) ve varyasyon katsayısı (CV) olmak üzere üç parametre, tahlilin sağlamlığını belirlemek için analiz edilmiştir. Tahlilin sağlamlığı belirlendikten sonra, bundan başka, veri analizi ve grafik olarak ve çeşitli biyoistatistiksel kullanılarak çizilirc aletleri 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

BTV karşı potansiyel antiviral belirlemek için, biz geliştirdik optimize edilmiş ve burada sunulan üç deneyleri geçerliliği var. CPE-tabanlı tahlil, bir bileşiğin bir anti-viral etkinlik gösteren ve büyük bir bileşik librarisinin elenmesi için kullanılmıştır olup olmadığını değerlendirmek için geliştirilen ilk deney oldu. Bu arada, antiviral sitotoksisitesi da CPE temelli test kullanılarak değerlendirilebilir. Doz-yanıt deney seçilen antiviral etkinlik için aralığını belirlemek için dizayn edilmiştir,% 50 inhibitör konsantrasyonunu (IC50) ya da etkili bir konsantrasyonu (EC50), hem de sitotoksisite yelpazesini (CC 50), yani. ÖY tahlil BTV viral yaşam döngüsü veya ana hücresel makine üzerindeki olası etkisi sırasında yeni antiviral yatan mekanizmasını belirlemek için ilk MoA çalışma için kullanılmıştır. Bu deneyler, bir hücre kültürü sisteminde antiviral etkinliğinin değerlendirilmesi için çok önemli olan ve bizim yeni araştırmalara yol kullanılmaktadırBTV karşı yeni antiviral bir dizi tanımlanmasına ing.

1.. Bileşik Antiviral etkinliği Hücre bazlı CPE deneyi, geliştirilen en iyi ve daha önce tarif edildiği gibi 2,5 BTV karşı yeni antiviral belirlemek için ışık saçan tabanlı CTG kiti kullanılarak in vitro olarak doğrulanmıştır. On doz yanıt deney canlı hücreler 5,11 sunulan hücresel ATP miktarının göre kültür içinde metabolik olarak yaşayan hücrelerin sayısı ölçülerek belirlenmiş bir kurşun bileşiğinin antiviral etkinliği v...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus at JoVE.com

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Sitopatik etki (CPE)-bazlı analiz, doz-yanıt tahlil ve Time-of-adisyonu (TOA) deneyi de dahil olmak üzere üç deneyleri yanı sıra, gelişmiş optimize edilmiş, doğrulanmış ve Bluetongue virüsüne karşı yeni antiviraller (BTV) tanımlamak için kullanılmıştır yeni tespit antiviraller için olası Mekanizması-of-Eylem (MoA) belirlemek gibi.

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

assays-for-identification-novel-antivirals-against-bluetongue

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham.  Sitopatik etki (CPE)-bazlı analiz, doz-yanıt tahlil ve Time-of-adisyonu (TOA) deneyi de dahil olmak üzere üç deneyleri yanı sıra, gelişmiş optimize edilmiş, doğrulanmış ve Bluetongue virüsüne karşı yeni antiviraller (BTV) tanımlamak için kullanılmıştır yeni tespit antiviraller için olası Mekanizması-of-Eylem (MoA) belirlemek gibi. 

Video: Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Hepatit C Virüsü Karşı İnsan laktoferrinin Hücresel Alımı ve İlişkili Antiviral Aktivite Monitör İmmünofloresan

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

İnsan Nötrofil türetilmiş Dev Fagositler bir Roman ICSI&#39;nin Gelişimi ve Kimlik<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Kodlama ve RNA sınıfları kodlamayan teşhis kodu içinde domuz tam kan ifade.

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...